Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

Résumé

Nous décrivons ici une cellule de Schwann (SC) essai de migration dans lequel SC sont en mesure de développer le long des axones s'étendent.

Résumé

Le développement des nerfs périphériques est un processus fascinant. Neurones envoient des axones innervent à des objectifs spécifiques, qui chez l'homme sont souvent de plus de 100 cm du soma du neurone. La survie neuronale au cours du développement dépend de facteurs de croissance dérivés cible, mais aussi sur le soutien des cellules de Schwann (CS). Vers l'extrémité des axones ensheath sc de la région de la soma neuronale (ou la transition de la centrale au système nerveux périphérique) de la synapse ou de la jonction neuromusculaire. Les cellules de Schwann sont des dérivés de la crête neurale et migrent le long des axones en tant que précurseurs émergents jusqu'en l'axone entier est couvert de SC. Cela montre l'importance de la migration SC pour le développement du système nerveux périphérique et souligne la nécessité d'enquêter sur ce processus. Afin d'analyser le développement SC, une configuration qui est nécessaire à côté des castes repose aussi sur le substrat physiologique de la migration, de l'axone. En raison du développement intra-utérin (Mus musculus). Pour contourner cela, nous avons adapté la technique supérieure du col explant ganglion (CTB). Lors du traitement avec le facteur de croissance des nerfs (NGF) explants CTB étendre les axones, suivis par des précurseurs SC migrent le long des axones du ganglion vers la périphérie. La beauté de ce système est que le SC sont issus d'un pool de SC endogène et qu'ils migrent le long des axones leurs propres physiologiques qui se développent en même temps. Ce système est particulièrement intéressant parce que le développement SC le long des axones peuvent être analysées par imagerie time-lapse, ouvrant de nouvelles possibilités pour mieux comprendre la migration en SC.

Protocole

1. Préparation de gels de collagène

1. Préparer le milieu de stock, contenant 455 ul MEM 10x, 112 ul de 7,5% de NaHCO _3, 50 ul glutamine et NaOH. La concentration et la quantité de NaOH dépend de la préparation de collagène de queue de rat (voir 1.2), le volume final du milieu stocks étant 1,000 pi.
2. Préparer du collagène de queue de rat selon la Ebendal (1). Conserver la solution de collagène à 4 ° C. Une dégradation de la solution de collagène n'a pas pu être observée. Après la préparation d'un nouveau lot, estimer la concentration de NaOH nécessaire pour le support d'actions (voir 1.1). Utiliser l'indicateur de pH du milieu pour le titrage de la quantité et la concentration de NaOH. 800 ul acide de collagène de queue de rat ont à prendre une teinte rouge lorsqu'il est mélangé avec 210 ul du milieu boursier. Si la concentration de NaOH est trop faible, la solution devient jaune collagène, du fait de l'indicateur de pH du milieu. Ajouter le collagène dans le milieu et mélanger sans produitspremière utilisation de bulles. Exécutez ces étapes sur la glace. La polymérisation a lieu dans les 2 heures après la solution de collagène et le moyen de stock ont ​​été mélangés et la nouvelle solution est incubée à 37 ° C. Testez cela avant de commencer une expérience. 1,3) Mélanger 800 ul de solution de collagène avec 210 de moyenne ul stock (voir 1.2). Placer 100 ul de cette solution dans les puits d'une diapositive 8 chambre bien. Incuber les lames à 37 ° C, 5% de CO ₂ et les conditions humides dans un incubateur de culture cellulaire. Préparer les gels de collagène sous un banc de culture cellulaire et des conditions stériles. Le collagène gelatinise dans les 2 heures.

2. Dissection de SCGs embryonnaires

1. Récolte des embryons de souris gravides temps (E16-18) de l'utérus et gardez-les dans du PBS jusqu'à nouvel nécessaire.
2. Disséquer un embryon à partir de l'amnios. Décapiter l'embryon caudale du niveau de la clavicule. Fixer la tête sur un plat en bas de silicium avec des insectes "aiguilles". La face ventrale de la tête doit faire face à vous unD Vous devez voir la région sous-maxillaire. La fixation permet de faciliter la préparation.
3. Retirez la peau de la région sous-maxillaire gauche et à droite, et avec elle le tissu conjonctif sous-cutané.
4. Retirez les glandes sous-maxillaires salivaires de leur emplacement pour dégager la vue sur l'os hyoïde, les muscles infrahyoidal et le muscle sterno.
5. Enlevez ces muscles avec soin pour dégager la vue sur le larynx et la trachée. Retirer la trachée et le larynx. Les artères carotides sont alors visibles des deux côtés sur les muscles prévertébraux. La CTB est situé à la bifurcation de l'artère carotide et a une forme ovale. Retirez délicatement les ganglions et les placer dans du PBS. Retirez délicatement les ganglions des outils de dissection, si elles s'en tiennent à leur disposition. Il est avantageux d'utiliser une pince ainsi qu'un porte-aiguille monté avec une "aiguille papillon" pour le retrait CTB.
6. Une fois dans du PBS, stocker les ganglions à la température ambiante dans du PBS jusqu'à ce que vous disséqué enouganglions gh. Ensuite, nettoyer les ganglions des vaisseaux sanguins et des tissus conjonctifs. La dissection CTB et le nettoyage sous un microscope à dissection placé sous un banc à flux laminaire.
7. Enfin, placer les noyaux explanté sur les gels de collagène gélatinisé à l'aide d'aiguilles de seringues montées sur une seringue pour une manipulation plus aisée.
8. Incuber les explants CTB sur le collagène gélatinisé dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec des conditions de CO ₂ humide et 5%.

3. Traitement des explants SCG

1. Après 1-2 heures d'incubation, couvrir le collagène explant CTB contenant avec 100 pl de milieu de culture contenant Neurobasal cellule B27 supplément, la glutamine et des antibiotiques. Maintenant les puits des diapositives de chambre contenir un volume de 200 pi (100 ul gel et 100 pl de milieu). Ajouter un autre ul 200 de la moyenne, mais maintenant contenant NGF (60 ng / ml) pour faciliter la croissance axonale. En conséquence, la concentration finale est NGF 30 ng / ml.
2. 1. Pour étudier l'apparition de la SC migration, ajoutez d'autres facteurs directement au jour in vitro 0 (DIV0). Dissoudre les facteurs du milieu contenant du NGF dans le double concentration nécessaire (2).
   2. Afin d'analyser l'impact sur la SC, qui ont déjà commencé la migration le long des axones, ajouter des facteurs supplémentaires à DIV3 jusqu'à DIV4 (arrêt potentiel de l'expérience). À cette fin, retirez avec précaution 180 ul de la solution, à DIV3, et ajouter 200 ul NGF milieu neuf contenant et les autres facteurs d'intérêt à la concentration double (2).

4. Imagerie time-lapse

Utiliser un microscope inversé pour les analyses. Divers objectifs peuvent être utilisés, en définissant le champ de vision et le grossissement. Un aspect important, cependant, est la distance de travail de l'objectif utilisé, comme l'imagerie des explants CTB est effectuée par la lame de verre et le collagènegel. La cadence d'enregistrement des 1/10-30 minutes a montré de bons résultats (2). Cependant, cet aspect doit être ajusté à la question scientifique. Une caméra CCD normale peut être utilisée pour l'acquisition des images. Pour l'imagerie en accéléré une chambre d'incubation de culture cellulaire doit être fixé à la platine du microscope. Incuber le tissu lors de l'imagerie à 37 ° C, avec des conditions de CO ₂ humide et 5%. Démarrer le système d'incubation une heure avant le début de la formation d'image. Ceci permet aux parties (par exemple, microscopie objectif), y compris la chambre de coulissement pour régler la température et évite les dérives induites par la température. Définir des domaines spécifiques d'analyses (dans le explant et entre les différents explants) à l'aide du logiciel microscope et une étape contrôlée par logiciel motorisé (réglage multiposition) pour les analyses simultanées de différentes conditions appliquées aux explants SCG. Pour imagerie time-lapse de type sauvage tissu ainsi que des tissus d'animaux transgéniques peuvent être utilisésmarquant le SC (S100B: GFP) (3). Pour fluorophores imagerie d'une source de lumière fluorescente doit être mis en œuvre dans la configuration micropscope. Utiliser les filtres standards.

5. Quantification des distances de migration SC

1. Au point de fin (DIV4 par exemple), fixer les gels de collagène avec 4% de PFA dans la chambre de coulissement pour 3-4 heures. Consécutivement laver les gels de collagène 5 fois pendant 10 minutes avec du PBS. Appliquer des protocoles normalisés pour l'immunocytochimie (2). Si vous êtes nouveau à la préparation du GEC, vérifier l'identité du ganglion en ganglion sympathique par immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (TH) un marqueur commun pour les cellules catécholaminergiques. Au cours de l'immunohistochimie (après l'anticorps primaire), transférer les gels de collagène contenant des explants de plaques à 24 puits, qui ont un plus grand volume, ce qui est bénéfique pour le lavage des gels.
2. Après immunohistochimie, placer soigneusement les gels de collagène sur des lames de verre. Soigneusementenlever le reste de la solution et laisser sécher le collagène / réduire à deux dimensions. Cela permet de mesurer facilement les distances (2). Après cela, montez les échantillons.
3. Enfin, mesurer les distances de migration à l'aide de Fidji (NIH) des logiciels. Aucun plugin spéciaux sont nécessaires à cette fin. Afin de permettre des mesures correctes dans um, vérifiez les métadonnées imagerie correcte et les paramètres sous les Fidji, l'image et l'échelle. Utilisez Fidji ont également pour la quantification des cellules.

Résultats

La croissance axonale est facilitée à partir SCG explants par traitement avec NGF (4) (schéma de film S1 Figure 1 schéma). Ce processus est facilement visible par n'importe quel microscope inversé et peut être suivi par imagerie time-lapse (film S2). Si un scientifique est nouveau pour disséquer CTB à partir d'embryons de souris, nous recommandons fortement une validation de la technique par un simple anti-tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochimie. TH est un marqueur c...

Discussion

Le développement du système nerveux périphérique est un processus passionnant. Lorsque le développement est terminé, les axones sont entourées par SC sur toute la longueur, ce qui peut, chez l'homme, souvent plus de 100 cm. À cette fin, le nombre exact des SC requis doit être établi au cours du développement et les SC ont aussi à se déplacer le long des axones s'étendent à la périphérie pour assurer la couverture complète des axones. Cela est vrai pour myélinisées, mais aussi pour les axones ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MEM 10x	Gibco	21430
Bicarbonate de sodium (7,5%)	Gibco	25080
Glutamine	Gibco	25030
NaOH	Merck	109137
NGF	Roche	1058231	R & D # 556-NG-100
Moyen Neurobasal	Gibco	21103
B27 Supplément	Gibco	17504
antibiotiques	Gibco	15640
D-PBS	Gibco	14040
aiguilles d'insectes	FST	26002-20
aiguille de la seringue	Braun		BD # 300013
8 Faites glisser chambre bien	Lab tek	177402