Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Riepilogo

Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell'embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l'utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

Abstract

Migliaia di nuovi geneticamente modificati (GM) ceppi di topi sono stati creati dopo l'avvento di tecnologie di transgenesi e di eliminazione diretta. Molti di questi animali preziosi esistono solo come gli animali vivi, senza alcun piano di backup in caso di emergenza. Crioconservazione degli embrioni in grado di fornire il backup, ma è costoso, può essere una procedura lunga e richiede generalmente un gran numero di animali per il successo. Dopo la scoperta che gli spermatozoi del mouse può essere crioconservati con successo con un agente di base crioprotettivi (CPA), composto da 18% raffinosio e il 3% di latte scremato, la crioconservazione degli spermatozoi è diventata una procedura accettabile e conveniente per l'archiviazione, la distribuzione e il recupero di questi ceppi di valore .

Qui mostriamo un nuovo sviluppo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Sperma di cinque ceppi di uso comune di topi inbred sono stati congelati con questo kit e poi recuperato. Rapporti di protezione più elevato della motilità degli spermatozoi (>60%) e la motilità progressiva rapida (> 45%) rispetto al controllo (di base CPA) sono stati osservati per lo sperma congelato con questo kit di 5 ceppi di topi inbred. Due stadi di sviluppo embrionale delle cellule dopo la fecondazione in vitro con lo sperma recuperato è stato migliorato costantemente in tutte e 5 ceppi di topi esaminati. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e successivamente recuperato da fecondazione in vitro.

Protocollo

1. Topo crioconservazione degli spermatozoi

1. Per ogni linea da crioconservati, i seguenti elementi prima di iniziare.
   1. 1 vasca di un 4-ben piatto con 240 l di kit CPA
   2. 15 cannucce crioconservazione degli spermatozoi come segue
      1. Collegare il 0,25 ml cannucce al siringhe da 1 ml con il tappo di cotone più vicino alla siringa. In ogni paglia, carico di 8 cm (circa 160 microlitri) di media FIV, quindi 1 cm di aria. Etichettare il cannucce con il nome della linea da conservare.
2. LN ₂ dovrebbe essere di 15 cm di profondità nella casella di schiuma. Chiudere il coperchio.
3. Euthanize 2 topi maschi da ogni riga di essere crioconservati. I topi dovrebbero essere tra 10 e 60 settimane di età. Rimuovere le due epididimi caudale insieme al dotto deferente di ogni topo.
4. Posizionare il epididimi nel precedentemente preparato CPA contenenti anche di un 4-ben piatto (passo 1.1).
5. Fare 5-7 tagli longitudinali in ogni epididimo e delicatamentespremere ogni dotto deferente per spingere lo sperma fuori.
6. Agitare la miscela e CPA epididimo a mano delicatamente a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Questo permetterà spermatozoi a nuotare fuori.
7. Utilizzando la paglia precedentemente preparato, aspirare 5 mm (circa 10 microlitri) di sospensione di spermatozoi e quindi 1 cm di aria.
8. Ripetere questa operazione fino a un totale di 15 cannucce. Carico e di tenuta cannucce entro 10 minuti per la sopravvivenza degli spermatozoi migliori.
9. Si chiude entrambi i lati della paglia con attenzione. Posizionare il cannucce nel contenitore con la colonna congelamento dello sperma prima.
10. Fissare il 1 pipetta ml fornito come parte del kit per il canestro di estendere la maniglia. Posizionare il contenitore in LN ₂ nella casella schiuma attraverso il foro nel coperchio. Lasciare che il canestro di galleggiare verticalmente nel LN ₂ per 10 minuti.
11. Immergere il contenitore nel LN2. Lo sperma è ora crioconservati e può essere spostato lungo termine LN ₂ di stoccaggio.
12. Il contenitore non deve essere utilizzato perla riga successiva fino a quando è riscaldato a temperatura ambiente.

2. Topo superovulazione

1. In generale, l'uso di giovani topi di sesso femminile lo stesso sfondo i donatori di sperma.
2. I topi devono essere ~ 12 g (3-4 settimane di età).
3. Eseguire un'iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gravidanza siero di cavalla gonadotropina (PMSG).
4. Attendere 46-48 ore.
5. Eseguire un'iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gonadotropina corionica umana (hCG).
6. Ovociti vendemmia 14-16 ore dopo l'iniezione di hCG come descritto di seguito.

3. Topo di recupero degli spermatozoi e fecondazione in vitro

1. Prima di fecondazione in vitro, per ogni paglia di essere scongelati, i seguenti elementi ed equilibrare per almeno un'ora a 37 ° C CO ₂ incubatore.
   1. Spermatozoi piatto di incubazione: un piatto 35 millimetri Petri, con un calo 90 l di media sperma trattamento (STM) ricoperto di olio.
   2. Taglio piatto: Per la raccolta degli ovociti da un massimo di 10 superovulated femmine, una 35 millimetri Petri piatto con 3 ml di terreno fecondazione in vitro.
   3. FIV bene: per ogni gruppo di 5 femmine superovulated per la FIV, un pozzetto di un piatto ben 4 con 500 l di media FIV (se si utilizza superovulated 10 femmine, per esempio, avrete bisogno di 2 pozzi...)
   4. Lavaggio delle stoviglie: una piatto 35 millimetri Petri con 3 ml di simplex di potassio medio ottimizzato (KSOM) per lavare ogni pozzetto del 4-ben piatto FIV utilizzate
   5. Cultura piatto: un piatto di 35 millimetri di Petri con 50 gocce l di media KSOM ricoperto di olio per coltura degli embrioni da ogni pozzetto del piatto FIV.
2. Rimuovere una cannuccia da LN ₂ e mettere in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2-3 minuti.
3. Rimuovere la paglia dal bagnomaria e pulire per rimuovere l'acqua in eccesso. Effettuare il primo taglio vicino alla colonna d'aria al più vicino la spina cotone. Tagliare la paglia nel medio FIV ci saranno ancora una colonna d'aria visibile prima della colonna sperma.
4. Poi tagliare la fine della paglia nel seconda colonna d'aria, facendo attenzione a evitare di tagliare la colonna sperma. Tagliata in un angolo di 45 - questo renderà molto più facile per aspirare lo sperma.
5. Aspirare la sospensione dello sperma a partire dalla fine distale della paglia con una pipetta 200 l.
6. Posizionare la sospensione spermatozoi nel centro della goccia STM e incubare il piatto per 45-60 minuti a 37 ° C 5% CO ₂ incubatore.
7. Durante l'incubazione degli spermatozoi, sezionare gli ovidotti delle femmine superovulated nel piatto di taglio. Utilizzare un ago 30 g o pinze per strappare ogni ovidotto, rilasciando il cumulo-ovocita complessi (COC). Evitare grassi e sangue nel medio FIV come sporco dei media rende fasi di lavaggio in più.
8. Una volta che tutti gli ovidotti sono stati strappati, trasferire i contraccettivi orali combinati da 5 femmine per ogni pozzi fecondazione in vitro. Il numero di COC prodotta da superovulazione è molto sforzo dipendente.
9. Raccogliere 10-15 ml di sperma dalla periferia della goccia STM e fertilizzare uno FIV e circa 14-16 ore dopo hCG injezione. Ripetere per ogni fecondazione ben utilizzato. Concentrazione dello sperma finale sarà di circa 1 milione / ml.
10. Co-coltura spermatozoi e ovociti per 4-6 ore a 37 ° C 5% CO ₂ incubatore.
11. Lavare gli embrioni con KSOM un minimo di 2 volte e la cultura in gocce KSOM per lo sviluppo a 37 ° C 5% CO ₂ incubatore.
12. Tasso di fecondazione in vitro è stato calcolato come embrioni di cellule a doppio stadio di ovociti totale utilizzata dopo una notte della cultura.

4. Rappresentante Risultati

Spermatozoi dal 5 Charles River ceppi di topi inbred è stato congelato. Rapporti di protezione sono calcolati dividendo gli spermatozoi congelati i valori di valutazione da valori freschi valutazione degli spermatozoi. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi sono stati 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% per C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente. Rapporti di protezione per una rapida motilità progressiva sono stati 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 1).

I tassi di fecondazione in vitro con gli spermatozoi congelati-scongelati sono stati il ​​55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% e 26,2% nel C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 2) .

Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi. Queste linee sono stati successivamente recuperati con successo (come definito da cuccioli nati vivi) da FIV in 4 ceppi di sesso femminile (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 e 129Sv) (Fig. 3).

Figura 1. I rapporti Tutela della motilità spermatica e la motilità progressiva rapida nei topi

Figura 2. Fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in topi

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Figura 3. Fecondazione in vitro con spermatozoi congelati-scongelati in topi GM

Discussione

Dal 1990, la base del protocollo di congelamento degli spermatozoi con il 18% raffinosio e il 3% di latte scremato è stato dimostrato affidabile in molti ceppi di topi e un gran numero di linee del mouse sono stati crioconservati ^{1,2,3,4,5,6,7.} Le principali cause di danni alle cellule dello sperma durante il processo di congelamento e scongelamento sono stati associati con la formazione di ghiaccio ^8,9 e le specie reattive dell'ossigeno ^10. La supplementazione con pulitori del radicale libero, come gli amminoacidi, e agenti riducenti, come monotioglicerolo, nel mezzo di congelamento è stato studiato e dimostrato di aumentare notevolmente tasso di fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in ceppi inbred compreso il C57BL / 6 ^11,6.

Nel presente protocollo, abbiamo sviluppato un nuovo I • Cryo kit per la crioconservazione degli spermatozoi del mouse attraverso l'ottimizzazione di base disponibili in commercio CPA con antiossidanti e inibitori del ghiaccio e modificando il congelamento degli spermatozoi e la procedura di fecondazione in vitro. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi(> 60%) e la motilità progressiva rapida (> 45%) sono state osservate per gli spermatozoi provenienti da cinque ceppi di topi inbred congelati con la Cryo • I kit. Il 2-cellula embrionale tasso fase di sviluppo con lo sperma congelato, scongelato in 5 ceppi di topi inbred è stato notevolmente migliorato rispetto a quello con base ^11,6 CPA.

Utilizzando il kit, l'utente crea una sospensione concentrata di spermatozoi dello sperma di congelamento di 2 maschi per ogni linea. Solo da congelamento 15 cannucce il processo è veloce, facile e occupa meno spazio di memorizzazione per l'archiviazione a breve oa lungo termine. La maggior parte delle volte, le linee del mouse può essere recuperato da scongelamento solo 1 o 2 cannucce.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPA	Charles River Laboratories		Provided with kit
STM	Charles River Laboratories		Provided with kit
IVF medium	Charles River Laboratories		Provided with kit
0.25 ml plastic straw	Charles River Laboratories		Provided with kit
Sperm freezing canister	Charles River Laboratories		Provided with kit
Cane and goblet	Charles River Laboratories		Provided with kit
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Should be embryo tested
KSOM medium	EMD Millipore	MR-106-D
35 mm Petri dish	Falcon BD	351008
Heat sealer	ABTEC	TISH-200
4-well multidish	Nalge Nunc international	73521-424
Pipettor	Gilson, Inc.
Pipette tips	Various
37°C + 5% CO2 incubator	Various
LN2 storage system	Various
37°C water bath	VWR international	89032-196
Stereomicroscope	Nikon Instruments	SMZ800
hCG	Intervet Inc.
PMSG	EMD Millipore	367222
1cc syringe w/ 26G 3/8 needle	BD Biosciences	BD309625
Micro dissecting scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
30 gauge ½ needle	BD Biosciences	305106
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6802
Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135, RS-5110, RS-5005