Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

Resumen

Aquí se describe una célula de Schwann (CS) ensayo de migración en el que las SC son capaces de desarrollar a lo largo de los axones se extienden.

Resumen

El desarrollo de los nervios periféricos es un proceso intrigante. Las neuronas envían axones inervan a los objetivos específicos, que en los seres humanos son a menudo más de 100 cm de distancia del soma de la neurona. La supervivencia neuronal durante el desarrollo depende de factores de crecimiento derivados de meta-, sino también sobre el soporte de las células de Schwann (SCS). Para este axones ensheath finales SC de la región del soma neuronal (o la transición de la central en el sistema nervioso periférico) a la sinapsis o unión neuromuscular. Células de Schwann son derivados de la cresta neural y migran como precursores a lo largo de los axones emergentes hasta el axón está cubierto con SCS. Esto muestra la importancia de la SC de migración para el desarrollo del sistema nervioso periférico y subraya la necesidad de investigar este proceso. Con el fin de analizar SC desarrollo, una configuración que se necesita al lado de los SCS también incluye su sustrato fisiológico para la migración, el axón. Debido al desarrollo intrauterino (Mus musculus). Para evitar esto, hemos adaptado el superior ganglio cervical (SCG) Técnica de explante. Tras el tratamiento con factor de crecimiento nervioso (NGF) explantes SCG extender axones, seguido de precursores SC migran a lo largo de los axones del ganglio de la periferia. La belleza de este sistema es que el SC se derivan de una piscina de SC endógeno y que migran a lo largo de sus axones propios fisiológicos que están creciendo, al mismo tiempo. Este sistema es especialmente interesante, ya que el desarrollo SC largo de los axones pueden ser analizados por time-lapse, abriendo nuevas posibilidades para obtener información sobre la migración SC.

Protocolo

1. Preparación de geles de colágeno

1. Preparar un medio de acción, que contiene 455 l MEM 10x, 112 l 7,5% NaHCO _3, 50 y glutamina l NaOH. La concentración y la cantidad de la solución de NaOH depende de la preparación de colágeno de cola de rata (ver 1,2), el volumen final del medio de archivo de ser 1.000 l.
2. Preparar colágeno de cola de rata de acuerdo con Ebendal (1). Almacenar la solución de colágeno a 4 ° C. Una degradación de la solución de colágeno no se puede observar. Después de la preparación de un nuevo lote, estimar la concentración de NaOH necesaria para el medio de almacén (ver 1,1). Utilice el indicador de pH del medio para la valoración de la cantidad y la concentración de NaOH. 800 l ácido de cola de rata colágeno tiene a su vez un tono de rojo cuando se mezcla con 210 l de la media de valores. Si la concentración de NaOH es demasiado baja, la solución de colágeno se volverá amarilla, debido a que el indicador de pH del medio. Añadir el colágeno al medio y se mezcla sin producing burbujas. Realice estos pasos en el hielo. La polimerización se produce dentro de 2 horas después de la solución de colágeno y el medio de archivo se han mezclado y la nueva solución se incuba a 37 ° C. Pruebe esto antes de comenzar el experimento. 1,3) Mezclar 800 l de solución de colágeno con l 210 de media de valores (ver 1.2). Place 100 l de esta solución en los pocillos de una diapositiva cámara 8 también. Incubar los portas a 37 ° C, 5% de CO ₂ y condiciones de humedad en una incubadora de cultivo celular. Preparar los geles de colágeno bajo un banco de cultivo celular y las condiciones estériles. El colágeno gelatiniza dentro de 2 h.

2. Disección de SCG embrionarias

1. Cosecha embriones de ratones preñados de tiempo (E16-18) desde el útero y los mantienen en PBS hasta que se necesita más.
2. Disecciona un embrión desde el amnios. Decapita el caudal del embrión nivel clavicular. Fijar la cabeza en una bandeja inferior de silicio con "insecto-agujas". El lado ventral de la cabeza tiene que enfrentarse a usted unad que tiene que ver la región submandibular. La fijación permite una preparación más fácil.
3. Quitar la piel de la región submandibular izquierda y derecha, y con ella el tejido conectivo subcutáneo.
4. Retire las glándulas salivales submandibulares de su ubicación para despejar la vista hacia el hioides, los músculos infrahyoidal y el músculo esternocleidomastoideo.
5. Retire con cuidado estos músculos para borrar la vista hacia la laringe y la tráquea. Eliminar la tráquea y la laringe. Las arterias carótidas son entonces visible por ambos lados en los músculos prevertebral. El SCG se encuentra en la bifurcación de las arterias carótidas y tiene una forma oval. Retire con cuidado los ganglios y colocarlos en PBS. Retire los ganglios suavemente de las herramientas de disección si se adhieran a ellos. Es beneficioso el uso de fórceps, así como un soporte de aguja montada con una "aguja insecto" para la eliminación SCG.
6. Una vez en PBS, los ganglios almacenar a temperatura ambiente en PBS hasta que se diseccionaron enoulos ganglios de la GH. A continuación, limpie los ganglios de los vasos sanguíneos y tejido conectivo. Realizar la disección de SCG y la limpieza bajo un microscopio de disección coloca bajo una cabina de flujo laminar.
7. Finalmente, colocar los ganglios explantados en los geles de colágeno gelatinizados con la ayuda de agujas de jeringa montada en una jeringa para un manejo más fácil.
8. Incubar los explantes CGS en el colágeno gelatinizado en una incubadora de cultivo celular a 37 º C, con condiciones de 5% de CO ₂ y húmedo.

3. El tratamiento de los explantes de SCG

1. Después de 1-2 horas de incubación, el colágeno cubrir explante SCG que contiene 100 l con medio Neurobasal cultivo celular que contenía suplemento B27, glutamina y antibióticos. Ahora los pocillos de los portaobjetos de cámara de contener un volumen de 200 l (100 gel l y 100 l medio). Añadir otra l 200 del medio, sin embargo, ahora que contiene NGF (60 ng / ml) para facilitar el crecimiento axonal. En consecuencia, la concentración de NGF final es 30 ng / ml.
2. 1. Para investigar la aparición de SC migración, añadir factores adicionales directamente en días in vitro 0 (DIV0). Disolver los factores en el medio que contiene NGF en la concentración necesaria doble (2).
   2. Con el fin de analizar el impacto en la SC, que ya comenzaron a emigrar a lo largo de los axones, agregan factores adicionales en DIV3 hasta DIV4 (parada potencial del experimento). Con este fin, retirar cuidadosamente 180 ml ​​de la solución, en DIV3, y añadir 200 l NGF medio nuevo que contenía y los factores adicionales de interés en la concentración doble (2).

4. Time-lapse de imágenes

El uso de un microscopio invertido para los análisis. Objetivos pueden utilizar diversos, definir el campo de visión y la ampliación. Un aspecto importante, sin embargo, es la distancia de trabajo del objetivo utilizado, como formación de imágenes de los explantes SCG se realiza a través de la lámina de vidrio y el colágenogel. La velocidad de grabación de 1/10-30 minutos mostró buenos resultados (2). Sin embargo, este aspecto tiene que ser ajustado a la pregunta científica. Un normal cámara CCD puede ser utilizado para la adquisición de imágenes. Para una imagen en tiempo lapso de un cultivo celular cámara de incubación tiene que ser unida a la platina del microscopio. Incubar el tejido durante la formación de imágenes a 37 ° C, con condiciones de 5% de CO ₂ y húmedo. Iniciar el sistema de incubación de una hora antes del inicio de formación de imágenes. Esto permite que las partes de microscopio (por ejemplo objetivo), incluyendo la cámara de diapositivas para ajustar a la temperatura y evita las derivas de temperatura inducidas. Definir áreas específicas de análisis (en el explante y entre diferentes explantes) con la ayuda del software del microscopio y una etapa motorizada controlada por software (configuración multiposición) para análisis simultáneos de diferentes condiciones aplicadas a los explantes de SCG. Para el tiempo de imágenes a intervalos de tejido de tipo salvaje así como el tejido de los animales transgénicos se pueden utilizarmarcando el SCS (S100B: GFP) (3). Para fluoróforos de formación de imágenes de una fuente de luz fluorescente tiene que ser aplicado en la configuración micropscope. Usa los filtros estándar.

5. Cuantificación de SC distancias de migración

1. En el punto final (por ejemplo DIV4), fijar los geles de colágeno con 4% de PFA en el portaobjetos para cámara de 3-4 horas. Consecutivamente lavar los geles de colágeno 5 veces durante 10 min con PBS. Aplicar protocolos estándar para inmunocitoquímica (2). Si es nuevo para la preparación de SCG, verificar la identidad del ganglio como un ganglio simpático por inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) un marcador común para las células catecolaminérgicas. Durante inmunohistoquímica (después de que el anticuerpo primario), la transferencia de los geles de colágeno que contiene explantes a placas de 24 pocillos, que tienen un mayor volumen, lo cual es beneficioso para el lavado de los geles.
2. Después de inmunohistoquímica, coloque cuidadosamente los geles de colágeno en portaobjetos de vidrio. Cuidadosamenteeliminar la solución remanente y dejar que el colágeno seco / reducir a dos dimensiones. Esto permite facilitar las medidas de distancias (2). Después de esto, montar las muestras.
3. Por último, medir distancias de migración con la ayuda de Fiji (NIH) de software. No hay plugins especiales son necesarias para este fin. Para permitir que las mediciones correctas en micras, comprobar los metadatos de imagen correcta y la configuración en el Fiji, la imagen y la escala. Use Fiji también para la cuantificación de las células.

Resultados

El crecimiento axonal se facilita de SCG explantes tras el tratamiento con NGF (4) (esquema película S1 Figura 1 esquema). Este proceso es fácilmente visible por cualquier microscopio invertido y puede ser seguido por imagen de lapso de tiempo (película S2). Si un científico es algo nuevo para la disección de SCG de embriones de ratón es muy recomendable una validación de la técnica por un simple anti-tirosina hidroxilasa (TH) inmunohistoquímica. TH es un marcador común para l...

Discusión

El desarrollo del sistema nervioso periférico es un proceso excitante. Cuando el desarrollo se ha completado, los axones se envainado por SCS a lo largo de toda la longitud, que puede, en los seres humanos, a menudo ser más de 100 cm. Para este fin, el número correcto de los CSs requeridas tiene que ser establecido durante el desarrollo y los SCS también tienen que moverse a lo largo de los axones que se extienden a la periferia para asegurar la cobertura completa axonal. Esto es válido para los axones mielinizados...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MEM 10 veces	Gibco	21430
Bicarbonato de sodio (7,5%)	Gibco	25080
Glutamina	Gibco	25030
NaOH	Merck	109137
NGF	Roche	1058231	De I + D # 556-NG-100
Medio Neurobasal	Gibco	21103
B27 Suplemento	Gibco	17504
antibióticos	Gibco	15640
D-PBS	Gibco	14040
agujas de insectos	FST	26002-20
jeringa con aguja	Braun		BD # 300013
8 Deslice la cámara bien	Lab Tek	177402