Segmentazione e misurazione dei volumi FAT nei modelli murini di obesità Utilizzo di X-ray Tomografia Computerizzata

Riepilogo

Analisi del contenuto di grassi è abitualmente condotta in studi che utilizzano modelli murini di obesità. Metodi emergenti nel piccolo animale CT imaging e di analisi stanno fornendo per l'analisi longitudinale di contenuti particolari grassi. Qui passo dettaglio da procedure dettagliate per l'esecuzione di piccoli animali CT imaging, analisi e visualizzazione.

Abstract

L'obesità è associata ad aumentata morbidità e mortalità e di metriche di riduzione della qualità di vita. ¹ Entrambi i fattori ambientali e genetici sono associati con l'obesità, anche se i precisi meccanismi di base che contribuiscono alla malattia sono attualmente delineati. ^2,3 Diversi piccoli animali modelli di obesità sono stati sviluppati e sono impiegati in una varietà di studi. ⁴ Un componente fondamentale per questi esperimenti comporta la raccolta di regionali e / o totale di dati di contenuto di grassi animali in condizioni diverse.

Tradizionali metodi sperimentali disponibili per misurare il contenuto di grassi in modelli animali di obesità sono piccole invasiva (es. misurazione ex vivo di depositi di grasso) e non invasivi (ad es Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) o risonanza magnetica (MR)) i protocolli, ciascuno dei quali presenta relativa trade-off. Gli attuali metodi invasivi per la misurazione del contenuto di materia grassa può fornire dettagliper organo e regione specifica distribuzione di grasso, ma sacrificando i soggetti preclude valutazioni longitudinali. Al contrario, le attuali strategie non invasive, di fornire informazioni limitate per organo e regione specifica distribuzione di grasso, ma permettono di valore valutazione longitudinale. Con l'avvento dei piccoli animali dedicati a raggi X tomografia computerizzata (CT) sistemi e procedure di analisi personalizzate, sia degli organi e l'analisi specifica regione della distribuzione del grasso e la profilatura longitudinale può essere possibile. Recenti studi hanno convalidato l'uso della TC per l'imaging in vivo longitudinale di adiposità in topi vivi. ^5,6 Qui forniamo un metodo modificato che permette di grassi / totale misurazione del volume, l'analisi e la visualizzazione utilizzando la Carestream Molecular Imaging Albira sistema CT in collaborazione con i pacchetti software e PMOD Volview.

Protocollo

1. Animali

1. Per i risultati di seguito riportati, tre e quattro topi C57BL/6J B6.V-LEP ^ob / J topi sono stati ottenuti da Jackson Laboratories (Bar Harbor, Main, USA). B6.V-LEP ^ob / J topi rappresentano uno dei primi modelli di obesità e rimangono attivamente ricercato. B6.V-LEP ^ob / J topi mostrano un fenotipo caratterizzato da un aumento della dimensione degli adipociti e il numero e può pesare fino a tre volte di più rispetto ai topi wild type. ^7,8 Qui, B6.V-LEP ^ob / J topi sono stati impiegati come un segnale positivo controllo per un fenotipo obesi per illustrare la fattibilità del sistema Albira CT per CT misurazioni basate contenuto di grassi.
2. Imaging è stata effettuata quando gli animali ha raggiunto circa 12 settimane di età. (Obesità in B6.V-LEP ^ob / J topi si manifesta dopo 4 settimane di età).
3. I topi sono stati anestetizzati con isofluorano (portata 2,5%) e tenuti sotto al 2,5% con un naso a cono di installazione per l'imaging. Unimals sono stati posizionati prona nel letto ratto standard (M2M Imaging Inc. di Cleveland, OH) in dotazione con la stazione Albira immagine. Gli arti erano posizionati lateralmente dal tronco per una acquisizione uniforme CT.
4. Dopo l'acquisizione delle immagini è stata completata, i topi sono stati rimossi dal cono e restituito una gabbia recupero fino ambulatoriale.

2. Acquisizione di immagini e la ricostruzione

1. Acquisizioni di immagini vengono eseguite utilizzando il Albira CT sistema (Kodak Imaging Molecolare, Woodbridge, CT). I topi sono stati anestetizzati con isofluorano (portata 2,5%) e tenuti sotto al 2,5% con un naso a cono di installazione per l'imaging. Le acquisizioni sono state effettuate per eseguire la scansione di un letto di 115 mm di lunghezza, con 600 proiezioni. La sorgente di raggi X è stata impostata a una corrente di 200 μA e tensione di 45 kVp, e utilizzato un 0,5 millimetri Al filtro per indurire il fascio.
2. Approssimativo equivalente di dose di radiazione profonda per le impostazioni di CT è stata di 220 mSv, e la dose equivalente superficiale era 357,4 mSv. Questele dosi sono più di 20 volte inferiori rispetto a quanto indicato valori di DL50 ^9.
3. Le immagini vengono ricostruite utilizzando la (proiezione di fondo filtrata) attraverso l'algoritmo di FBP Suite Albira 5,0 Reconstructor utilizzando "Standard" parametri. Questi acquisizione combinata e le impostazioni di ricostruzione produrre un'immagine finale con 125 micron voxel isotropici, ritenuta sufficiente per l'analisi animale intero. Per l'analisi dettagliata regione specifica, una ricostruzione con voxel 35 um isotropi possono essere selezionati per una risoluzione finale di 90 um.

3. Image Analysis

Analisi delle immagini viene eseguita utilizzando l'(PMOD Technologies LTD, Zurigo, Svizzera), software di analisi PMOD. Le immagini sono segmentati in base al tessuto PMOD densità primo volume totale e poi per il volume di grasso.

3.1 immagini può essere ridotta per l'analisi per minimizzare esigenze di calcolo.

1. Per ridurre, selezionare la scheda Visualizza principale.
2. Selezionare Strumenti> Riduzione.
3. Selezionare da X 2, Y con 2, e Z 2.
4. Controllare Sostituisci.
5. Selezionare Esegui.

Il messaggio: "Bounding box cambierà" schermi, dopo la riduzione è completa.

3.2 Le immagini possono essere mascherati per eliminare gli elementi da letto e il naso-cone per il successivo volume di interesse (VOI) analisi.

1. Per mascherare, passare a Planes, Aspetto, rotazioni, Specchio, marcatori 3D> Aerei e layout.
2. Selezionare Mostra piano Z.
3. Scorrere fino al cono nel piano Z.
4. Selezionare la scheda principale VOI> Disegna vertici.
5. Disegnare una regione di interesse (ROI) in giro per l'animale naso, escludendo il letto e cono.
6. SelezionareCopia ROI effettivo.
7. Spostare nella slice successiva, e incollare il ROI dal buffer attraverso i piani rilevanti di naso.
8. Usare Modifica gruppo di vertici per regolare il ROI, se necessario.
9. Selezionare Elimina ROI i primi aerei oltre i coni d'ogiva.
10. Genera un nuovo VOI per comprendere la circonferenza degli animali (escluso il letto animale) i primi aerei oltre i coni d'ogiva.
11. Passare al mascheramento VOI Strumenti> e Algebra.
12. Inserisci -1000 nella finestra di dialogo previsto.
13. Selezionare i voxel Maschera al di fuori del pulsante VOI selezionato.

Il messaggio: ". Irreversibile operazione sui dati Vuoi continuare?" display.

14. Selezionare Sì.
15. Naviga ai piani, layout, rotazioni, Specchio, marcatori 3D> Aerei & Layout.
16. Selezionare Mostra tutti i piani.
17. Esaminare il VOI per l'integrità.
18. Selezionare Salva.
19. Salva come Analizza.
20. Cambiare il prefisso del nome del file.

3,3 In primo luogo, l'immagine del segmento per il volume totale di animali:

1. Selezionare Strumenti> esterna.
2. Selezionare la casella di controllo Segmentazione.
3. Inserire una gamma di -300 a 3500 (range di riferimento di densità derivato da grasso addominale-regione gamma di densità).
4. Selezionare Esegui Segmentazione.
5. Esaminare l'integrità della segmentazione.
6. Fare clic su OK.
7. Selezionare Rimuovi ROI.
8. Selezionare Statistiche VOI.

Statistiche segnalate rappresentano il volume totale.

9. Registrare il volume dichiarato.

3,4 Successivamente, segmentare l'immagine per il volume di grasso:

1. Ritorna alla non-segmentato immagine mascherata di grassi-volume segmentazione.
2. Per caricare il file salvato Masked dati, selezionare la casella di Analisi nella finestra Load).
3. Selezionare Strumenti> esterna.
4. Selezionare la casella di controllo Segmentazione.
5. Inserire una gamma di -200 a -50.
6. Selezionare Esegui Segmentazione.
7. Esaminare l'integrità della segmentazione.
8. Fare clic su OK.
9. Selezionare Statistiche VOI.

Le statistiche riportate rappresentano il volume di grasso.

10. Registrare il volume dichiarato.
11. Selezionare Salva.
12. Salva come Analizza.
13. Cambiare il prefisso del nome del file.

Opzionale: Se la pelle / densità periferico rimane, il protocollo "Erosione e Dilatazione" di seguito possono essere eseguiti per eliminare queste regioni per l'analisi VOI.

1. Selezionare Strumenti> esterna.
2. Selezionare la casella di controllo morfologico. Viene visualizzata la vista morfologico.
3. Seleziona erosione.
4. Fare clic su OK.
5. Selezionare Strumenti> esterna.
6. Selezionare la casella di controllo morfologico. Viene visualizzata la vista morfologico.
7. Seleziona dilatazione.
8. Fare clic su OK.

4. Visualizzazione di immagini CT

4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) è stato utilizzato per creare schermi visivi 3D rendering di immagini segmentate.

1. Aprire i dati CT fissati nel Analizza formato.
2. Utilizzare le impostazioni predefinite nella finestra pop-up.
3. Aprire il plug-in menu.
4. In Utility, selezionare Unisci volumi.
5. Deselezionare componenti Riscala.
6. Fare clic su Assegna secondo ingresso.
7. Scegliere i dati segmentati di grassi per il secondo ingresso.
8. Utilizzare le impostazioni predefinite nella finestra pop-up.
9. Fare clic su Applica plug-in.
10. Fare doppio clic su finestra di visualizzazione del volume per una visualizzazione ingrandita del mouse soggetto.

4,2 tornare al colore / opacità tab. La casella a discesa componente a cui si riferisce insieme di dati è in corso di modifica. Due cursori sono posizionati nella parte inferiore della scheda e determinare la luminosità relativa di ogni componente dati impostati all'interno della sovrapposizione, con valori da 0 a 1. Per il componente 1, the CT, preferiamo usare una combinazione di colori in scala di grigi. Per modificare il colore:

1. Nella sezione Mapping Scalar colore, fate doppio clic su uno dei cursori dei colori.
2. Per rimuovere un dispositivo di scorrimento, trascinarlo fuori dalla scatola.
3. Per aggiungere un nuovo slider, fare clic in qualsiasi punto all'interno dell'area di slider.
4. Rimuovere uno dei cursori.
5. Effettuare il cursore a sinistra di colore nero (valore scalare (S) = -19.000).
6. Fai colore giusto cursore bianco ((S) = 15000).
7. Dalla finestra di mappatura Scalar Opacità, creare un nuovo punto facendo clic all'interno della scatola. Questo darà un totale di tre punti nella finestra.
8. Per il punto medio, modificare la (S) per ~ -3000, e l'opacità (O) il valore a 0.
9. Selezionare il terzo punto a destra della finestra.
10. Variazione (S) a circa 32000, e O a 0,25.
11. Il primo punto può essere ovunque a sinistra, basta che il valore di opacità è impostato su 0.
12. Cambiare per due componenti, che dovrebbe modificare l'aspetto del grasso.
13. Modificare ciascuno dei cursori dei colori al rosso facendo doppio clic e facendo scorrere il Hue (H) cursore a sinistra per falsi colori mappa il grasso al rosso. Ben poco altro dovrebbe essere necessario per regolare l'aspetto del grasso.

4.3 Per creare un panel di tre film di rotazione la visualizzazione del CT, grasso, e overlay:

1. Fare clic e trascinare il mouse soggetto in posizione eretta con la schiena rivolta verso di voi.
2. In Pesi componenti, impostare il valore di due componenti a 0 per visualizzare solo la scansione CT.
3. Fare clic su Review> Camera.
4. Selezionare un numero di fotogrammi for il film di rotazione (per il caso di specie, abbiamo scelto "36").
5. Modificare il valore di rotazione X a 360 gradi.
6. Selezionare Crea.
7. Nel pop-up nella finestra di dialogo, creare una nuova cartella denominata CT, e salvare il file in formato tiff, che sarà in uscita una serie di immagini di rotazione.
8. Ripetere questo passaggio per l'immagine di grasso, così come per la sovrapposizione di grasso / CT immagine, salvandoli in singole cartelle ogni volta.

ImageJ 4,4 v 1.43u è stato utilizzato per generare un file video di rotazione utilizzando le immagini in uscita VolView.

1. In ImageJ, selezionare File> Importa> Immagine Sequence.
2. Selezionare la prima immagine nella cartella CT. Il software rileverà automaticamente gli altri file e aprire come una pila.
3. Ripetere l'operazione per aprire le sequenze di grasso e overlay.
4. Aprire il gestore ROI sotto Analizza> Strumenti> ROIManager.
5. Disegnare un ROI intorno al mouse soggetto, esclusi i pixel dello sfondo inutili.
6. Nel gestore ROI, fare clic su Aggiungi per aggiungere il ROI.
7. Selezionare una diversa sequenza di immagini.
8. Nel gestore ROI, fare clic sul ROI per applicarlo all'immagine. In questo modo, ciascuna delle pile ritagliata si accostata.
9. Quando il ROI è su tutte le pile, fate clic destro all'interno del ROI.
10. Selezionare Duplica.
11. Selezionare Controllare la casella Duplicate Stack per separare il ROI dal resto dell'immagine.
12. Chiudere le serie di immagini più grandi.
13. Ripetere questa procedura per tutte e tre le sequenze di immagini.
14. Vai a Immagine> Stack> Strumenti> Unire per combinare le pile insieme.
15. Selezionare CT per Stack 1.
16. Selezionare per Fat Stack 2.
> Ripeti, e selezionare Stacks Stack combinati per 1 e per Overlay Stack 2.
17. Vi è ora una tre-panel, l'immagine di rotazione dello stack che può essere visualizzata selezionando Play in basso a sinistra della finestra immagine.
18. Per salvare il filmato come AVI, selezionare File> Salva con nome ...> AVI ...
19. Fare clic su Salva.

5. Risultati rappresentativi

Risultati per tre WT (C57BL/6J) e quattro topi obesi (B6.V-Lep ^ob / J) i topi sono riportati qui come un esempio rappresentativo di misurazioni del volume di grasso / totale rapporto che impiegano il sistema Albira CT. Figura 1 fornisce di seguito un rappresentante visualizzano creato con VolView V3.2 per la segmentazione (cioè il volume totale e il volume di grasso) di topi obesi immagini TC.

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Figura 1. Rappresentativi immagini TC segmentati per il grasso. (A) Obese mouse (B6.V-Lep ^ob / J) CT del volume totale in scala di grigi, (B) del volume di grasso in rosso, e (C) la fusione di immagini. (D) WT mouse (C57BL/6J) volume totale di CT in scala di grigi, (E) il volume di grasso in rosso, e (F) la fusione di immagini.

Volumi totali, grassi e volumi calcolati rapporti volumetrici grasso / totale sono riportati nella tabella 1 per ciascun topo WT e ciascun topo obeso. Il mediato grasso / totale rapporto in volume per il gruppo WT e il gruppo obesi era 0,09 e 0,42, rispettivamente (figura 2). I grassi / totale rapporti volumetrici per i topi WT contro i topi obesi è stato trovato a differire in modo significativo (p = 0,001).

WT (C57BL/6J)	Totale (cm 3)	Fat (cm 3)	Fat / Totale Rapporto	Obesi (ob B6.V-Lep /)	Totale (cm 3)	Fat (cm 3)	Fat / Totale Rapporto
Animal 1	28,79	3,00	0,10	Animal 1	66,25	26,75	0,40
Animal 2	33,25	3,05	0,09	Animal 2	61,15	26,31	0,43
Animal 3	30,30	2,63	0,09	Animal 3	64,19	25,7	0,40
				Animal 4	54,25	23,78	0,44

Tabella 1. Il volume totale, il volume di grasso,e rapporti volumetrici grasso / totale per topi WT e obesi. volumi totali e grassi sono stati ottenuti da immagini segmentate utilizzando PMOD analisi VOI.

Figura 2. Media di rapporti volumetrici grasso / totale per topi WT contro topi obesi. Media di grasso / totale rapporti volumetrici per WT (C57BL/6J) e obesi (B6.V-Lep ^ob / J) che si trovano ad essere 0,09 e 0,42, rispettivamente, vengono visualizzati. (Barre di errore deviazione standard = singolo). WT contro obesi di grasso / totale rapporti volumetrici sono stati trovati differiscono significativamente (p-value = 0,001).

Discussione

Qui, utilizzando B6.V-LEP ^ob / J topi abbiamo illustrato la possibilità di effettuare misurazioni del contenuto di grasso in un modello animale piccolo utilizzando il sistema Albira CT. Queste misure sono in linea con le aspettative per i confronti di intra-gruppo e inter-gruppo misurazioni. In primo luogo, i risultati rappresentativi fornito qui evidenziare limitata intra-gruppo di variabilità nelle misurazioni di grassi / totale rapporti volumetrici in entrambi i gruppi di topi WT e obesi che utilizzano queste procedure. In secondo luogo, grasso / totale rapporti volumetrici per topi WT contro obesi differiscono in modo significativo. Infine, sulla base di confronti (non mostrato) con i valori riportati per precedenti relative massa totale di grasso e percentuale di grasso corporeo per la WT contro B6.V-LEP ^ob / J topi, le nostre misure di grassi / totale rapporti volumetrici per WT contro B6.V- LEP ^ob / J topi rientrano all'interno di un intervallo atteso, ^{7, 8.}

I metodi qui descritti potrebbe essere applicato o adattato per altri modelli e / o obiettivi dello studio. Le modifiche dei parametri di ricostruzione può essere richiesto per raggiungere obiettivi specifici. Ad esempio, Judex et al. (2010) ha riferito che 50 micron immagini ad alta risoluzione è stato richiesto di fare alcune analisi specifica regione. Uno dei volumi cm isotropi di una immagine può essere selezionata per 35 ricostruzioni micron nel Reconstructor Albira 5,0 Suite utilizzando l'opzione "HR" ricostruzione. Una volta che il sistema Albira CT è stato utilizzato per la regione e organo misure specifiche tenore di materia grassa tutti i vantaggi (ad esempio regione simultanea e organo misure specifiche volume FAT e misure longitudinali) di analisi basato su CT tenore di materia grassa può essere realizzata per il sistema Albira CT.

Conclusioni:

Qui fornire una descrizione dettagliata, passo dopo passo metodo per la misurazione del contenuto di grasso nei topi viventi utilizzando raggi X TC. Abbiamo acquisito i nostri dati CT imposta utilizzo di una stazione di immagini Albira, ed eseguita la segmentazione e la successiva analisi utilizzando la suite PMOD software. Infine, forniamo le istruzioni per consentire facile il rendering e la visualizzazione della distribuzione di tessuto adiposo all'interno l'intero animale.