ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية

Summary

وقد تم تكييف هذه التقنية لتحليل مورفولوجيا CLEM التركيبية للأغشية، العضيات، والهياكل المتضررة من الجزيئات التحت خلوية microinjected. هذا الأسلوب يجمع بين تقنيات قوية من المجهرية / حقن مكروي، المجهري متحد البؤر الفلورسنت، والمجهر الإلكتروني للسماح للقرار نانومتر ملليمتر متعددة. هذه التقنية هي قابلة للطائفة واسعة من التطبيقات.

Abstract

الخلية حقيقية النواة تعتمد على التعقيد، درجة عالية من التنظيم، ومقصورات غشاء متميزة وظيفيا المنضم الذي الحفاظ على الاستقطاب البيوكيميائية اللازمة لوظيفة الخلوية المناسبة. فهم كيفية الانزيمات والبروتينات، ومكونات هيكل الخلية والحفاظ على هذا الحكم الفصل البيوكيميائية لذلك من أهمية قصوى. استخدام جزيئات الموسومة fluorescently في توطين و / أو حجرات التحت خلوية التشويش قد حقق ثروة من المعرفة وتقدم فهمنا لتنظيم الخلوية. تقنيات التصوير مثل المجهر الفلورسنت ومبائر جعل التحقق من موقف جزيء صغير الموسومة fluorescently مباشرة نسبيا، ومع ذلك يقتصر القرار هياكل صغيرة جدا ^1.

من ناحية أخرى، كشف المجهر الإلكتروني تفاصيل التشكل التحت خلوية بدقة عالية جدا، ولكن طبيعته ثابتة يجعل من الصعب قياس ديناميكية للغاية بروcesses بدقة ^2،3. وبالتالي، فإن الجمع بين المجهر الضوئي المجهر الإلكتروني مع لنفس العينة، ضوء مترابط ويسمى المجهر الإلكتروني (CLEM) ^4،5، يتيح مزايا التصوير فائق السرعة المزدوجة من الفلورسنت مع قرار عالية من المجهر الإلكتروني ^6. وقد تم تنفيذ هذه التقنية قوية لدراسة العديد من جوانب بيولوجيا الخلية ^5،7. منذ نشأتها، وقد زاد هذا الإجراء قدرتنا على التمييز بين الأشكال التضاريسية وأبنية التحت خلوية بدقة عالية.

هنا، نقدم طريقة مبسطة لأداء حقن مكروي السريع تليها CLEM (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا الإجراء حقن مكروي CLEM لإدخال كميات محددة من جزيئات صغيرة و / أو البروتينات مباشرة في السيتوبلازم الخلية حقيقية النواة ودراسة آثار من المليمتر لموضوع القرار نانومتر (الشكل 2). ويستند هذا الأسلوب على microinjectingالخلايا المزروعة في coverslips الزجاج المحفور بالليزر الشبكية الملصقة على الجزء السفلي من الخلية الحية والأطباق التصوير المجهري متحد البؤر مع كل من الفلورسنت والإلكترونات. ومما يسهل توطين الخلية (ق) من الفائدة من جانب نمط الشبكة، والتي يمكن نقلها بسهولة، جنبا إلى جنب مع خلايا الفائدة، إلى الراتنج EPON تستخدم لتجميد العينات وتقطيع قبل تحليل المجهر الإلكتروني (الشكل 3). تراكب الصور من الفلورسنت وEM يسمح للمستخدم لتحديد توطين التحت خلوية، فضلا عن أي تغيرات شكلية و / أو التركيبية الناجمة عن جزيء microinjected من الفائدة (الشكل 4). هذه التقنية هي قابلة للنقاط زمنية تتراوح بين 5 ق ≤ تصل إلى عدة ساعات، وهذا يتوقف على طبيعة العينة microinjected.

Protocol

1. خلية الثدييات الثقافة

1. الجرذ العادي الكلى (NRK)، خلد سرطان عنق الرحم (هيلا)، أو غيرها من الثدييات مناسبا خطوط الخلايا المستزرعة وعند 37 ° C، 5٪ CO _2، على coverslips الزجاج photoetched الشبكية اضافته للعيش الأطباق الخلية (انظر الجدول 1 أو لأي كاشف أجهزة المستخدمة في هذا البروتوكول) في DMEM FBS 10٪ + 1٪ و. القلم / بكتيريا وينبغي اتخاذ الاحتياطات للحفاظ على بيئة معقمة عند العمل مع مثقف خلايا الثدييات.
2. يجب اعتمادا على خط التجريبية في الوقت (0-5 ساعات مقابل 1-2 حقن آخر يوم) تعدل confluency من الخلايا إلى 50٪ ~ ~ أو 25٪، على التوالي.

2. حقن مكروي

1. إعداد البروتين المطلوب، DNA، أو الجزيئات الصغيرة في اختيارك للالعازلة، اعتمادا على قابليته لثقافة الخلوية، إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر ~. الفلورسنت الأصباغ خاملة مثل الأحمر أو الأزرق تتالي تكساستم تضمينها في النظام بمناسبة الخلايا microinjected؛ اختيار صبغة الفلورسنت الحقن والتحقيق يجب أن يكون الإثارة غير متداخلة وموجات الانبعاثات. وينبغي تحديد تركيز جزيء اهتمامك اللازمة لحقن مكروي تجريبيا، ويشيع استخدام الأصباغ الفلورية في تتبع 0،5-1،0 ملغ / مل. عادة، يتم إرفاق تساهميا رودامين أو fluorophore آخر لجزيء اهتمامك استخدام عدة التجارية، ويمكن استخدام طرق أخرى للكشف لكن اعتمادا على حساسية. لمزيد من المعلومات، راجع الاعتبارات الهامة أدناه.
2. تصفية injectant (~ 50 ميكرولتر) من خلال مرشح 0.22 ميكرون الطرد المركزي. ويفضل مرشحات الطرد المركزي أكثر من فراغ و / أو الترشيح حقنة التي ربطها حجم القتلى.
3. لتوليد إبرة حقن مكروي، يتم سحبها ماصات زجاجية البورسليكات باستخدام المشتعلة براون Micropipette بولير التالية مصنعين المبادئ التوجيهية. بدلا من ذلك، حقن مكرويويمكن شراء الإبر من الباعة بما في ذلك إيبندورف مما يجعل الإبر حقن مكروي femtotip.
4. ماصة بعناية 4 ميكرولتر من injectant في نهاية بدون تدخل من الإبرة حقن مكروي باستخدام إيبندورف 20 Femtotips. ضمان عدم وجود فقاعات موجودة داخل إبرة حقن مكروي سحبت. تحميل إبرة حقن مكروي في الذراع مياداة مجهرية من Injectman FemptoJet إيبندورف تعلق على مجهر مقلوب. لمراجعة جيدة لإجراء حقن مكروي، يتم توجيه القارئ إلى المادة السابقة مجلة التجارب تصور ^8.
5. وضع الخلية الحية طبق مع ساترة الشبكية والخلايا المستزرعة في حامل الطبق من المجهر المقلوب زايس. العثور على خلايا النمو ضمن شبكة photoetched ثم لاحظ معرف الأبجدية الرقمية الشبكات، سيتم استخدام هذا في جميع الخطوات اللاحقة. ومن الناحية المثالية، تحديد موقع الخلايا في وسط ساترة والخطوات اللاحقة سوف تحد في نقل العينة حواف ساترة.
6. انخفاض الذراع يدويا الحقن في مكان على ساترة، وباستخدام عصا التحكم مياداة مجهرية والضوابط، وانخفاض إبرة الحقن لأسفل حتى يلامس طرف بلطف سطح الخلايا المستزرعة والحد الصحافة "لمنع الحركة من الإبرة بعد هذه النقطة، وكسر بالتالي هشة سحبت الزجاج البورسليكات. يتم تنفيذ جميع الجوانب الأخرى لحقن مكروي الخلية وفقا إيبندورف FemtoJet دليل المستخدم InjectMan. تم استخدام تقنية حقن مكروي مؤخرا لفهم الفرد البروتينات الفوعة يفرز من البكتيريا ^9.
7. Microinject كل خلية أخرى في الشبكة المختارة. مع الخلايا نمت في confluency 50٪ ~، يمكن للمرء أن يتوقع ~ 80 خلية لكل 600 الشبكة ² ميكرومتر (على سبيل المثال هو مبين في الشكل. 3A). ولذلك، وبعد الكشف المجهري مضان والإلكترون، وسوف يكون هناك ن ~ التجريبية من 30-40 و الخلايا السيطرة.
8. وضع خلايا حية طبق مرة أخرى إلى الخلية الحاضنة الثدييات ثقافة المطلوبالوقت وفقا لما تمليه الإعداد التجريبية. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن الانتقال مباشرة من حقن مكروي لتحليل المجهر مرور الزمن في انتظار ظهور الهياكل التحت خلوية معينة من الفائدة قبل التثبيت.

3. المجهر الفلورسنت

1. إذا رغبت، الغناء في الحفلات الحية خلايا الوقت الفاصل بين قياسات مضان من الخلايا microinjected، وبعد ذلك، استبدال وسائل الإعلام مع غلوتارالدهيد 2.5٪ في 0.1 العازلة كاكوديلات M (درجة الحموضة 7.4) واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، إذا لم يكن حاجة الخلية الحية القياسات، تجاهل وسائل الإعلام نمو الخلايا وإصلاح الخلايا مع 5 مل الفورمالديهايد 3.7٪ في 1xPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تجاهل تثبيتي، ويستعاض عنها 1xPBS 5 مل، انتقل إلى الخطوة 3.2. ملاحظة: من المهم جدا عدم إضافة غلوتارالدهيد حتى بعد مضان المجهري كاملة.
2. وضع طبق الخلية الحية مع ساترة الموزعة في photoetched المجهر الفلورسنت (غير مطلوب مبائر لثيق الخطوة) وجمع حقل مشرق 5-10 والصور الفلورسنت من الشبكة المناسبة لتوثيق ترتيب الخلايا (الشكل 4A). تحديد تلك الخلايا التي تم microinjected باستخدام موجات الإثارة وانبعاث حقن الصبغة الخاملة (الشكل 4B). من المهم الحصول على الصور في تكبير مختلفة (على سبيل المثال 10X و65x) من أجل تسهيل تحديد الخلايا microinjected في الخطوات اللاحقة التي تشمل المجهر الإلكتروني.
3. باستخدام المجهر متحد البؤر الفلورسنت، وجمع Z-كومة من الخلايا microinjected ضمن الشبكة التي تم تحديدها في الخطوة 2.5 أعلاه. وهناك حاجة تضخم عالية (100X) من أجل ربط الصور الفلورسنت مع الهياكل التحت خلوية أنه سيتم تحديدها في المجهر الإلكتروني.
4. تتم إزالة coverslips من أسفل الخلية الحية الأطباق المتاحة تجاريا مع ساترة السائل إزالة الخلايا ووضعها على جانب طبق حتى في خلية ثقافة عذراء تحتوي على 5 مل1xPBS. تتم معالجة ثم ساترة للالمجهر الإلكتروني كما هو مفصل أدناه.

4. انتقال الكترون المجهر

1. استبدال 1xPBS العازلة مع 2 مل غلوتارالدهيد 2.5٪ في 0.1 العازلة كاكوديلات M (درجة الحموضة 7.4) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تعد الحضانة، في حين ليس من الضروري ذلك، تساعد في الحفاظ على الهياكل التحت خلوية. ملاحظة: الفورمالديهايد وحدها ليست كافية لEM مثبت التحليل.
2. إزالة الخلايا تثبيتي، وصمة عار مع إضافة 2 مل رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في 0.1 M كاكوديلات العازلة لمدة 30 دقيقة تليها ثلاث غسلات مع العازلة كاكوديلات وأخيرا استبدال جميع العازلة مع DDH ₂ O.
3. بعد البروتوكولات القياسية EM، يذوى العينة في سلسلة (70٪ إلى 100٪) متدرجة من الايثانول. إعداد EPON الراتنج وساترة مكان الخلية الجانب السلبي على رأس أنبوب الراتنج مليئة EPON. السماح للبلمرة 24 ساعة عند 60 ° C. عن طريق وضع ساترة photoetched الشبكية خلية جانب قيامWN على الراتنج EPON، يتم نقل كل من خلايا ذات الاهتمام فضلا عن نمط الشبكة إلى الراتنج EPON خلال البلمرة (على سبيل المثال هو مبين في الشكل. 3B).
4. إزالة coverslips من الراتنج EPON بغمر بسرعة إلى النيتروجين السائل و / أو الماء المغلي. تفقد سطح الراتنج تحت مجهر تشريح نطاق الشبكة لتحديد موقع من الفائدة (ملاحظة: سيتم نقل طقطق شبكة كصورة المرآة). باستخدام شفرة حلاقة معقمة، أو تقليم مشرط كتلة EPON أسفل بحيث فقط شبكة من الفائدة هو في ذروة كتلة الراتنج EPON.
5. باستخدام مشراح مستدق، واكتساب أقسام التسلسلي للكتلة قلص في سمك المطلوب (~ سمك نانومتر 70 لTEM التقليدية و~ سمك نانومتر 250 لتصوير الشعاعي الطبقي TEM). على النقيض المقاطع مع خلات الرصاص وسترات اليورانيل بعد البروتوكولات القياسية.

5. المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني

1. الانتقال خلايا مصلحة فيالمجهر الإلكتروني باستخدام الصور التي تم الحصول عليها في الخطوات السابقة. وقد تقع الخلايا microinjected مرة واحدة في المصالح، استخدام صور عالية الدقة لتحديد الفلورسنت مبائر المناطق داخل الخلية التي كانت في المصالح. صورة بدقة عالية هذه باستخدام TEM. استخدام المعالم مثل محيط الخلايا والمغلف النووية لتحديد أي الفلورسنت Z-مكدس الصورة يتوافق مع شريحة EM.
2. باستخدام برنامج التصوير من اختيارك (مثل J الصور، أدوبي فوتوشوب، وما إلى ذلك)، والحد من غموض الصورة الفلورية إلى 50٪ وتراكب وضعها على الصورة التي TEM مع يرتبط. محاذاة الصور عن طريق ضبط النطاق (تذكر لتقييد أبعاد) وتناوب صورة مبائر لتتناسب مع الصورة TEM. قد تعديلات دقيقة لالحدة والتباين وغيرها في الصورة الفلورية مساعدة في المحاذاة. ملاحظة: لقد وجدنا أن مغاير، المغلف النووية، ومحيط الخلية تمثل معالم ممتازة للمساعدةفي توجه الصورتين.

6. اعتبارات حاسمة

1. إلى حد كبير للمساعدة في العثور على جزيء حقن صغيرة، يمكن علامة الفلورسنت مثل رودامين أو فلوريسئين المرفقة تساهميا باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا. اكتساب معلومات إضافية بالإعراب عن ectopically لتوطين التحت خلوية الفلورسنت علامة البروتين قبل حقن مكروي. ومن ثم، واختيار fluorophores وخاملة صباغة حقن مكروي تتبع المهم.
2. اختيار الخلايا لحقن مكروي التي الانضمام بالقرب من مركز للساترة وتجنب اختيار الشبكة على مقربة من الحافة. وهذا سيشكل أكبر احتمال أن يتم نقل الخلايا التي تهم الراتنج EPON المستخدمة في المجهر الإلكتروني.
3. Confluency من الخلايا طالمهم، كما لوحة متموجة تماما سيجعل تحديد الخلايا microinjected في المجهر الالكتروني صعبة للغاية. بدلا من ذلك، خلايا البذور بحيث تصل إلى 50٪ ~ confluency في يوم تجربة قصيرة، أو ~ 25٪ confluency في يوم أطول (1-2 يوم) التجربة استخدام الموقف وشكل الخلايا وكذلك الفضاء "فارغة ومعالم لتوجيه صورة المجهر الإلكتروني.
4. وينبغي ضبطها مبائر سمك شريحة الضوئية لاحتياجات التجربة، وينبغي بالتالي أن تحدد تجريبيا ^10.
5. ينبغي أن الفورمالديهايد ومثبتات غلوتارالدهيد يكون على أعلى درجة من المتاحة. سوف الفورمالديهايد إصلاح الخلايا، ولكن الحفاظ على خصائص كل من مضان البروتينات والجزيئات الصغيرة الفلورية (مثل رودامين أو FITC). ومع ذلك، فإنه لا يحافظ على هياكل للسماح عالية EM القرار. غلوتارالدهيد يحفظ الأغشية والهياكل التحت خلوية إلى درجة عالية لEM analyالهيئة العامة للاستعلامات، ولكن تعوق بشكل كبير مضان. ولذلك، فإن تثبيت من خطوتين هو أمر حاسم لكلا مضان المجهري وEM. يمكن حذف خطوة تثبيت الفورمالديهايد إذا أداء الخلية الحية القياسات، كما لا يمكن أن يؤديها التثبيت النهائي عن طريق العلاج غلوتارالدهيد.

7. ممثل النتائج

يتيح هذا الإجراء القدرة على تقديم جزيء من مصلحة مباشرة في السيتوبلازم الخلوي ورصد حقيقية النواة التعريب و / أو تأثيرات على البنية الخلوية وorganeller من المليمتر لموضوع نانومتر القرار. ويرد توضيح تخطيطي لإعداد وإجراء التجارب في الشكل 2. هذه التقنية تعتمد على حقن مكروي من الخلايا نمت على الزجاج المحفور بالليزر ساترة الشبكية (الشكل 3A)، والتي بعد الفحص المجهري متحد البؤر، قادر على نقل كل من خلايا ذات الاهتمام فضلا عن نمط الشبكة إلى الراتنج EPON (الشكل3B).

A CLEM حقن مكروي نموذجية الإجراء ينتج الصور مضان وmicrographs الإلكترون، أنه عندما ترتبط، على حد سواء تسمح توطين التحت خلوية وتحليل التركيبية. ونمت الخلايا microinjected على ساترة الزجاج photoetched الشبكية مع جزيء من الفائدة بعد الصور التي يتم الحصول عليها الحقل مشرق (الشكل 4A). وهو مدرج على صبغ تتبع للتمييز الخلايا الخاملة microinjected من غير microinjected الخلايا (الشكل 4B). ويتم الحصول على مبائر Z-المداخن باستخدام fluorophore أو معرف الأخرى المتصلة جزيء صغير من microinjected الفائدة (الشكل 4C). يتم إصلاح العينة مع غلوتارالدهيد والمجهزة للالمجهر الإلكتروني. ويتم الحصول على micrographs الإلكترون ومضافين على الخلايا التي تتلاءم معها (الشكل 4D). يتم تفتيشها المناطق بإيواء إشارات الفلورسنت بمزيد من التفصيل في أعلى التكبير (الشكل 4E ).

الشكل 1. الجدول الزمني الداخلي CLEM حقن مكروي. اعتمادا على الإعداد التجريبية، يمكن إجراء حقن مكروي وقياسات مضان في نفس اليوم. إعداد عينة للفحص المجهري الإلكترون هو الأكثر استهلاكا للوقت بسبب الخطوات حضانات طويلة وتستمر 2-3 أيام. لا يمكن أن يؤديها TEM تحليل وربط إشارات مضان المجهر الإلكتروني مع الصور في يوم واحد.

الشكل 2 الشكل العام للحقن مكروي الإجراء CLEM الخطوة 1: تحديد موقع الخلايا المتزايد على ساترة الزجاج المحفور بالليزر الشبكية وmicroinject جزيء من الفائدة الخطوة 2:. التقاط كل الصور المشرقة ومجال مبائر الفلورسنت Z-رزمة من الخلايا microinjected الخطوة 3: إعدادساترة لEM التحليل وتغرس في الراتنج EPON. نقل باستخدام نمط الشبكة، وتقليم منع مثل هذه الخلايا من الفائدة في ذروة الخطوة 4: قص المقاطع المسلسل مع مشراح مستدق الخطوة 5: ربط الصور الفلورسنت مع EM الصور.

الشكل 3 نمط الشبكة تسهل تحديد الخلايا التي تهم الفريق A يصور حقن مكروي من الخلايا نمت لconfluency 50٪ ~؛ ملاحظة معرف الشبكة العدالة والتنمية. شريط النطاق هو 100 ميكرون. لوحة B يظهر نمط الشبكة المنقولة من ساترة على بلمرة الراتنج كتلة EPON التي ستكون مقطوع متسلسل بعد تحديد الشبكة من الاهتمام المجهر تشريح. لوحة C يظهر نمط الشبكة استعدادا لنقل تقطيع . نلاحظ أن طقطق شبكة نقل هو في الاتجاه المعاكس على الكتلة الراتنج؛ SCALه شريط هو 1200 ميكرومتر.

.. الشكل 4 نتائج ممثلة من ضوء مترابط حقن مكروي والمجهر الإلكتروني لوحة A يظهر صورة مجهرية من الخلايا مجال مشرق NRK المتزايد على الزجاج المحفور بالليزر ساترة الشبكية؛ السهام تشير خليتين التي تصور من قبل CLEM في لوحات لوحة CD B يظهر مضان. من الصبغة تتبع خامل، وفي هذه الحالة تتالي الأزرق، وتستخدم لتحديد الخلايا التي تم microinjected. لوحة C يظهر تراكب حقل مشرق وتوقيع مضان من جزيء رودامين التي تحمل علامات صغيرة. يشار إلى خليتين هو موضح هنا من قبل السهام في لوحات A & B. D لوحة تمثل CLEM المجال مشرق، المجهر الفلورسنت والإلكترونات؛ رأس السهم يشير إلى نقاط والتقط الفلورسنت في أعلى لوحة التكبير في الحانات E مقياس هي كما فلأدنى مستوى: A & B لوحات، و 100 ميكرومتر، C & D، 50 ميكرومتر؛ E، 100 نانومتر.

Discussion

طريقة المقدمة هنا يمكن تسليم مباشرة من البروتينات النقية، الأحماض النووية، أو جزيئات صغيرة حقيقية النواة إلى السيتوبلازم ويتيح فائقة عالية الدقة من خلال تحليل العلاقة من المجهر الفلورسنت والإلكترونات. استخدام هذا الأسلوب هو بسيطة لكنها قوية ويمكن القيام بها في ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
Photoetched ساترة واللوحة لايف خلايا	ماتيك	P35G-2-14-CGRD
تكساس الأحمر	إينفيتروجن	D3329
سلسلة الأزرق	إينفيتروجن	D7132
رودامين وصفها كيت	الحرارية العلمية	53002
0،22 ميكرون وحدة الترشيح الطرد المركزي	ميليبور	UFC30GV00
الماصات الزجاج البورسليكات	سوتر الآلات	BF100-50-10
Micropipette بولير	سوتر الآلات	نموذج P-97	استخدام برنامج رقم 4 بعد أداء الاختبار المنحدر
FemtoJet حقن مكروي النظام	إيبندورف	Injectman NI2
ساترة إزالة السوائل	ماتيك	PDCF OS 30
Technai مجهر إلكترون ناقل	الاتحاد الدولي للفروسية	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	لايكا	EM UC6