Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

Резюме

Здесь мы показываем, недавно разработанный я • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши. Два-клеточной стадии развития эмбриона с замороженной спермы талой была улучшена последовательно в 5 мышей штаммы с использованием этого комплекта. За 1,5 лет, 49 линий генетически модифицированных мышей были заархивированы спермой криоконсервации с I • Крио комплект, а затем успешно извлечены с помощью ЭКО.

Аннотация

Тысячи новых генетически модифицированных (ГМ) линий мышей были созданы с момента появления трансгенез и нокаут технологий. Многие из этих ценных животных существуют только как живых животных, без каких-либо запасной план на случай чрезвычайной ситуации. Криоконсервация эмбрионов может обеспечить эту резервную копию, но требует больших затрат, может быть длительная процедура, и как правило, требуется большое количество животных для достижения успеха. С открытием, что мышь спермой может быть успешно криоконсервированных с основными криопротектор (CPA), состоящий из 18% раффиноза и 3% обезжиренного молока, спермы криоконсервация стала приемлемой и экономически эффективной процедуры для архивирования, распределения и восстановление этих ценных штаммов .

Здесь мы показываем, недавно разработанный я • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши. Сперма из пяти часто используемых штаммов инбредных мышей были заморожены с помощью этого комплекта, а затем восстановлен. Высшее защиты отношений подвижность сперматозоидов (>60%) и быстрое прогрессивная подвижность (> 45%) по сравнению с контролем (основной CPA) были замечены на сперму замороженных к этому набору в 5 инбредных линий мышей. Два клеточной стадии развития эмбриона после ЭКО с восстановленных сперма была улучшена последовательно во всех 5 мыши штаммов рассмотрены. За 1,5 лет, 49 линий ГМ-мыши были заархивированы спермой криоконсервации с I • Крио комплект и позже извлечены с помощью ЭКО.

протокол

1. Криоконсервация спермы мыши

1. Для каждой линии, которая будет криоконсервированных, подготовить следующие перед началом.
   1. 1 скважина 4-а блюдо с 240 л комплекта CPA
   2. 15 криоконсервации спермы соломинки следующим
      1. Подключите 0,25 мл соломинки для 1 мл шприцы с ватный тампон ближе всего к шприц. В каждом из соломы, нагрузка 8 см (примерно 160 мкл) среднего ЭКО, то 1 см воздуха. Этикетка соломинки с названием линии должны быть сохранены.
2. LN ₂ должна быть 15 см глубиной в пене окно. Закрыть крышкой.
3. Эвтаназии 2 самцов мышей из каждой строки будет криоконсервированных. Мыши должны быть от 10 до 60 недель. Удалите два хвостовых epididymides вместе с семявыносящих протоков от каждой мыши.
4. Место epididymides в ранее подготовленный CPA содержащих также из 4-а блюдо (шаг 1.1).
5. Сделайте 5-7 продольные разрезы в каждой придатка яичка и мягкосжать каждый семявыносящих протоков подтолкнуть сперму из.
6. Встряхните CPA и придатка смесь вручную осторожно при комнатной температуре в течение 3-5 минут. Это позволит спермы выплыть.
7. Использование заранее подготовленный соломы, аспирации 5 мм (примерно 10 мкл) спермы подвески и 1 см воздуха.
8. Повторите эту процедуру до в общей сложности 15 соломинку. Загрузка и печать соломинки в течение 10 минут для лучшей спермы выживания.
9. Тепло печать с обеих сторон соломы тщательно. Место соломинки в морозильной канистры со спермой колонки в первую очередь.
10. Прикрепить 1 мл пипетки предоставляются как часть комплекта для канистру расширить ручкой. Место канистру в LN ₂ в пене ящик через отверстие в крышке. Разрешить канистру плавать вертикально в LN ₂ в течение 10 минут.
11. Погрузитесь в канистру LN2. Сперма теперь криоконсервированных и могут быть перемещены в долгосрочной LN ₂ хранения.
12. Контейнер не должен использоваться дляСледующая строка, пока она разогревается до комнатной температуры.

2. Мышь суперовуляции

1. Как правило, используют молодых самок мышей той же фоне, как доноров спермы.
2. Мыши должны быть ~ 12 г (3-4 недель).
3. Выполните внутрибрюшинного введения с 5-10 МЕ Беременные кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG).
4. Подождите 46-48 часа.
5. Выполните внутрибрюшинного введения с 5-10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
6. Урожай ооцитов 14-16 часов после инъекции ХГЧ, как описано ниже.

3. Мышь восстановления спермы и ЭКО

1. Перед ЭКО, для каждого соломы можно размораживать, готовить следующий и равновесие, по крайней мере один час в 37 ° C CO ₂ инкубатора.
   1. Сперма инкубации блюдо: одна 35 мм чашки Петри, с 90 мкл капли спермы лечения среды (СТМ) покрыты маслом.
   2. Резка блюдо: Для ооцитов коллекцию из более 10 секuperovulated самок, одна 35 мм чашки Петри с 3 мл среды ЭКО.
   3. ЭКО хорошо: Для каждой группы из 5 superovulated женщин для проведения ЭКО, одну лунку 4 также блюдо с 500 мкл среды ЭКО (если вы используете 10 superovulated женщин, например, вам потребуется 2 скважины...)
   4. Стиральная блюдо: одна 35 мм чашки Петри с 3 мл калия простого оптимизированный среды (KSOM) для промывки каждую лунку 4-хорошо ЭКО блюдо использоваться
   5. Культура блюдо: одна 35 мм чашки Петри с 50 мкл капли KSOM среды покрыты маслом для культивирования эмбрионов из каждой лунки этого блюда ЭКО.
2. Удалить из соломы LN ₂ и место в 37 ° С на водяной бане 2-3 минут.
3. Удалить соломы с водяной бани и протереть, чтобы удалить лишнюю воду. Сделайте первый срезаны близко к первой колонке воздуха ближайшее ватный тампон. Вырезать соломы в среднесрочной ЭКО еще будет столб воздуха обнаружены до начала спермы колонке.
4. Затем вырежьте конце соломы сecond столб воздуха, соблюдая осторожность, чтобы избежать сокращения спермы колонке. Вырезать под углом 45 - это будет сделать намного легче для аспирации спермы.
5. Аспирацию спермы отстранение от дистального конца соломы с 200 мкл пипетки.
6. Место спермы суспензии в центре STM падение и инкубировать блюдо в течение 45-60 минут при 37 ° C 5% СО ₂ инкубатора.
7. Во время инкубации спермы, рассекать яйцеводов из superovulated женщин в резки блюдо. Используйте иглу 30 г или щипцами рвать каждый яйцевод, выпустив кучево-ооцитов комплексов (КОК). Избегайте жира и крови в среде ЭКО как грязным средств массовой информации делает дополнительные шаги для стирки.
8. После того как все яйцеводы были оторваны, передача КОК из 5 сук каждому ЭКО скважин. Число КОК производства суперовуляции очень штамм зависимыми.
9. Сбор 10-15 мкл спермы от периферии STM падение и удобрять один ЭКО также около 14-16 часов после ХГЧ Injперегиба. Повторите оплодотворения для каждой скважины используются. Конечная концентрация сперматозоидов будет примерно 1 млн / мл.
10. Спермы и ооцитов Coculture в течение 4-6 часов при 37 ° C 5% СО ₂ инкубатора.
11. Промыть эмбрионы с KSOM минимум в 2 раза и культуры в каплях KSOM для развития в 37 ° C 5% СО ₂ инкубатора.
12. ЭКО ставка была рассчитана как два клеточной стадии эмбрионов из общего ооциты использовать после ночной культуры.

4. Представитель Результаты

Сперма от 5 Charles River мыши инбредных линий были заморожены. Защита коэффициенты рассчитываются путем деления величины оценки замороженных сперматозоидов свежим значений оценки спермы. Защита отношения подвижность сперматозоидов была 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% для C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно. Защита отношения для быстрого прогрессивная подвижность была 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% в C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно (рис. 1).

ЭКО ставки с замороженной спермы талой были 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% и 26,2% в C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно (рис. 2) .

За 1,5 лет, 49 линий ГМ-мыши были заархивированы спермой криоконсервации. Эти строки были позже успешно восстановлен (как определено в живых щенков родившихся) по ЭКО в 4-х женских штаммов (C57BL / 6, BALB / с, DBA / 1 и 129Sv) (рис. 3).

Рисунок 1. Защита коэффициенты подвижности сперматозоидов и быстрая прогрессивная подвижность у мышей

Рисунок 2. Экстракорпоральное оплодотворение с Frozen-талого спермы у мышей

3713fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Экстракорпоральное оплодотворение с Frozen-талого спермы у мышей GM

Обсуждение

С 1990 года основной протокол замораживания спермы, используя 18% раффиноза и 3% обезжиренного молока было доказано, надежный во многих штаммов мышей и большое количество мышей линии были криоконсервированных ^{1,2,3,4,5,6,7.} Основными причинами повреждения сперматозоидов во время замораживания и размораживания процесса были связаны с образованием льда ^8,9 и активных форм кислорода ^10. Дополнение с свободных радикалов, таких как аминокислоты, и восстановители, такие как monothioglycerol, в морозильной среды исследовано и доказано, существенно увеличить скорость ЭКО с замороженными талой спермы в инбредных линиях, включая C57BL / 6, ^11,6.

В настоящее время протокол, мы разработали новую I • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши за счет оптимизации основных CPA с имеющимися в продаже антиоксидантов и льда блокаторы и, изменив замораживания спермы и процедуры ЭКО. Защита отношения подвижность сперматозоидов(> 60%) и быстрое прогрессивная подвижность (> 45%) были замечены на сперму из пяти инбредных линий мышей с замороженными я • Крио комплект. 2-клеточной стадии развития эмбриона скорости с замороженной спермы в талой 5 мышей инбредных линий была заметно улучшилась по сравнению с основными CPA ^11,6.

При использовании комплект, пользователь создает концентрированную суспензию сперматозоидов путем замораживания спермы от 2 кобеля для каждой линии. По только замораживания 15 соломинки процесс происходит быстро, легко и занимает меньше места для краткосрочного или длительного хранения. В большинстве случаев, мыши линии могут быть извлечены с помощью оттаивания только 1 или 2 соломинку.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPA	Charles River Laboratories		Provided with kit
STM	Charles River Laboratories		Provided with kit
IVF medium	Charles River Laboratories		Provided with kit
0.25 ml plastic straw	Charles River Laboratories		Provided with kit
Sperm freezing canister	Charles River Laboratories		Provided with kit
Cane and goblet	Charles River Laboratories		Provided with kit
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Should be embryo tested
KSOM medium	EMD Millipore	MR-106-D
35 mm Petri dish	Falcon BD	351008
Heat sealer	ABTEC	TISH-200
4-well multidish	Nalge Nunc international	73521-424
Pipettor	Gilson, Inc.
Pipette tips	Various
37°C + 5% CO2 incubator	Various
LN2 storage system	Various
37°C water bath	VWR international	89032-196
Stereomicroscope	Nikon Instruments	SMZ800
hCG	Intervet Inc.
PMSG	EMD Millipore	367222
1cc syringe w/ 26G 3/8 needle	BD Biosciences	BD309625
Micro dissecting scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
30 gauge ½ needle	BD Biosciences	305106
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6802
Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135, RS-5110, RS-5005