C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Summary

وهناك طريقة لتقييم كمي لاستجابة الكيميائي من انواع معينة ايليجانس يوصف. كان يعمل A مؤشر الكيميائي (CI) كوسيلة لتقييم بالضبط الرد من الديدان إلى أهداف معينة، ويكون بمثابة منصة للمقارنة بين سلالات والمركبات من الفائدة.

Abstract

استخدام العديد من الكائنات الحية الكيميائي للبحث عن مصادر الغذاء، وتجنب المواد الضارة، وتجد زملائه. انواع معينة ايليجانس ديه السلوك الكيميائي للإعجاب.

فرضية وراء اختبار استجابة من الديدان إلى الرائحة هي وضعها في منطقة ومراقبة حركة أثار ردا على الرائحة. حتى مع العديد من المقايسات المتاحة، وتحسين دودة انطلاق الموقع النسبي لكلا من التحكم ومناطق اختبار، مع التقليل من التفاعل من الديدان مع بعضها البعض، مع الحفاظ على حجم عينة كبيرة لا يزال التقدم في العمل ^1-10. الطريقة الموضحة هنا يهدف لمعالجة هذه القضايا عن طريق تعديل مقايسة التي وضعتها Bargmann وآخرون. ^1. وينقسم طبق بتري إلى أربعة أجزاء، وتتم تسمية اثنين من الأرباع مقابل وضع علامة "اختبار" واثنين من "السيطرة". يتم وضع مخدر في جميع مواقع المراقبة والاختبار. يتم وضع الديدان في وسط لوحة مع circlه ملحوظ في جميع أنحاء المنشأ للتأكد من أن الديدان غير متحركة سيتم تجاهل. الاستفادة من وجود نظام أربع رباعي بدلا من واحد أو اثنين 2 1 يزيل التحيز في حركة الديدان، كما هي على مسافة واحدة من اختبار ومراقبة العينات، بغض النظر عن أي جانب من أصل بدأوا. هذا تلتف مشكلة الديدان إجبارهم على السفر من خلال مجموعة من الديدان الأخرى للرد على الرائحة، والتي يمكن أن تؤخر الديدان أو إجبارهم على اتخاذ طريقا غير مباشر، مما أسفر عن تفسير غير صحيح من طريق وجهتهم. يظهر هذا الأسلوب أيضا المزايا العملية من خلال وجود حجم عينة أكبر والسماح للباحث لتشغيل مقايسة غير المراقب ويسجل الديدان مرة واحدة انتهت صلاحية الوقت المحدد.

Introduction

جناح أول من طور الفحص الكيميائي في عام 1973 ^5، ومنذ ذلك الحين، بعيدة المدى التطبيقات. بيولوجيا الأعصاب هو حقل واحد التي استفادت من استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات الكيميائي. وقد تجلى تكيف حاسة الشم، وهو شكل بسيط من التعلم والذاكرة، في C. ايليجانس باستخدام المقايسات الكيميائي ^6. كما تم استخدامها لاظهار ان C. يمكن ايليجانس تطوير الإيثانول التسامح، وهي النتيجة التي يوضح ليس فقط اللدونة السلوكية للديدان، ولكن هذا يدل أيضا على أن الديدان يمكن أن تكون مفيدة جدا في دراسة إدمان الكحول في البشر ^3. وقد جرى حتى وضعت فحوصات للتدليل على قدرة C. ايليجانس لتخزين القصير والذاكرة على المدى الطويل من خلال إظهار أن الجمعيات مصنوعة من الديدان بين chemoattractants والمواد الغذائية (OP50) ^7. بالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى المعلومات الواسعة المتاحة حاليا فيما يتعلق C. ايليجانس الجينوم، وchemotaxiق سلوك C. تم تغيير ايليجانس مرات عديدة عن طريق إحداث الطفرات ^1،8. وهذا يسمح لكثير من الاحتمالات هندسة مثيرة، مثل تطوير C. ايليجانس كأداة المعالجة البيولوجية. وهكذا، منذ التطوير الأولي للفحص الكيميائي في عام 1973، تم تغييره في كثير من الأحيان واستخدامها لتوضيح أسرار في مجموعة متنوعة من التخصصات.

بعض المقايسات التي تهدف إلى اكتشاف الطريق المحددة التي اتخذتها الديدان نحو الهدف. وقد تم تطوير هذا الفحص تنميط من هذا النوع من قبل وارد ^5. وضعت ثلاثة الديدان على أجار ذاب لمدة 15 دقيقة. وتتبع تحركاتهم عن طريق بصمة تركوها لأنها سافرت من المحيط الخارجي للوحة تصل الانحدار إلى جاذب في وسط اللوحة. ألقي القبض على جميع الديدان على لوحة باستخدام الكلوروفورم في نهاية كل محاكمة. واحدة سليل هذه الطريقة وضعت دودة واحدة في منتصف لوحة مع جاذبة والسيطرة علىر مسافات متساوية والعكس من أصل ^2.

بيرس-شيمومورا وآخرون. بتطوير فحص لمراقبة الطبيعة الدقيقة للحركة المشاركة في ⁹ الكيميائي. وضعت الديدان الفردية في 9 سم أطباق بتري إما تحتوي على تركيز الموحد للجاذبة أو على شكل شعاعي الانحدار، وبلغت ذروتها في مصدر جاذب. برنامج برامج الكمبيوتر التي اعترفت دودة كان يستخدم لتسجيل السلوك الملاحظ. كاميرا فيديو مثبتة في المجهر عملت بالتزامن مع المرحلة لضبط طبق بيتري تلقائيا عندما تمكن الفحص لضمان بقيت الدودة في مجال الرؤية. من هذا، تم اكتشاف معلومات أكثر تفصيلا عن سبب الدوران المعروضة بواسطة C. ايليجانس.

فحوصات أخرى أكثر مشابهة لتلك الموصوفة هنا، اختبر استجابة من عدد كبير من الديدان لمركبات الاختبار. وقد اثنين من رباعي المقايسات الكيميائيتستخدم لاستكشاف الأدوار التي الخلايا العصبية المختلفة، والمستقبلات، والجزيئات نقل الإشارة لعبت عندما C. تعرضت ايليجانس لمختلف مركبات ^1. وضعت بين 20-50 الديدان غسلها بالقرب من وسط لوحة مع جاذبة والسيطرة على طرفي القطبية جنبا إلى جنب مع مخدر، الصوديوم أزيد (نان _3). بعد 60 دقيقة، تم إنشاء فهرس الكيميائي مع القيم من -1.0 إلى +1.0 على أساس الفرق بين كيفية العديد من الديدان والملصقة على جاذبة أو عنصر التحكم. تم استخدام مؤشر الكيميائي مماثلة في مقايسة ذكرت في هذه المقالة، على الرغم من أن الفحص في وقت سابق فشلت في تقييم صارم الديدان غير متحركة. ثم تم تطبيق هذا الاختبار إضافية لاختبار آثار الاجتثاث الخلايا العصبية على الكيميائي.

تم إجراء آخر من الاختلاف الفحص المذكورة أعلاه حيث وضعت 100-200 الديدان في وسط لوحة تحتوي على أربعة أجزاء ^3. الأرباع المجاورة سواء الواردة أو الاختبارالرقابة على المواد. كما هو الحال في المقايسات السابقة، ويجمد الديدان بفعل أزيد الصوديوم قبل أن يسجل هدفا. ووصف طريقة مماثلة هنا كوسيلة لتقييم مدى استجابة C. ايليجانس لمركبات مختلفة. ومع ذلك، فإن الأسلوب أدناه له فائدة إضافية تتمثل في تقييم الديدان التي مرت على مسافة عتبة فصل النقال من الديدان قادرة على الحركة فقط.

أدرجت فحوصات أخرى مبادئ توجيهية مماثلة لتجاهل الديدان قادرة على الحركة. Frøkjær-جنسن وآخرون. وضع مقايسة تنوعا والتي يمكن استخدامها لاختبار مركبات قابلة للذوبان على حد سواء متقلبة والمياه ^10. تم تقسيم طبق بتري إلى أربعة أجزاء. لم الأرباع العلوي والسفلي لا تحتوي على المذيبات. رباعي اليسرى الواردة الماء، والحق الوارد الجاذب. عند اختبار عطور متقلبة، وضعت الحليلة على غطاء الطبق، خلال الربع السليم، في حين وضعت مركبات ذوبان في الماء مباشرة على الآغاص.

الطرق الموجودة حاليا لتقييم استجابة الكيميائي من C. ويجري باستمرار تنقيحها ايليجانس لتحسين سهولة استخدامها، والكفاءة، والدقة. لذلك، في حين أن مقايسة الموصوفة هنا لديها القدرة على تقييم أكبر عدد من الديدان (الإنتاجية القصوى: 250 الديدان / ساعة لكل لوحة، أكبر بقليل من سرعة أبداه لي وآخرون ^3)، والقوة الحقيقية لهذا الأسلوب هو تتويجا مقتضبة للعديد من سمات فحوصات في وقت سابق (الجدول 1).

Protocol

1. إعداد / غسل الديدان

1. مزامنة الديدان إلى الشباب البالغين ^11.
2. ماصة 2 مل من بصل S الصعود إلى 5 سم لوحة الانجذاب الكيميائي من نظموا الديدان التي مسحت مجرد حشيش OP50 E. القولونية. إمالة لوحة حسب الحاجة لضمان تغسل الديدان من سطح لوحة في المخزن المؤقت.
3. ماصة 1 مل من محلول دودة-S بصل إلى أنبوب microcentrifuge.
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية باستخدام PicoFuge في 6،600 دورة في الدقيقة.
5. نضح بصل S، وترك بيليه من الديدان دون عائق.
6. إضافة 1 مل S حل بصل إلى أنبوب microcentrifuge، عكس عدة مرات لغسل الديدان.
7. كرر الخطوات من 1،4-1،6 آخر ثلاث مرات.
8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية مرة الخامسة، وهذه المرة الشفط طاف إلى الحجم النهائي من كاليفورنيا. 100 ميكرولتر.
9. ماصة 2 ميكرولتر من الديدان على لوحة NGM لضمان وجود ما بين 50 و 250 الديدان في كل عينة 2 ميكرولتر. ضبطتركيز الديدان في بصل S حسب الحاجة عن طريق إعادة التعليق على الديدان في حجم أصغر أو أكبر من S بصل.
10. استخدام الديدان في مقايسة مباشرة بعد غسل الديدان لمدة تصل إلى 1 ساعة.

2. إعداد لوحات اختبار

1. بمناسبة السفلي من لوحة 5 سم، تقسيم الطبق إلى 4 أجزاء متساوية. أجار الكيميائي أو NGM يمكن استخدامها. وثمة حاجة إلى الحد الأدنى من 3 محاكمات لكل سلالة الجينية التي يجري اختبارها.
2. بمناسبة دائرة نصف قطرها 0.5 سم حول المنشأ (الشكل 1).
3. بمناسبة نقطة في كل رباعي إما مع "T" ل "اختبار" أو "C" ل "السيطرة" التأكد من أن المواقع هي على مسافة واحدة من أصل وبعضها البعض. النقاط يجب أن تكون 2 سم بعيدا عن الأصل على الأقل. بمناسبة أعلى اليسار وأسفل اليمين كما الأرباع الأرباع اختبار والحق أعلى وأسفل اليسار الأرباع والضوابط (الشكل 1).

3. تشغيل الفحص

1. مزيج من محلول الاختبار من خلال الجمع بين أحجام متساوية من مركب اختبار و 0.5 M أزيد (وهو مخدر يستخدم للقبض على الديدان عند بلوغ رباعي). مزيج من حلول التحكم من خلال الجمع بين المذيبات المستخدمة لتخفيف مركب اختبار مع 0.5 M أزيد.
2. ماصة 2 ميكرولتر من الحل دودة (المعد في 1.8) من بيليه على المنشأ (حيث تتقاطع السطرين).
3. مباشرة بعد، ماصة 2 ميكرولتر من محلول الاختبار على موقعين "T". وبالمثل، ماصة على نفس القدر من الحل السيطرة على موقعين "C".
4. مرة واحدة وقد تم استيعاب قطرات دودة والرائحة في أجار، استبدال الأغطية وعكس لوحات.
5. بعد 60 دقيقة، ووضع الديدان في 4 درجة مئوية الحاضنة. فقط إزالة لوحة من الحاضنة عندما يمكن عدها. ترك الديدان في درجة حرارة الغرفة قد تسمح لهم لتعبئة مرة أخرى.
6. تسجيل عدد من الديدان في كل رباعي التي عبرت تماما CIRC الداخليةجنيه.
7. كرر الخطوات من 3،2-3،6 باستخدام حلول التحكم في كل من الاختبار والأرباع السيطرة. وهذا سيكون بمثابة لوحة التحكم. وينبغي بذل ثلاثة من هذه اللوحات وتشغيل لتكون بمثابة المكافحة المناسبة.

4. تفسير النتائج / تحديد مؤشر الانجذاب الكيميائي

1. حساب مؤشر الكيميائي باستخدام المعادلة 1. هذا وسوف تسفر عن مؤشر الكيميائي بين -1.0 و +1.0.

(1)

الكيميائي مؤشر = (# الديدان في كل من الأرباع اختبار - # الديدان في كل من الأرباع التحكم) / (مجموع # من الديدان الناجحة)

والنتيجة +1.0 يشير جذب القصوى نحو الهدف، ويمثل 100٪ من الديدان وصوله في الأرباع تحتوي على الهدف الكيميائية. فهرس -1.0 دليل على تنافر القصوى. وقد تم بالفعل استخدام طرق فحص مماثل ³ (الجدول 1).

2. الإبلاغ عن متوسط ​​Chemotaxiق مؤشر (CI) والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). أداء الطالب اختبار T-بمقارنة البيانات من لوحات اختبار ومراقبة.

النتائج

مقارنة البرية من نوع (N2) C. ايليجانس إلى ODR-10 (KY10) متحولة.

كنا ثنائي الأسيتيل، وهي المعروفة C. ايليجانس جاذب كيميائي، لمقارنة الديدان wildtype إلى أن من الطافرة التي تفتقر إلى مستقبلات للثنائي الأسيتيل ^1،12. لwildtype (N2)

Discussion

الكيميائي، على الرغم من أن تسيطر عليها مجموعة معقدة من الآليات العصبية والخلوية، ويمكن بسهولة وبشكل موضوعي كميا باستخدام المقايسات الكيميائي. للحصول على أفضل النتائج من المقايسات، يجب اتخاذ بعض الخطوات الحاسمة. أولا، تنظيم الديدان أمر أساسي في تحقيق نتائج متسقة ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531