الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Summary

نحن هنا لشرح أنني وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتحسن اثنين من الخلية في مرحلة تطور الجنين مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية باستمرار في سلالات الفأر 5 مع استخدام هذا الطقم. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا عن طريق الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية مع عدة كرو • أنا في وقت لاحق واستعاد بنجاح من خلال التلقيح الاصطناعي.

Abstract

وقد أنشئت الآلاف من السلالات الجديدة وراثيا (GM) من الفئران المعدلة منذ ظهور تكنولوجيات transgenesis وخروج المغلوب. العديد من هذه الحيوانات موجودة فقط في قيمة الحيوانات الحية ، مع عدم وجود خطة احتياطية في حال الطوارئ. الحفظ بالتبريد الأجنة يمكن أن توفر هذه النسخة الاحتياطية ، ولكن مكلفة ، يمكن أن تكون الإجراءات المطولة ، ويتطلب عادة عددا كبيرا من الحيوانات من أجل النجاح. منذ اكتشاف الحيوانات المنوية التي يمكن الماوس cryopreserved بنجاح مع وكيل واق من البرد الأساسية (CPA) ، ويتألف من 18 رافينوز ٪ و 3 ٪ الحليب الخالي من الدسم ، وأصبح الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية إجراء مقبولا وفعالا من حيث التكلفة لحفظها وتوزيعها واسترداد قيمة هذه السلالات .

هنا علينا أن نظهر أنا وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتم تجميد الحيوانات المنوية من خمس سلالات شائعة الاستخدام من الفئران الفطرية باستخدام هذه المجموعة ، ثم تعافى. نسب أعلى للحماية من الحيوانات المنوية على الحركة (>واعتبرت 60 ٪) والحركة التقدمية السريع (> 45 ٪) بالمقارنة مع التحكم (الأساسية CPA) عن الحيوانات المنوية المجمدة مع هذه المجموعة في 5 السلالات الفطرية الماوس. وتحسنت اثنين الجنين مرحلة التطوير الخلية بعد التلقيح الاصطناعي مع الحيوانات المنوية المستردة باستمرار في جميع سلالات الفأر 5 فحصها. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا من قبل الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية مع عدة أنا • كرو واستردادها في وقت لاحق من خلال التلقيح الاصطناعي.

Protocol

1. الماوس الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد

1. من أجل كل سطر لتكون cryopreserved ، وإعداد ما يلي قبل البداية.
   1. 1 جيدا طبق 4 - جيدا مع 240 لتر من اتفاق السلام الشامل طقم
   2. 15 قش الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية على النحو التالي
      1. ربط القش 0.25 مل إلى المحاقن 1 مل مع المكونات القطن الأقرب إلى المحقنة. في كل من القش ، وتحميل 8 سم (حوالي 160 ميكرولتر) متوسطة التلقيح الاصطناعي ، ثم 1 سم من الهواء. تسمية القش مع اسم الخط ليتم الحفاظ عليها.
2. وينبغي أن يكون LN ₂ بعمق 15 سم مربع في الرغوة. إغلاق الغطاء.
3. 2 الموت ببطء الفئران الذكور من كل سطر لتكون cryopreserved. وينبغي أن يكون بين الفئران من العمر 10 و 60 أسبوعا. إزالة epididymides two الذيلية مع الأسهر من كل الماوس.
4. ضع epididymides في المحتوية على اتفاق السلام الشامل أعدت مسبقا جيدا طبق 4 - جيدا (الخطوة 1.1).
5. إجراء تخفيضات في كل طولية 5-7 البربخ وبلطفالضغط على كل الأسهر لدفع الحيوانات المنوية خارج.
6. يهز الخليط اتفاق السلام الشامل والبربخ باليد برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق. هذا سيسمح الحيوانات المنوية تسبح بها.
7. باستخدام قش أعدت سابقا ، نضح 5 ملم (حوالي 10 ميكرولتر) من نطفة ثم تعليق. 1 سم من الهواء
8. كرر هذه العملية مع ما يصل الى ما مجموعه 15 القش. تحميل وختم القش في غضون 10 دقائق للبقاء على قيد الحياة أفضل الحيوانات المنوية.
9. حرارة ختم كلا الجانبين من القش بعناية. وضع القش في علبة تجميد الحيوانات المنوية مع العمود الأول.
10. إرفاق ماصة 1 مل تقديمها كجزء من مجموعة إلى علبة لتوسيع التعامل معها. ضع العلبة في LN ₂ في المربع الرغوة من خلال ثقب في الغطاء. السماح بتعويم العلبة عموديا في LN ₂ لمدة 10 دقيقة.
11. غمر العلبة في LN2. هو الآن cryopreserved الحيوانات المنوية ، ويمكن نقلها إلى التخزين الطويل الأجل ₂ LN.
12. لا ينبغي أن تستخدم لاسطوانةالسطر التالي حتى يتم تسخين تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

2. الماوس فرط الإباضة

1. عموما ، استخدام فئران شابة من خلفية نفس المانحين الحيوانات المنوية.
2. وينبغي أن تكون الفئران ~ 12 ز (3-4 اسابيع من العمر).
3. الحقن داخل الصفاق إجراء مع وحدة دولية من الحوامل 50-10 جونادوتروبين مصل الفرس (PMSG).
4. انتظر 46-48 ساعة.
5. الحقن داخل الصفاق إجراء مع وحدة دولية من 5-10 موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG).
6. حصاد البويضات 14-16 ساعة بعد الحقن قوات حرس السواحل الهايتية على النحو المبين أدناه.

3. الماوس الانتعاش الحيوانات المنوية والتلقيح الاصطناعي

1. قبل التلقيح الاصطناعي ، لكل من القش لإذابة ، وإعداد ما يلي ويوازن ما لا يقل عن ساعة واحدة في حاضنة 37 ₂ درجة مئوية أكسيد الكربون.
   1. طبق حضانة الحيوانات المنوية : واحدة طبق بيتري 35 ملم ، مع انخفاض متوسط ​​90 ميكرولتر من العلاج الحيوانات المنوية (STM) مغطاة بالنفط.
   2. قطع الطبق : لجمع البويضة من الحد الأقصى من 10 ثانيةuperovulated الإناث ، واحدة طبق بيتري 35 ملم مع 3 مل من المتوسط ​​التلقيح الاصطناعي.
   3. أطفال الأنابيب جيدا : للحصول على كل مجموعة من 5 اناث superovulated لأطفال الأنابيب ، واحدة جيدا طبق 4 جيدا مع 500 ميكرولتر من المتوسط ​​IVF (إذا كنت تستخدم 10 superovulated الإناث ، على سبيل المثال ، سوف تحتاج 2 الآبار...)
   4. غسل الأطباق : واحدة طبق بيتري 35 ملم مع 3 مل من البوتاسيوم المتوسط ​​البسيط الأمثل (KSOM) لغسل كل بئر من صحن IVF 4 - جيدا المستخدمة
   5. الطبق الثقافة : واحد 35 مم طبق بيتري مع 50 قطرات من ميكرولتر المتوسطة KSOM مغطاة بالنفط للثقافة الجنين من كل بئر من صحن التلقيح الاصطناعي.
2. إزالة القش من مكان LN ₂ و 37 درجة في حمام ماء C لمدة 2-3 دقائق.
3. إزالة القش من الحمام المائي ومسح لإزالة المياه الزائدة. جعل خفض الأولى بالقرب من عمود الجوية الأولى أقرب المكونات القطن. قطع القش في المدى المتوسط ​​ستكون هناك عمليات التلقيح الصناعي لا يزال عمود الهواء عمود مرئية قبل الحيوانات المنوية.
4. ثم قص نهاية القش في لياليecond الجوية العمود ، والحرص على تجنب قطع العمود الحيوانات المنوية. قطع بزاوية 45 -- وهذا سيجعل من الاسهل بكثير ان نضح الحيوانات المنوية.
5. نضح تعليق الحيوانات المنوية من نهاية القاصية من القش مع pipettor 200 ميكروليتر.
6. ضع تعليق الحيوانات المنوية في وسط انخفاض STM واحتضان الطبق عن 45-60 دقيقة في 37 ° C 5 ٪ CO ₂ الحاضنة.
7. خلال حضانة الحيوانات المنوية ، وتشريح ناقلة البيضات من الإناث superovulated في طبق القطع. استخدام إبرة ز 30 أو ملقط لتمزيق كل قناة البيض ، والإفراج عن المجمعات قزع - البويضة (COCs). وتجنب الدهون في الدم على المدى المتوسط ​​والتلقيح الاصطناعي وسائل الاعلام القذرة يجعل لاتخاذ خطوات اضافية الغسيل.
8. بمجرد أن تم تمزيق كل ناقلة البيضات ، ونقل COCs الإناث في الفترة من 5 إلى كل الآبار التلقيح الاصطناعي. عدد COCs التي تنتجها فرط الإباضة هي السلالة التي تعتمد جدا.
9. جمع الحيوانات المنوية من 10-15 ميكروليتر من هامش الانخفاض STM وتخصيبها one IVF جيدا ما يقرب من 14-16 ساعة بعد ينج قوات حرس السواحل الهايتيةection. كرر التسميد لاستخدامها بشكل جيد لكل منهما. وسوف يكون النهائي تركيز الحيوانات المنوية حوالي 1 مليون / مل.
10. الحيوانات المنوية والبويضات Coculture لمدة 4-6 ساعات في 37 درجة مئوية 5 ٪ CO ₂ الحاضنة.
11. غسل الأجنة مع الحد الأدنى من 2 مرات والثقافة KSOM في قطرات KSOM للتنمية في 37 درجة مئوية 5 ٪ CO ₂ الحاضنة.
12. تم احتساب معدل التلقيح الاصطناعي عن اثنين من الأجنة مرحلة الخلية من أصل مجموع البويضات بعد استخدام الثقافة بين عشية وضحاها.

4. ممثل النتائج

تم تجميد الحيوانات المنوية من 5 سلالات نهر تشارلز الماوس الفطرية. وتحسب نسب الحماية من خلال تقسيم الحيوانات المنوية المجمدة تقييم القيم التي الطازجة القيم تقييم الحيوانات المنوية. وكانت نسب الحماية من الحيوانات المنوية على الحركة 60.2 ٪ ، 81.3 ٪ ، 78.6 ٪ ، 66.5 ٪ ، 61.0 ٪ للC57BL/6NCrl ، 129S2/SvPasCrl ، FVB / NCrl ، DBA/2NCrl وBALB / cAnNCrl ، على التوالي. وكانت نسب الحماية للحركية السريعة التقدمية 47.3 ٪ ، 69.4 ٪ ، 57.0 ٪ ، 52.8 ٪ ، 54.1 ٪ في C57BL/6NCrl ، 129S2/SvPas CRL ، FVB / NCrl ، DBA/2NCrl وBALB / cAnNCrl على التوالي (الشكل 1).

كانت معدلات التلقيح الاصطناعي مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية بنسبة 55.7 ٪ ، 26.4 ٪ ، 87.3 ٪ ، 87.8 ٪ و 26.2 ٪ في C57BL/6NCrl ، 129S2/SvPasCrl ، FVB / NCrl ، DBA/2NCrl وBALB / cAnNCrl على التوالي (الشكل رقم 2) .

على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا من قبل الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية. وكانت هذه الخطوط في وقت لاحق استعادت بنجاح (حسب تعريف الصغار يعيشون ولد) من خلال التلقيح الاصطناعي في 4 سلالات الإناث (C57BL / 6 ، BALB / ج ، ديسيبل / 1 و129Sv) (الشكل 3).

الشكل 1. نسب حماية الحيوانات المنوية على الحركة التقدمية والحركة السريعة في الفئران

الشكل 2. إخصاب في المختبر مع الحيوانات المنوية المجمدة ، المذوبة في الفئران

3713fig3.jpg "/>
الشكل 3. التخصيب في المختبر مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية في الفئران المعدلة وراثيا

Discussion

منذ عام 1990 ، وقد ثبت تجميد الحيوانات المنوية باستخدام بروتوكول الأساسية رافينوز 18 ٪ و 3 ٪ الحليب الخالي من الدسم يمكن الاعتماد عليها في كثير من سلالات الفئران وجرى cryopreserved عدد كبير من خطوط الماوس ^{1،2،3،4،5،6،7.} وقد ارتبطت الأسباب الرئيسية لتلف خلايا الحيوانات المنوية خلال عملية التجميد والذوبان مع تشكيل الجليد ^8،9 و ¹⁰ أنواع الاكسجين التفاعلية. وقد تم التحقيق مع مكملات الزبالين الجذور الحرة ، مثل الأحماض الأمينية ، والحد من العوامل ، مثل monothioglycerol ، في المتوسط ​​، وتجميد ثبت أن زيادة كبيرة في معدل التلقيح الاصطناعي مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية في السلالات الفطرية بما في ذلك 6 / C57BL ^11،6.

في هذا البروتوكول ، وضعنا انا جديد • كرو عدة لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس عن طريق الاستفادة المثلى من اتفاقية السلام الشامل الأساسية مع المواد المضادة للاكسدة المتاحة تجاريا وحاصرات الجليد وعن طريق تعديل تجميد الحيوانات المنوية وإجراء عمليات التلقيح الصناعي. نسب الحماية من الحيوانات المنوية على الحركةشوهد (> 60 ٪) والحركة التقدمية السريع (> 45 ٪) لسلالات الحيوانات المنوية من خمس الماوس الفطرية المجمدة مع عدة أنا كرو •. وتحسنت بشكل ملحوظ في مرحلة الجنين 2 - الخلية معدل التنمية مع الحيوانات المنوية المجمدة ، المذوبة في سلالات الفأر 5 الفطرية مقارنة ذلك مع اتفاق السلام الشامل الأساسية ^11،6.

في استخدام عدة ، المستخدم بإنشاء تعليق الحيوانات المنوية التي تتركز في الفترة من 2 تجميد الحيوانات المنوية للذكور كل سطر. إلا بنسبة لا تتجاوز 15 قش تجميد عملية سريعة وسهلة وتشغل أقل مساحة التخزين لتخزين قصيرة أو طويلة الأجل. في معظم الأحيان ، يمكن استرداد الماوس عن طريق خطوط ذوبان فقط 1 أو 2 القش.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPA	Charles River Laboratories		Provided with kit
STM	Charles River Laboratories		Provided with kit
IVF medium	Charles River Laboratories		Provided with kit
0.25 ml plastic straw	Charles River Laboratories		Provided with kit
Sperm freezing canister	Charles River Laboratories		Provided with kit
Cane and goblet	Charles River Laboratories		Provided with kit
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Should be embryo tested
KSOM medium	EMD Millipore	MR-106-D
35 mm Petri dish	Falcon BD	351008
Heat sealer	ABTEC	TISH-200
4-well multidish	Nalge Nunc international	73521-424
Pipettor	Gilson, Inc.
Pipette tips	Various
37°C + 5% CO2 incubator	Various
LN2 storage system	Various
37°C water bath	VWR international	89032-196
Stereomicroscope	Nikon Instruments	SMZ800
hCG	Intervet Inc.
PMSG	EMD Millipore	367222
1cc syringe w/ 26G 3/8 needle	BD Biosciences	BD309625
Micro dissecting scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
30 gauge ½ needle	BD Biosciences	305106
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6802
Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135, RS-5110, RS-5005