La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Resumen

Análisis de contenido de grasa se realiza rutinariamente en los estudios que utilizan modelos murinos de obesidad. Métodos emergentes en pequeños animales y el análisis de imágenes de TC están proporcionando los detalles longitudinal rica análisis de contenido de grasa. A continuación le detallamos paso a paso los procedimientos para la realización de pequeños animales TAC, análisis y visualización.

Resumen

La obesidad se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad, así como métricas de reducción en la calidad de vida. ¹ Ambos factores ambientales y genéticos están asociados con la obesidad, aunque los mecanismos precisos subyacentes que contribuyen a la enfermedad están siendo delineadas. ^2,3 Varios pequeños animales modelos de obesidad se han desarrollado y se emplean en una variedad de estudios. ⁴ Un componente crítico de estos experimentos consiste en la recogida de datos en animales regionales y / o total del contenido de grasa en condiciones variadas.

Los métodos tradicionales experimentales disponibles para medir el contenido de grasa en pequeños modelos animales de obesidad incluyen invasiva (por ejemplo, la medición ex vivo de los depósitos de grasa), y no invasivos (por ejemplo, de energía dual de rayos X (DEXA) o resonancia magnética (RM)) protocolos cada uno de ellos presenta ventajas y desventajas en relación. Los actuales métodos invasivos para medir el contenido de grasa puede proporcionar detallespara el órgano y la región específica de distribución de la grasa, pero sacrificando los sujetos se oponen a las evaluaciones longitudinales. Por el contrario, las actuales estrategias no invasivas ofrecen detalles limitados para órgano y la región de distribución de la grasa específica, sino que permiten la evaluación longitudinal de valor. Con la llegada de pequeños animales dedicados de rayos X de tomografía computarizada (TC) y los sistemas personalizados de procedimientos analíticos, tanto de órganos y el análisis de la región específica de distribución de la grasa y el perfil longitudinal puede ser posible. Informes recientes han validado el uso de la TC para la visualización in vivo longitudinal de la adiposidad en los ratones que viven ^5,6. A continuación presentamos un método modificado que permite la medición del volumen de grasa / total, el análisis y la visualización de la utilización de la Carestream Molecular Imaging Albira sistema CT en conjunto con paquetes de software y PMOD Volview.

Protocolo

1. Animales

1. Por los resultados presentados a continuación, tres y cuatro ratones C57BL/6J B6.V-LEP ratones ^ob / J se obtuvieron de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, Principal, EE.UU.). B6.V-LEP ^ob / J ratones representan uno de los primeros modelos de la obesidad y se mantienen investigando activamente. B6.V-LEP ^ob / J ratones muestran un fenotipo caracterizado por aumento de tamaño y número de adipocitos y pueden pesar hasta tres veces más que los ratones de tipo salvaje. ^7,8 En este caso, B6.V-LEP ^ob / J ratones se emplea como un hecho positivo de control para un fenotipo obeso para ilustrar la viabilidad del sistema de Albira CT para CT basados ​​en las mediciones del contenido de grasa.
2. Imágenes se realizó cuando los animales alcanzaron aproximadamente 12 semanas de edad. (La obesidad en B6.V-LEP ^ob / J ratones se manifiesta después de 4 semanas de edad).
3. Los ratones fueron anestesiados por el isofluorano (2,5% del caudal) y se mantiene en el 2,5% a través de una configuración de ojiva para la imagen. Untrado animales seropositivos se coloca boca abajo en el lecho de rata estándar (M2M Imaging Inc. de Cleveland, OH) en suministrado con la estación de imagen Albira. Las ramas laterales se colocaron en el torso de un uniforme de la adquisición del TC.
4. Después de la adquisición de la imagen se completó, los ratones fueron retirados del cono de la nariz y volvió a una jaula de recuperación hasta ambulatoria.

2. Adquisición de imágenes y reconstrucción

1. Adquisiciones de imágenes se realizan utilizando el sistema de Albira CT (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Los ratones fueron anestesiados por el isofluorano (2,5% del caudal) y se mantiene en el 2,5% a través de una configuración de ojiva para la imagen. Las adquisiciones se realizaron para analizar una cama de 115 mm de longitud, con 600 proyecciones. La fuente de rayos X se fijó a una corriente de 200 mA y el voltaje de 45 kVp, y se utiliza un filtro de 0,5 mm de Al para endurecer la viga.
2. Equivalente aproximado de la dosis de radiación profunda para los ajustes de CT fue de 220 mSv, y ​​la dosis equivalente superficial fue 357,4 mSv. Estoslas dosis son más de 20 veces menor que el reportado valores de la DL50. ⁹
3. Las imágenes se reconstruyen utilizando la FBP (proyección filtrada) a través del algoritmo de Albira Suite 5.0 Reconstructor "Estándar" con los parámetros. Se trata de adquisición combinada y la configuración de reconstrucción producir una imagen final con 125 voxels isotrópicos micras, considera suficiente para el análisis de animal entero. Para el análisis de la región específica y detallada, una reconstrucción con 35 vóxeles isotrópicos micras puede ser seleccionado para una resolución final de 90 micrómetros.

3. Análisis de Imagen

El análisis de imágenes se realiza mediante el PMOD (PMOD Technologies Ltd, Zurich, Suiza) el software de análisis. Las imágenes son segmentados en PMOD de acuerdo a la densidad de los tejidos, primero para el volumen total y el volumen de grasa.

3.1 Las imágenes pueden ser reducido para el análisis de minimizar las exigencias de cálculo.

1. Para reducir, vaya a la pestaña Vista principal.
2. Seleccione Herramientas> Reducir.
3. Seleccione X por 2, Y por 2, y Z por 2.
4. Compruebe reemplazar.
5. Seleccione Ejecutar.

El mensaje: "cuadro delimitador va a cambiar" aparece una vez que la reducción es completa.

3.2 Las imágenes se pueden enmascarar para eliminar elementos de la cama y la nariz de cono para su posterior volumen de interés (VOI) el análisis.

1. Para enmascarar, vaya a planos, diseños, rotaciones, espejos, marcadores 3D> Planes y Distribución.
2. Seleccione Mostrar plano Z.
3. Desplácese hasta el cono de la nariz en el plano Z.
4. Seleccione la pestaña principal de VOI> Dibuja los vértices.
5. Dibuja una región de interés (ROI) en torno a la nariz del animal, con exclusión de la cama y el cono de la nariz.
6. SeleccionarCopia retorno de la inversión real.
7. Vaya a la corte el próximo, y pegar el ROI de búfer a través de los planos correspondientes de la nariz.
8. Utilice la opción Editar Grupo de los vértices para ajustar el rendimiento de la inversión según sea necesario.
9. Seleccione Eliminar retorno de la inversión en los primeros planos más allá de los conos de ojiva.
10. Generar una nueva VOI para abarcar la circunferencia de animales (con exclusión de la cama de animales) en los primeros planos más allá de los conos de ojiva.
11. Vaya a VOI herramientas de máscaras> y Álgebra.
12. Introduzca -1000 en el cuadro de diálogo proporcionado.
13. Seleccione los voxels máscara fuera el botón de VOIs seleccionado.

El mensaje: ". Operación de datos irreversible ¿Desea continuar?" pantallas.

14. Seleccione Sí.
15. Navegue hasta planos, diseños, rotaciones, espejos, marcadores 3D> Planes y Laysalidas.
16. Seleccione Mostrar todos los planos.
17. Examine el VOI para la integridad.
18. Seleccione Guardar.
19. Analizar Guardar como.
20. Cambiar el prefijo de nombre de archivo.

3.3 Primer segmento, la imagen del volumen total del animal:

1. Seleccione Herramientas> Externa.
2. Seleccione la casilla de verificación de segmentación.
3. Introduzca un rango de -300 a 3.500 (rango de referencia de densidad derivada de la densidad de la grasa abdominal amplia-región).
4. Seleccione Ejecutar segmentación.
5. Examine la integridad de la segmentación.
6. Seleccione Aceptar.
7. Seleccione Eliminar retorno de la inversión.
8. Seleccione las estadísticas VOI.

Estadísticas reportadas representan el volumen total.

9. Registre el volumen reportado.

3.4 Segmento siguiente, la imagen de volumen de grasa:

1. Volver a la imagen enmascarada no segmentado de la grasa-el volumen de segmentación.
2. Para cargar el archivo guardado los datos enmascarados, marque la casilla Analizar en la ventana de carga).
3. Seleccione Herramientas> Externa.
4. Seleccione la casilla de verificación de segmentación.
5. Introduzca un rango de -200 a -50.
6. Seleccione Ejecutar segmentación.
7. Examine la integridad de la segmentación.
8. Seleccione Aceptar.
9. Seleccione las estadísticas VOI.

Las estadísticas reportadas representan el volumen de grasa.

10. Registre el volumen reportado.
11. Seleccione Guardar.
12. Analizar Guardar como.
13. Cambiar el prefijo de nombre de archivo.

Opcional: Si la piel / densidad periférica sigue siendo, la "erosión y la dilatación" del protocolo a continuación se puede realizar para eliminar estas regiones para el análisis de VOI.

1. Seleccione Herramientas> Externa.
2. Seleccione la casilla de verificación morfológica. Las pantallas de vista morfológico.
3. Seleccione la erosión.
4. Seleccione Aceptar.
5. Seleccione Herramientas> Externa.
6. Seleccione la casilla de verificación morfológica. Las pantallas de vista morfológico.
7. Seleccione la dilatación.
8. Seleccione Aceptar.

4. La visualización de las imágenes de TC

4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, EE.UU.) se utilizó para crear pantallas 3D prestados visual de las imágenes segmentadas.

1. Abre los datos CT establecidos en el formato Analyze.
2. Utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente.
3. Abra el menú de plug-ins.
4. En Utilidad, seleccione Combinar volúmenes.
5. Desactive la opción Cambiar la escala de los componentes.
6. Haga clic en Asignar segunda entrada.
7. Elija los datos segmentados de grasa para la segunda entrada.
8. Utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente.
9. Haga clic en Aplicar plug-in.
10. Haga doble clic en Volumen ventana de visualización para una vista más grande del ratón tema.

4.2 Volver a la ficha Color / Opacidad. El componente de cuadro desplegable se refiere al conjunto de datos que se está editando actualmente. Dos deslizadores se encuentran en la parte inferior de la ficha y determinar el brillo relativo de cada conjunto de datos de componentes establecidos dentro de la superposición, el uso de valores de 0 a 1. Para el componente 1, the CT, se prefiere usar una combinación de colores en escala de grises. Para cambiar el color:

1. En la sección Escalar Asignación de color, haga doble clic en uno de los reguladores de color.
2. Para quitar un control deslizante, arrástrelo fuera de la caja.
3. Para agregar un nuevo deslizador, haga clic en cualquier lugar dentro del área del conmutador.
4. Retire uno de los deslizadores.
5. Hacer de la izquierda regulador de color negro (valor escalar (S) = -19.000).
6. Gire a la derecha regulador de color blanco ((S) = 15000).
7. En el cuadro de escalar mapas de opacidad, crear un nuevo punto haciendo clic dentro de la caja. Esto le dará un total de tres puntos en la ventana.
8. Por el punto medio, cambiar el (S) para ~ -3000, y la opacidad (O) valor de 0.
9. Seleccione el tercer punto a la derecha de la ventana.
10. Cambiar (S) a cerca de 32.000, y O a 0.25.
11. El primer punto puede estar en cualquier parte de la izquierda, al igual que siempre y cuando el valor de opacidad se establece en 0.
12. Cambie a dos componentes, que debe modificar el aspecto de la grasa.
13. Cambie cada uno de los deslizadores de color a rojo, haciendo doble clic y arrastrando el tono (H) control deslizante hacia la izquierda para el mapa en falso color de la grasa de color rojo. Muy poco más se necesita para ajustar el aspecto de la grasa.

4.3 Para crear una película de rotación de tres paneles muestra el TC, la grasa y de superposición:

1. Haga clic y arrastre el ratón del sujeto en una posición vertical con la parte trasera mirando hacia usted.
2. En virtud de pesos de los componentes, establezca el valor del componente de dos a 0 para mostrar sólo la TC.
3. Haga clic en Revisar> Cámara.
4. Seleccione un número de fotogramas for la rotación de la película (en el presente caso, se optó por "36").
5. Cambiar el valor de rotación X a 360 grados.
6. Seleccione Crear.
7. En el cuadro de diálogo emergente, crear una nueva carpeta llamada TC, y guarde el archivo en formato TIFF, que se emitirá una serie de imágenes de rotación.
8. Repetir este paso para la imagen de grasa, así como para la superpuesto grasa / TC imagen, ahorrando en carpetas individuales cada vez.

ImageJ 4,4 v 1.43u se utilizó para generar un archivo de película con la rotación de las imágenes de salida VolView.

1. En ImageJ, seleccione Archivo> Importar secuencia de imágenes>.
2. Seleccione la primera imagen en la carpeta CT. El software detectará automáticamente los archivos de otros y abrir como una pila.
3. Repita el proceso para abrir las secuencias de grasa y de superposición.
4. Abra el Administrador de retorno de la inversión en Análisis> Herramientas> ROIManager.
5. Dibuja un retorno de la inversión alrededor del ratón tema, con exclusión de los píxeles de fondo innecesarias.
6. En el gestor de retorno de la inversión, haga clic en Agregar para agregar el retorno de la inversión.
7. Seleccione una secuencia de imágenes diferentes.
8. En el gestor de retorno de la inversión, haga clic en el retorno de la inversión para aplicarlo a la imagen. De esta manera, cada una de las pilas recortadas se corresponden perfectamente.
9. Cuando el retorno de la inversión está en todas las pilas, haga clic derecho en el retorno de la inversión.
10. Seleccione Duplicar.
11. Seleccione Ver la caja de la pila Duplicar para separar el retorno de la inversión del resto de la imagen.
12. Cerca de las pilas de imágenes más grandes.
13. Repita este procedimiento para las tres secuencias de imágenes.
14. Ir a Imagen> Pilas> Herramientas> Combinar para combinar las pilas juntos.
15. Seleccione la TC para la pila 1.
16. Seleccione la grasa de la pila 2.
> Repetir y seleccione Pilas combinados para la pila 1 y de superposición de la pila 2.
17. Ahora hay una de tres paneles, la imagen de rotación de la pila que se puede visualizar seleccionando Reproducir en la esquina inferior izquierda de la ventana de la imagen.
18. Para guardar la película como un archivo AVI, seleccione Archivo> Guardar como ...> AVI ...
19. Haga clic en Guardar.

5. Los resultados representativos

Los resultados de tres WT (C57BL/6J) los ratones obesos y cuatro (B6.V-Lep ^ob / J) los ratones se presentan aquí como un ejemplo representativo de las mediciones de relación de grasa / total de volumen que emplean el sistema Albira CT. Figura 1 se presenta un representante de visualización creado con VolView v3.2 para la segmentación (es decir, volumen total y el volumen de grasa) de ratones obesos imágenes de TC.

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Figura 1. Representante CT segmentados para la grasa de las imágenes. (A) Obeso ratón (B6.V-Lep ^ob / J) del volumen total de TC en escala de grises, (B) el volumen de grasa en rojo, y (C) fusión de imágenes. (D) PESO ratón (C57BL/6J) el volumen total de TC en escala de grises, (E) el volumen de grasa en rojo, y (F) la fusión de imágenes.

El volumen total, los volúmenes de grasa, y calculó el volumen de grasa / total se presentan a continuación en la Tabla 1 para cada ratón WT y cada ratón obeso. El promedio de grasa / total de la relación de volumen para el grupo PT y el grupo de obesos fue de 0,09 y 0,42, respectivamente (Figura 2). Las relaciones de volumen de grasa / total de los ratones WT frente a los ratones obesos se encontró diferencias significativas (p = 0,001).

WT (C57BL/6J)	Total (cm 3)	Grasa (cm 3)	Grasa / Total Ratio	Obeso (B6.V-Lep ob /)	Total (cm 3)	Grasa (cm 3)	Grasa / Total Ratio
Animal 1	28,79	3,00	0,10	Animal 1	66,25	26,75	0,40
Animal 2	33,25	3,05	0,09	Animal 2	61,15	26,31	0,43
Animal 3	30,30	2,63	0,09	Animal 3	64,19	25,7	0,40
				Animal 4	54,25	23,78	0,44

Tabla 1. El volumen total, el volumen de grasa,y la proporción de volumen de grasa / total de ratones WT y la obesidad. volúmenes totales y la grasa se ​​obtuvieron a partir de imágenes segmentadas utilizando el análisis de PMOD VOI.

Figura 2. Promedio de los cocientes del volumen de grasa / total de ratones WT frente a los ratones obesos. Un promedio de grasa / total de relaciones de volumen para el peso (C57BL/6J) y obesidad (B6.V-Lep ^ob / J) que se encuentran a ser 0,09 y 0,42, respectivamente, se muestran. (Las barras de error = desviación estándar de una sola). WT frente obesos grasa / total de relaciones de volumen se encontraron diferencias significativas (p-valor = 0,001).

Discusión

En este caso, la utilización de B6.V-LEP ^ob / J ratones que han demostrado la factibilidad de realizar las mediciones de contenido de grasa en un modelo animal pequeño utilizando el sistema de Albira TC. Estas mediciones son consistentes con las expectativas para las comparaciones de intra-grupo y las mediciones entre los grupos. En primer lugar, los resultados representativos que aquí resaltar limitada dentro del grupo la variabilidad en las mediciones de relaciones de volumen de grasa / total en ambos grupos de ratones WT y la obesidad con estos procedimientos. En segundo lugar, la grasa / total de relaciones de volumen para los ratones WT contra obesidad difieren significativamente. Por último, sobre la base de las comparaciones (no se muestra) con los valores previamente reportados para relación masa grasa total y porcentaje de grasa corporal para WT contra B6.V-LEP ratones ^ob / J, las mediciones relativas a los ratios de volumen de grasa / total para el peso frente al B6.V- Lep ^ob / J ratones caen dentro de un rango ^{esperado, 7, 8.}

Los métodos detallados aquí podría ser aplicado o adaptado para m otraodelos y / o los objetivos del estudio. Las modificaciones en los parámetros de reconstrucción puede ser necesaria para lograr objetivos específicos. Por ejemplo, Judex et al. (2010) informó que 50 imágenes de resolución de micras se requiere para un análisis específico de la región. Uno volúmenes cm isotrópicas de una imagen puede ser seleccionado por 35 reconstrucciones micras en el Reconstructor Albira 5,0 suite utilizando el "HR" opción de reconstrucción. Una vez que el sistema de Albira CT se ha utilizado para la región y de órganos específicos mediciones del contenido de grasa de todos los beneficios (es decir, la región y simultánea de órganos específicos de la medición del volumen de grasa y las mediciones longitudinales) de TC basada en el análisis de contenido de grasa puede ser ejercido por el sistema de Albira TC.

Conclusiones:

Aquí le ofrecemos un detallado paso por paso el método para la medición del contenido de grasa en ratones vivos que utilizan rayos X de tomografía computerizada. Adquirimos nuestros datos de la TC establece utilizando una estación de la imagen Albira, y se realizó la segmentación posterior y analisis utilizando la suite de software PMOD. Por último, se proporcionan instrucciones para que la representación fácil y visualización de la distribución del tejido graso en el animal entero.