تجزئة والقياس من وحدات تخزين الدهون في الفئران نماذج السمنة عن طريق الأشعة السينية التصوير المقطعي

Summary

ويجري بصورة روتينية الدهون تحليل المحتوى في دراسات استخدام نماذج البدانة الفئران. الأساليب المستجدة في حيوان صغير CT التصوير والتحليل وتقديم لمزيد من التفاصيل الغنية طولية تحليل محتوى الدهون. الخطوة هنا بالتفصيل ونحن من خلال إجراءات لتنفيذ خطوة صغيرة حيوان CT التصوير والتحليل والتصور.

Abstract

وترتبط السمنة مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات وكذلك مقاييس تخفيض في نوعية الحياة. وترتبط كل من ¹ العوامل البيئية والوراثية وبين السمنة، على الرغم من إعلان أن الآليات الدقيقة الأساسية التي تساهم في المرض الذي يرسم. ^2،3 حيوان صغير عدة وقد وضعت نماذج من السمنة ويعملون في مجموعة متنوعة من الدراسات. ⁴ ألف عنصر حاسم لهذه التجارب تنطوي على مجموعة من البيانات محتوى الدهون الحيوانية الإقليمية و / أو الكلي في ظل ظروف متنوعة.

الطرق التجريبية التقليدية المتاحة لقياس نسبة الدهون في نماذج حيوانية صغيرة من البدانة وتشمل الغازية (المجراة سابقا على سبيل المثال قياس رواسب الدهون)، وغير الغازية (مثل ثنائي الطاقة امتصاص الأشعة السينية (DEXA)، أو الرنين المغناطيسي (MR)) بروتوكولات كل واحدة منها تقدم نسبي المقايضات. قد طرق الغازية الحالية لقياس نسبة الدهون التفاصيلللهيئة والمنطقة توزيع الدهون محددة، ولكن التضحية والموضوعات يحول دون تقييم طولية. وفي المقابل، الحالية غير الغازية استراتيجيات تقديم تفاصيل محدودة لجهاز ومنطقة توزيع الدهون محددة، ولكن يمكن تقدير قيمة طولية. ربما مع ظهور حيوان صغير مخصص الأشعة السينية نظم محسوب (CT) التصوير المقطعي الإجراءات التحليلية وحسب الطلب، على حد سواء، وجهاز تحليل منطقة محددة من توزيع الدهون والتنميط طولية يكون ممكنا. والتحقق من صحة التقارير الأخيرة استخدام CT للتصوير في الجسم الحي طولية من السمنة في الفئران الحية. ^5،6 هنا نقدم طريقة تعديل يسمح لقياس حجم الدهون / مجموع، والتحليل والتصور الاستفادة من Carestream التصوير الجزيئي نظام CT Albira بالاشتراك مع حزم البرامج PMOD وVolview.

Protocol

1. الحيوانات

1. للنتائج الواردة أدناه، تم الحصول على 3 فئران C57BL/6J وأربعة B6.V-لاب الفئران ^OB / J من مختبرات جاكسون (بار هاربور، الرئيسي، الولايات المتحدة الأمريكية). B6.V-لاب ^OB / J الفئران تمثل واحدة من أقدم نماذج من السمنة ويبقى بحث بنشاط. B6.V-لاب ^OB / J الفئران يحمل النمط الظاهري تتميز حجم خلية شحمية وزيادة عدد ويمكن أن يصل وزنه ثلاث مرات أكثر من نوع الفئران البرية. ^و7،8 هنا، يعمل B6.V-لاب ^OB / J الفئران باعتبارها إيجابية للحصول على سيطرة النمط الظاهري يعانون من السمنة المفرطة لتوضيح جدوى نظام CT Albira عن القياسات CT محتوى الدهون.
2. تم تنفيذ التصوير عندما وصلت هذه الحيوانات ما يقرب من 12 أسابيع من العمر. (السمنة في الفئران ^OB / J-B6.V لاب هو واضح بعد 4 أسابيع من العمر).
3. وكانت الفئران تخدير بواسطة Isofluorane (2.5٪ معدل التدفق)، وقيد على 2.5٪ من خلال الإعداد مخروط الأنف للتصوير. وتمركزت imals عرضة في السرير الفئران القياسية (M2M التصوير شركة كليفلاند، أوهايو) في المقدمة مع محطة صورة Albira. تمركزت أطرافه الجانبية من الجذع لاكتساب CT موحدة.
4. بعد استكمال الحصول على الصور، وإزالة الفئران من مخروط الأنف، وعاد إلى قفص الانتعاش حتى العيادات الخارجية.

2. الحصول على الصور والإعمار

1. يتم تنفيذ عمليات الاستحواذ الصورة باستخدام التصوير المقطعي Albira نظام (Carestream التصوير الجزيئي، وودبريدج، CT). وكانت الفئران تخدير بواسطة Isofluorane (2.5٪ معدل التدفق)، وقيد على 2.5٪ من خلال الإعداد مخروط الأنف للتصوير. تم تنفيذ عمليات الاستحواذ لمسح قاع ملم طول 115 و 600 باستخدام التوقعات. تم تعيين مصدر الأشعة السينية إلى تيار من 200 ميكروأمبير والجهد من 45 kVp، واستخدمت 0.5 مم آل مرشح إلى شعاع من التشدد.
2. وكان تقريبي يعادل جرعة الاشعاع العميق لضبط CT 220 ملي سيفرت، وسطحية ما يعادل 357.4 ملي سيفرت جرعة كان. هؤلاءجرعات أكثر من 20 أضعاف القيم LD50 أقل من المبلغ عنها. ⁹
3. يتم بناؤها باستخدام الصور (مرشحة الإسقاط العودة) FBP خوارزمية عبر Reconstructor Albira 5.0 جناح باستخدام "ستاندارد" المعلمات. هذه مجتمعة واكتساب إعدادات إعادة الإعمار إنتاج الصورة النهائية مع voxels 125 ميكرون الخواص، التي تعتبر كافية لتحليل كل الحيوانات. لتحليل مفصل منطقة معينة، يمكن اختيار إعادة الإعمار مع voxels 35 ميكرومتر الخواص للتوصل إلى حل نهائي من 90 ميكرون.

3. صورة التحليل

يتم إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج PMOD تحليل (PMOD تكنولوجيز المحدودة، زيوريخ، سويسرا). الصور هي مجزأة في PMOD وفقا لكثافة الأنسجة والعشرين لإجمالي حجم وبعد ذلك لحجم الدهون.

وربما يتم تخفيض 3،1 صور للتحليل للحد من مطالب الحسابية.

1. للحد، وانتقل إلى علامة التبويب شاشة العرض الرئيسية.
2. حدد أدوات> تقليل.
3. حدد العاشر من 2، ص ب 2، وعين من قبل 2.
4. تحقق استبدال.
5. حدد تشغيل.

الرسالة: "مربع إحاطة سيتغير" يعرض مرة واحدة في الحد من اكتمال.

ويمكن ملثمين 3،2 صور للقضاء على السرير والأنف مخروطية عناصر لاحقة تحليل (VOI) حجم من المصالح.

1. لإخفاء، وانتقل إلى الطائرات، وتخطيطات، وتناوب، مرآة، علامات 3D> الطائرات وتخطيط.
2. اختر عرض Z طائرة.
3. انتقل إلى مخروط الأنف في الطائرة Z.
4. حدد علامة التبويب VOI الرئيسية> رسم القمم.
5. رسم المنطقة من اهتمام (ROI) في جميع أنحاء حيوان الأنف والتي لا تشمل السرير ومخروط الأنف.
6. حددنسخ بالارقام الفعلية.
7. الانتقال إلى شريحة المقبل، والعائد على الاستثمار من لصق العازلة من خلال الطائرات ذات الصلة من الأنف.
8. استخدام تحرير مجموعة من القمم لضبط رويس حسب الضرورة.
9. حدد حذف العائد على الاستثمار في الطائرات الأولى وراء الأقماع الأنف.
10. إنشاء VOI جديدة لتشمل محيط الحيوانية (باستثناء الفراش الحيوان) على الطائرات الأولى وراء الأقماع الأنف.
11. انتقل إلى إخفاء VOI> أدوات الجبر.
12. أدخل -1000 في مربع حوار تقدم.
13. حدد voxels قناع خارج الزر VOIs المحدد.

الرسالة: "لا رجعة فيه بيانات عملية هل تريد الاستمرار؟" يعرض.

14. حدد نعم.
15. انتقل إلى الطائرات، وتخطيطات، وتناوب، مرآة، علامات 3D> الطائرات ولايعموميات.
16. حدد إظهار كل الطائرات.
17. دراسة VOI لسلامة.
18. حدد حفظ.
19. حفظ وتحليل.
20. تغيير بادئة اسم الملف.

3.3 أولا، جزء من الصورة لحجم الحيوان المجموع:

1. حدد أدوات> الخارجية.
2. حدد خانة الاختيار الإنقسام.
3. دخول مجموعة من -300 إلى +3500 (كثافة مرجع نطاق المستمدة من البطن مدى كثافة الدهون والمنطقة).
4. حدد تشغيل الإنقسام.
5. فحص سلامة تجزئة.
6. اختر موافق.
7. حدد إزالة العائد على الاستثمار.
8. حدد VOI الإحصاءات.

وذكرت الاحصاءات تمثل الحجم الكلي.

9. تسجيل حجم المبلغ عنها.

3.4 وبعد ذلك، قطعة من صورة لحجم الدهون:

1. عودة الى صورة غير مجزأة لملثمين الدهون حجم تجزئة.
2. لتحميل ملف حفظ البيانات ملثمون، علامة في المربع تحليل في إطار الحمولة).
3. حدد أدوات> الخارجية.
4. حدد خانة الاختيار الإنقسام.
5. دخول مجموعة من -200 إلى -50.
6. حدد تشغيل الإنقسام.
7. فحص سلامة تجزئة.
8. اختر موافق.
9. حدد VOI الإحصاءات.

وذكرت الاحصاءات تمثل حجم الدهون.

10. تسجيل حجم المبلغ عنها.
11. حدد حفظ.
12. حفظ وتحليل.
13. تغيير بادئة اسم الملف.

الاختياري: إذا كان الجلد / كثافة هامشية لا تزال، ويمكن تنفيذ "تآكل واتساع" بروتوكول أدناه للقضاء على هذه المناطق لتحليل VOI.

1. حدد أدوات> الخارجية.
2. حدد خانة الاختيار الصرفي. يعرض رأي المورفولوجية.
3. حدد تآكل.
4. اختر موافق.
5. حدد أدوات> الخارجية.
6. حدد خانة الاختيار الصرفي. يعرض رأي المورفولوجية.
7. حدد تمدد.
8. اختر موافق.

4. التصور من الصور المقطعية

وقد استخدمت 4.1 VolView V3.2 (Kitware، كليفتون بارك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) لإنشاء العروض البصرية المقدمة 3D صور مجزأة.

فتح البيانات المقطعية المنصوص عليها في تحليل الشكل.
1. استخدام الإعدادات الافتراضية في إطار منبثق.
2. فتح القائمة المكونات الإضافية.
3. تحت المساعدة، حدد دمج وحدات التخزين.
4. ازل مكونات إعادة مقياس.
5. فوق تعيين الإدخال الثاني.
6. اختيار بيانات مجزأة الدهون للحصول على مدخلات الثانية.
7. استخدام الإعدادات الافتراضية في إطار منبثق.
8. فوق تطبيق في المكونات.
9. انقر نقرا مزدوجا فوق إطار العرض وحدة التخزين لعرض أكبر من الفأرة الموضوع.

4.2 عودة إلى علامة التبويب لون / التعتيم. عنصر مربع القائمة المنسدلة الذي يشير إلى مجموعة البيانات يجري حاليا تحرير. ويقع اثنان المتزلجون في الجزء السفلي من علامة التبويب وتحديد سطوع النسبية لكل عنصر مجموعة البيانات ضمن تراكب، وذلك باستخدام القيم من 0 إلى 1. عن (1)، مكون عشره ط م، ونحن نفضل استخدام نظام الألوان الرمادية. لتغيير لون:

1. في رسم الخرائط قسم عددي اللون، على واحدة من منزلقات اللون انقر نقرا مزدوجا.
2. لإزالة شريط التمرير، اسحبه من خارج منطقة الجزاء.
3. لإضافة المنزلق الجديدة، انقر في أي مكان داخل منطقة التمرير.
4. إزالة واحدة من منزلقات.
5. جعل منزلق اللون الأسود اليسار (القيمة العددية (S) = -19000).
6. جعل حق اللون الأبيض المنزلق ((S) = 15000).
7. من تعيين مربع عددي التعتيم، وإنشاء نقطة جديدة من خلال النقر داخل المربع. وهذا يعطي ما مجموعه ثلاث نقاط في الإطار.
8. لنقطة وسط، وتغيير (S) إلى ~ -3000، والتعتيم (O) القيمة إلى 0.
9. حدد النقطة الثالثة على اليمين من النافذة.
10. تغيير (S) إلى حوالي 32000، و O إلى 0.25.
11. ويمكن للنقطة الأولى تكون في أي مكان في اليسار، فقط طالما يتم تعيين قيمة التعتيم إلى 0.
12. تغيير إلى العنصر الثاني، الذي ينبغي تعديل مظهر من الدهون.
13. تغيير كل من منزلقات اللون إلى الأحمر بالنقر المزدوج والانزلاق في هوى (H) المنزلق إلى اليسار لكاذبة اللون خريطة الدهون إلى الأحمر. وينبغي أن تكون هناك حاجة إلى القليل جدا من آخر لضبط مظهر من الدهون.

4.3 إلى إنشاء فيلم تناوب ثلاثة لوحة عرض CT، والدهون، وتراكب:

1. انقر واسحب الماوس الموضوع في وضع مستقيم مع الظهر باتجاهك.
2. تحت أوزان المكونات، تعيين قيمة المكون 2 إلى 0 لعرض فقط الاشعة المقطعية.
3. فوق مراجعة <الكاميرا.
4. اختيار عدد من الأطر FOص الفيلم دوران (لهذه القضية، اخترنا "36").
5. تغيير قيمة تناوب X إلى 360 درجة.
6. حدد إنشاء.
7. في مربع الحوار المنبثقة، إنشاء مجلد جديد اسمه CT، وحفظ الملف في تنسيق TIFF، الذي سيتم إخراج سلسلة من الصور التناوب.
8. كرر هذه الخطوة بالنسبة لصورة الدهون، وكذلك للصورة الدهون / CT متراكبة، حفظها في مجلدات فردية في كل مرة.

واستخدمت 4.4 يماغيج الخامس 1.43u لإنشاء ملف فيلم تناوب باستخدام انتاج الصور VolView.

1. في يماغيج، حدد ملف> صورة> استيراد تسلسل.
2. حدد الصورة الأولى في المجلد CT. يقوم البرنامج تلقائيا الكشف عن ملفات أخرى وفتحها كما كدسة.
3. كرر لفتح تسلسل الدهون وتراكب.
4. فتح مدير ROI تحت تحليل> أدوات> ROIمدير.
5. رسم دوروا حول الماوس الموضوع، ما عدا بكسل الخلفية لا داعي لها.
6. في إدارة عائدات الاستثمار، وفوق إضافة لإضافة العائد على الاستثمار.
7. تحديد تسلسل صورة مختلفة.
8. في إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق العائد على الاستثمار لتطبيقه على الصورة. على هذا النحو، سيكون لكل من مداخن اقتصاص تصل المباراة تماما.
9. عندما يكون العائد على الاستثمار هو في أكوام في كل شيء، ضمن ROI انقر بالزر الايمن.
10. حدد تكرار.
11. حدد علامة في المربع المكدس تكرار للفصل بين العائد على الاستثمار من بقية الصورة.
12. إغلاق مداخن صورة أكبر.
13. كرر هذا الإجراء بالنسبة لجميع تسلسلات الصور الثلاث.
14. اذهب إلى صورة> الأكوام> أدوات> الجمع على الجمع بين أكوام معا.
15. حدد CT لالمكدس 1.
16. تحديد نسبة الدهون لمدة ستاك 2.
> تكرار، وحدد الأكوام الجامع لستاك (1) وتراكب للستاك 2.
17. هناك الآن ثلاثة لوحة، صورة التناوب المكدس الذي يمكن أن يكون مخططا من خلال اختيار اللعب في الزاوية السفلى اليسرى من نافذة الصورة.
18. لانقاذ الفيلم بوصفه افي، حدد ملف> حفظ باسم ...> افي ...
19. انقر فوق حفظ.

5. ممثل النتائج

وأفادت النتائج لمدة ثلاثة الفئران (C57BL/6J) WT وأربعة يعانون من السمنة المفرطة (B6.V-لاب ^OB / J) الفئران هنا كمثال ممثل من الدهون / مجموع قياسات نسبة حجم توظيف نظام CT Albira. الشكل 1 أدناه ممثل شاشة العرض التي تم إنشاؤها باستخدام VolView V3.2 للتجزئة (إجمالي حجم أي وحدة تخزين الدهون) من يعانون من السمنة المفرطة الصور المقطعية الفئران.

0/3680fig1.jpg "/>
الشكل 1. ممثل الصور المقطعية مجزأة للدهون. (A) حجم CT البدناء الماوس (B6.V-لاب ^OB / J) مجموع في الرمادي، (ب) حجم الدهون في الحمراء، و (ج) دمج صورة. (د) وزن الماوس حجم CT (C57BL/6J) مجموع في الرمادي، (E) حجم الدهون في الحمراء، و(F) انصهار صورة.

وتفيد التقارير مجلدات مجموع كميات الدهون، واحتساب نسب حجم الدهون / مجموع أدناه في الجدول رقم 1 لكل فأر WT وكل فأر يعانون من السمنة المفرطة. كان متوسط ​​نسبة حجم الدهون / الإجمالية للمجموعة WT والمجموعة البدينة 0.09 و 0.42 على التوالي (الشكل 2). تم العثور على نسب حجم الدهون / الإجمالية للفئران WT مقابل الفئران السمينة أن هناك اختلاف كبير (P = 0.001).

وزن (C57BL/6J)	مجموع (سم 3)	الدهون (سم 3)	الدهون / نسبة إجمالي	السمنة (B6.V-لاب OB /)	مجموع (سم 3)	الدهون (سم 3)	الدهون / نسبة إجمالي
الحيوان 1	28.79	3.00	0.10	الحيوان 1	66.25	26.75	0.40
الحيوان 2	33.25	3.05	0.09	الحيوان 2	61.15	26.31	0.43
حيوان 3	30.30	2.63	0.09	حيوان 3	64.19	25.7	0.40
				حيوان 4	54.25	23.78	0.44

الجدول رقم 1. اجمالى حجم التداول، حجم الدهون،واستمدت نسب حجم الدهون / مجموع وزن الفئران، ويعانون من السمنة المفرطة. كميات من الدهون والدهون من صور مجزأة باستخدام PMOD VOI تحليل.

الشكل 2. وبلغ متوسط ​​حجم حساب المتوسطات نسب الدهون / مجموع وزن الفئران مقابل الفئران السمينة. نسب حجم الدهون / مجموع وزن (C57BL/6J) والبدناء (B6.V-لاب ^OB / J) وجدت لتكون 0.09 و 0.42 على التوالي يتم عرضها. (أشرطة الخطأ = الانحراف المعياري واحد). تم العثور على وزن مقابل نسب السمنة حجم الدهون / مجموع تختلف اختلافا كبيرا (ف قيمة = 0.001).

Discussion

هنا، وذلك باستخدام الفئران ^OB / J-B6.V لاب قد بينت لنا مدى جدوى إجراء قياسات نسبة الدهون في نموذج حيوان صغير باستخدام نظام التصوير المقطعي Albira. هذه القياسات متوافقة مع التوقعات لمجموعة من المقارنات والقياسات البينية بين المجموعة. أولا، قدم ممثل هنا تسليط الضوء على نتائج محدودة داخل المجموعة التباين في قياس نسب حجم الدهون / مجموع في كل من المجموعتين الفئران WT ويعانون من السمنة المفرطة باستخدام هذه الإجراءات. ثانيا، ونسب حجم الدهون / مجموع وزن الفئران مقابل يعانون من السمنة المفرطة تختلف اختلافا كبيرا. أخيرا، استنادا إلى المقارنات (لا تظهر) مع القيم السابقة الإبلاغ عن كتلة نسبي في المئة من الدهون والدهون في الجسم للوزن مقابل B6.V-لاب الفئران ^OB / J، لدينا قياسات لحجم نسب الدهون / الإجمالية للوزن مقابل B6.V- LEP ^OB / J الفئران تقع ضمن النطاق ^{المتوقع، 7، 8.}

ويمكن تطبيق الأساليب بالتفصيل هنا أو تكييفها لم الأخرىodels و / أو أهداف الدراسة. قد تكون هناك حاجة تعديلات في معايير إعادة الإعمار لتحقيق أهداف محددة. على سبيل المثال، Judex وآخرون. وذكرت (2010) أن هناك حاجة إلى 50 صورة قرار ميكرومتر لبعض التحليل منطقة محددة. ويمكن اختيار واحد مجلدات الخواص سم من صورة لمدة 35 ميكرومتر اعادة البناء في Reconstructor Albira جناح 5.0 باستخدام "الموارد البشرية" خيار إعادة الإعمار. ربما مرة واحدة وقد تم استخدام نظام CT Albira لمنطقة محددة، وجهاز قياس نسبة الدهون يمكن تحقيق الفوائد الكاملة (منطقة في وقت واحد أي جهاز معين وقياسات حجم الدهون والقياسات الطولية) من مقرها CT تحليل محتوى الدهون لنظام CT Albira.

الاستنتاجات:

هنا نقدم تفصيلا، وخطوة خطوة طريقة لقياس نسبة الدهون في الفئران الحية باستخدام الأشعة السينية CT التصوير. حصلنا على بياناتنا المقطعية تحدد باستخدام محطة صورة Albira، وأجرى لاحقا تجزئة وآناتحلل باستخدام برمجيات PMOD. أخيرا، ونحن نقدم تعليمات لتمكين تقديم السهل والتصور لتوزيع الأنسجة الدهنية في كل الحيوانات.