JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف خلية شوان (SC) مقايسة الهجرة التي الطوائف المنبوذة هي قادرة على تطوير محاور عصبية على طول تمديد.

Abstract

تطوير الأعصاب الطرفية هو عملية مثيرة للاهتمام. الخلايا العصبية ترسل محاور عصبية لعصب أهداف محددة، والتي غالبا ما تكون في البشر أكثر من 100 سم بعيدا عن سوما من الخلايا العصبية. بقاء الخلايا العصبية خلال التنمية يتوقف على عوامل النمو المشتقة من الهدف ولكن أيضا على دعم خلايا شوان (SCS). محاور عصبية لهذه الغاية ensheath SC من منطقة سوما العصبية (أو الانتقال من المركزية إلى الجهاز العصبي المحيطي) إلى المشبك أو الموصل العصبي العضلي. خلايا شوان هي مشتقات من قمة العصبية والسلائف وتهاجر على طول محاور عصبية الناشئة حتى يتم تغطية كامل مع محور عصبي الطوائف المنبوذة. وهذا يدل على أهمية الهجرة SC لتطوير النظام العصبي الطرفي وتشدد على ضرورة التحقيق في هذه العملية. من أجل تحليل SC التنمية، هناك حاجة إلى الإعداد الذي بجانب اللجان الدائمة التي تشمل أيضا الركيزة الفسيولوجية للهجرة، ومحور عصبي. بسبب النمو داخل الرحم (المصحف العضلة). للتحايل على هذا، وتكييفها نحن متفوقة عنق الرحم العقدة تقنية يزدرع (SCG). على العلاج مع عامل نمو العصب (NGF) إإكسبلنتس SCG توسيع نطاق محاور عصبية، تليها السلائف SC المهاجرة على طول محاور عصبية من العقدة إلى المحيط. جمال هذا النظام هو أن يتم اشتقاق SC من بين مجموعة من SC الذاتية وأنها تهاجر على طول محاور عصبية من الفسيولوجية الخاصة التي تنمو في نفس الوقت. هذا النظام هو الفتنة خاصة، لأنه لا يمكن تحليل تطور على طول محاور عصبية من قبل SC الوقت الفاصل بين التصوير، وفتح إمكانيات أخرى للحصول على نظرة ثاقبة الهجرة SC.

Protocol

1. إعداد الهلام الكولاجين

  1. إعداد وسيلة الأوراق المالية، والتي تحتوي على 455 ميكرولتر 10X MEM، 112 ميكرولتر NaHCO 7.5٪ 3، 50 ميكرولتر الجلوتامين وهيدروكسيد الصوديوم. تركيز وكمية من هيدروكسيد الصوديوم يعتمد على إعداد الكولاجين الفئران الذيل (انظر 1.2)، والحجم النهائي من الأسهم المتوسطة كونها ميكرولتر 1000.
  2. إعداد الفئران الذيل الكولاجين وفقا لEbendal (1). تخزين الكولاجين في الحل C. ° 4 لا يمكن A تدهور الكولاجين الحل يمكن ملاحظتها. بعد إعداد دفعة جديدة، وتقدير تركيز هيدروكسيد الصوديوم اللازمة لمخزون المتوسطة (انظر 1.1). استخدام الرقم الهيدروجيني، مؤشر على متوسطة لمدة المعايرة من المبلغ وتركيز هيدروكسيد الصوديوم. 800 ميكرولتر الحمضية الفئران الذيل الكولاجين يجب أن يتحول الظل الأحمر عند مزجه مع 210 ميكرولتر من الأسهم المتوسطة. إذا كان تركيز هيدروكسيد الصوديوم منخفض جدا فإن الحل الكولاجين بدوره الصفراء، ويرجع ذلك إلى مؤشر الرقم الهيدروجيني للوسط. إضافة إلى الكولاجين والمتوسطة دون همز مزيجucing الفقاعات. تنفيذ هذه الخطوات على الجليد. البلمرة يحدث بعد 2 ساعة بعد أن تم خلط الحل الكولاجين والمتوسطة الأسهم وحضنت الحل الجديد في C. ° 37 اختبار هذه قبل بدء التجربة. اخلطي 1.3) 800 ميكرولتر من محلول الكولاجين مع ميكرولتر 210 من الأسهم المتوسطة (انظر 1.2). مكان 100 ميكرولتر من هذا الحل في الآبار لشريحة 8 غرفة البئر. احتضان الشرائح في 37 ° C، 5٪ CO 2 و الظروف الرطبة في خلية حاضنة الثقافة. إعداد المواد الهلامية الكولاجين تحت خلية مقاعد البدلاء الثقافة وظروف معقمة. الكولاجين gelatinizes في حدود 2 ساعة.

2. تشريح SCGs الجنينية

  1. أجنة الفئران الحوامل حصاد الوقت (E16-18) من الرحم والاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني حتى مزيد من الحاجة.
  2. تشريح جنين واحد من السلى. قطع رأس الجنين الذيلية على مستوى الترقوة. إصلاح الرأس على طبق أسفل السيليكون مع "الإبر الحشرات". الجانب البطنية من الرأس أن وجها للكد لديك لرؤية المنطقة تحت الفك السفلي. التثبيت تمكن أسهل الإعداد.
  3. إزالة الجلد من المنطقة تحت الفك السفلي الأيمن والأيسر ومعها النسيج الضام تحت الجلد.
  4. إزالة الغدد اللعابية تحت الفك السفلي من موقعها لمسح إطلاله على اللامية، والعضلات، والعضلات infrahyoidal القصية الترقوية الخشائية.
  5. إزالة هذه العضلات بعناية لمسح الرأي على الحنجرة والقصبة الهوائية و. إزالة القصبة الهوائية والحنجرة. الشرايين السباتية هي مرئية ثم على كلا الجانبين على العضلات أمام الفقار. يقع SCG في التشعب من الشرايين السباتية ولها شكل بيضاوي. إزالة بعناية العقد ووضعها في برنامج تلفزيوني. إزالة العقد بلطف من أدوات تشريح إذا كانت متمسكة بها. من المفيد استخدام ملقط فضلا عن حامل الإبرة التي شنت مع "إبرة الحشرات" لإزالة SCG.
  6. مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، تخزين في درجة حرارة الغرفة العقد في PBS حتى تقوم تشريح enouغ العقد. ثم لتنظيف العقد من الأوعية الدموية والنسيج الضام. أداء تشريح SCG والتنظيف تحت المجهر تشريح وضعت تحت مقعد الصفحي تدفق.
  7. وأخيرا، ضع العقد explanted على المواد الهلامية الكولاجين مهيلم بمساعدة حقنة الإبر التي شنت على حقنة لتسهيل التعامل معها.
  8. احتضان إإكسبلنتس SCG على الكولاجين مهيلم في خلية حاضنة الثقافة في C ° 37، مع ظروف CO 2 و 5٪ الرطبة.

3. علاج إإكسبلنتس SCG

  1. بعد ساعة حضانة 1-2، تغطية الكولاجين يزدرع SCG مع 100 ميكرولتر تحتوي على Neurobasal خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على B27 الملحق، الجلوتامين والمضادات الحيوية. الآن آبار الشرائح غرفة تحتوي على حجم ميكرولتر من 200 (100 و 100 ميكرولتر هلام المتوسطة ميكرولتر). إضافة آخر ميكرولتر 200 من المتوسط، لكن الآن NGF تحتوي على (60 نانوغرام / مل) لتسهيل النمو محواري. وفقا لذلك تركيز النهائي هو 30 NGF نانوغرام / مل.
    1. للتحقيق في بداية الهجرة SC، إضافة عوامل إضافية مباشرة في اليوم في المختبر 0 (DIV0). حل العوامل على المدى المتوسط ​​NGF تحتوي على تركيز مزدوج في حاجة (2).
    2. من أجل تحليل أثر على الطوائف المنبوذة، التي بدأت بالفعل المهاجرة على طول محاور عصبية، إضافة إلى عوامل إضافية حتى DIV3 DIV4 (توقف المحتملة للتجربة). تحقيقا لهذه الغاية، وإزالة بعناية 180 ميكرولتر من الحل، في DIV3، وأضف 200 ميكرولتر NGF الوسيلة الجديدة التي تحتوي على والعوامل الإضافية من الإهتمام في تركيز مزدوج (2).

4. الوقت الفاصل بين التصوير

استخدام المجهر المقلوب لتحليلات. ويمكن استخدام مختلف الأهداف، وتحديد مجال الرؤية والتكبير. أحد الجوانب الهامة، ومع ذلك، هي المسافة عمل الهدف المستخدمة، كما يتم تنفيذ التصوير من إإكسبلنتس SCG من خلال شريحة زجاجية والكولاجين فيهلام. وأظهرت معدل الإطار تسجيل نتائج جيدة 1/10-30 دقيقة (2). ومع ذلك، فإن هذا الجانب لابد من تعديلها لمسألة علمية. ويمكن استخدام الكاميرا CCD الطبيعي الحصول على الصور. الفاصل الزمني للتصوير وغرفة الحضانة ثقافة الخلية يجب أن تعلق على مرحلة من مراحل المجهر. احتضان الأنسجة أثناء التصوير في C ° 37، مع ظروف CO 2 و 5٪ الرطبة. بدء نظام واحد ساعة الحضانة قبل بدء التصوير. وهذا يسمح للأجزاء المجهر (على سبيل المثال الهدف) بما في ذلك الشريحة غرفة للتكيف مع درجات الحرارة ودرجة الحرارة التي يسببها يمنع الانجرافات. تحديد مجالات معينة للتحليل (داخل على يزدرع وبين إإكسبلنتس مختلفة) مع مساعدة من البرنامج ومرحلة المجهر البرمجيات التي تسيطر عليها الآلية (الإعداد multiposition) لتحاليل مختلفة في وقت واحد من الشروط المطبقة على إإكسبلنتس SCG. الوقت الفاصل بين لأنسجة wildtype التصوير وكذلك الأنسجة من الحيوانات المعدلة وراثيا يمكن استخدامهابمناسبة الطوائف المنبوذة (s100b: GFP) (3). لfluorophores التصوير مصدر ضوء الفلورسنت لابد من تنفيذها في الإعداد micropscope. استخدام الفلاتر القياسية.

5. الكمي لمسافات الهجرة SC

  1. عند نقطة النهاية (DIV4 على سبيل المثال)، وتحديد المواد الهلامية الكولاجين مع PFA 4٪ في الشريحة غرفة للساعة 3-4. غسل المواد الهلامية على التوالي الكولاجين 5 مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS. تطبيق بروتوكولات موحدة لكيمياء سيتولوجية مناعية (2). إذا كنت جديدا على إعداد SCGs، التحقق من هوية العقدة العقدة باعتبارها متعاطفة من قبل المناعية ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH) علامة مشتركة لخلايا كاتيكولاميني. خلال المناعية (الأجسام المضادة الأولية بعد)، نقل المواد الهلامية التي تحتوي على الكولاجين يزدرع إلى 24 لوحات جيدة، والتي لها حجم أكبر، وهو مفيد لغسل المواد الهلامية.
  2. بعد المناعية، بعناية وضع المواد الهلامية الكولاجين على الشرائح الزجاجية. بعنايةإزالة الحل المتبقي، والسماح للالكولاجين جاف / يتقلص إلى بعدين. وهذا يسمح بسهولة قياسات المسافات (2). بعد ذلك، تحميل العينات.
  3. وأخيرا، قياس المسافات الهجرة مع مساعدة من برنامج (NIH) فيجي. وهناك حاجة إلى أي إضافات خاصة لهذه الغاية. للسماح القياسات الصحيحة في ميكرومتر، والتحقق من بيانات التعريف الصحيح التصوير وإعدادات تحت فيجي والصورة والحجم. استخدام فيجي أيضا لتقدير حجم الخلايا.

النتائج

ومما يسهل نمو محور عصبي من SCG إإكسبلنتس على العلاج مع NGF (4) (الشكل فيلم S1 مخطط 1 مخطط). هذه العملية مرئيا بسهولة من قبل أي المجهر المقلوب، ويمكن أن يتبعه الوقت الفاصل بين التصوير (فيلم S2). إذا كان العالم هو جديد لتشريح SCG من أجنة الفئران نوصي بشدة المصادق?...

Discussion

تطوير الجهاز العصبي المحيطي هي عملية مثيرة. عند اكتمال التنمية، ومغمد محاور عصبية من قبل اللجان الدائمة على طول، والتي يمكن، في البشر، غالبا ما تكون أكثر من 100 سم. تحقيقا لهذه الغاية العدد الصحيح من الطوائف المنبوذة المطلوبة لابد من وضعت خلال التنمية واللجان الدائمة ...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نريد ان نشكر أورماس Arumae لتبادل بروتوكول الكولاجين وطفولي وجوتا هينز أورسولا للمساعدة التقنية الممتازة. وعلاوة على ذلك نريد ان نشكر المسيحية F. أكرمان، إنجل أولريك والتصوير نيكون مركز في جامعة هايدلبرغ، وكذلك لمساعدة كيرش يواكيم التكرم لshoting الفيديو. وقد تم تمويل جزء من العمل من خلال جمعية الألمانية للبحوث (SFB 592).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
10X MEM Gibco 21430
بيكربونات الصوديوم (7.5٪) Gibco 25080
الجلوتامين Gibco 25030
هيدروكسيد الصوديوم ميرك 109137
NGF روش 1058231 R & D-NG رقم 556-100
Neurobasal متوسطة Gibco 21103
B27 الملحق Gibco 17504
المضادات الحيوية Gibco 15640
D-PBS Gibco 14040
الحشرات الإبر FST 26002-20
حقنة إبرة براون # 300013 دينار بحريني
8 الشريحة غرفة البئر مختبر تك 177402

References

  1. Ebendal, T., Rush, R. A. . Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. IBRO Handh, (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

69 SCG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved