محمي مستضدات خلايا الدم الحمراء وظيفية بواسطة الغشاء مسمار Polyglycerols Hyperbranched الاتفاق

Summary

يتم تقديم التعديل غشاء الخلية من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) مع polyglycerol hyperbranched (HPG). وتميزت كرات الدم الحمراء تعديلها من قبل مائي تقسيم المرحلة الثانية، وهشاشة ناضح وتحلل بوساطة تكمل. تم تقييم التمويه من البروتينات السطحية ومولدات المضادات باستخدام التدفق الخلوي ونظام الطباعة مايكرو (MTS) بطاقات phenotyping الدم.

Abstract

خلية الدم الحمراء (RBC) نقل أمر حيوي لعلاج عدد من المشاكل الطبية الحادة والمزمنة مثل الثلاسيميا الكبرى وفقر الدم المنجلي ^1-3. بسبب وجود العديد من المستضدات على سطح RBC (~ 308 مستضدات المعروف ^4)، والمرضى في العلاج نقل الدم المزمن تطوير alloantibodies بسبب مباراة ملكة جمال لمستضدات طفيفة على كرات الدم الحمراء المنقول ^{4، 5.} تطعيم البوليمرات ماء مثل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) وpolyglycerol hyperbranched (HPG) يشكل طبقة على استبعاد الغشاء الذي يمنع RBC التفاعل مع الأجسام المضادة المستضدات السطحية دون التأثير على مرور جزيئات صغيرة مثل الأكسجين والجلوكوز، وأيونات ^3. في الوقت الحاضر لا يوجد طريقة لتوليد خلايا حمراء العالمي للمتبرعين بالدم وذلك جزئيا بسبب التحدي شاقة قدمت من خلال وجود عدد كبير من مولدات المضادات (البروتينات والكربوهيدرات يعتمد) على سطح RBC ود للسوف evelopment هذه الأساليب تحسن إلى حد كبير سلامة نقل الدم، ويحسن بشكل كبير من توافر واستخدام كرات الدم الحمراء. في هذا التقرير، يتم عرض التجارب التي يتم استخدامها لتطوير مستضد كرات الدم الحمراء وظيفية المحمية بواسطة الغشاء تطعيم HPG وتكييفها. ومتوافق حيويا للغاية HPGs البوليمرات المضغوط ^{6، 7،} ومن المتوقع أن يكون موجودا داخل الخلية الكنان السكري الذي يحيط الغشاء الدهني ⁸ و ⁹ و المستضدات السطحية قناع RBC ^{10 و 11.}

Protocol

A. تعديل Polyglycerol Hyperbranched (SS-HPG)

1. مجفف بالتجميد مكان HPG 60 كيلو دالتون (0.5 غرام، 0.0083 ملمول) في قارورة أسفل مستديرة وجففه بين عشية وضحاها تحت فراغ في 90 ° C.
2. بردت القارورة إلى درجة حرارة الغرفة، وحل HPG المجففة في بيريدين اللامائية (3 مل).
3. لfunctionalize حوالي ثماني مجموعات الهيدروكسيل على HPG مع مجموعات الكربوكسيل، إضافة كمية الحفاز dimethylaminopyridine (قطرة واحدة من 5 ملغ / مل حل في بيريدين) إلى حل HPG. لهذا الخليط، إضافة أنهيدريد السكسينيك، (ز 0.0067، 0.0664 ملمول) المذاب في 0.5 مل قطرة بيريدين الحكمة أكثر من 10 دقيقة. تحريك الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها تحت الأرجون.
4. يعجل الخليط في 40 مل من الأسيتون الباردة (4 ° C) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وأجهزة الطرد المركزي باستخدام J2-MC بيكمان أجهزة الطرد المركزي في 27000 XG لمدة 15 دقيقة. صب طاف، وإزالة الأسيتون المتبقية من التنظيف مع الأرجون في درجة حرارة الغرفة.
5. لتفعيل كربوكسيمجموعات لتر مع مجموعات succinimidyl (SS) سكسينات، حل HPG الكربوكسيل-functionalized في 3 مل من DMF اللامائية. إضافة N-hydroxysuccinimide (0.0077 غرام، 0.0664 ملمول) وN، N'-diisopropylcarbodiimide (0.0084 غرام، 0.0664 ملمول) في حل HPG ويقلب الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها تحت الأرجون.
6. تنقية SS-HPG من الهطول في الأسيتون الباردة.
7. إزالة الأسيتون المتبقية من التنظيف مع الأرجون.
8. تحديد نقاء HPG تعديل ودرجة functionalization الكربوكسيل وSS من بروتون ⁽¹ H) - NMR التحليل.

B. كوكتيل الدم الكامل والفصل بين خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)

1. جمع الدم الكامل (الهيماتوكريت 40٪، 3 مل) من الجهات المانحة وافقت الإنسان الصحية إلى أنبوب سترات vacutainer.
2. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب السيترات في 1،000 x ج لمدة 4 دقائق.
3. إزالة طاف الذي يحتوي البلازما والصفائح الدموية، ومعطف الشهباء الوسيطة التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء وplateleTS باستخدام ماصة باستور.
4. نقل كرات الدم الحمراء معبأة (80٪ الهيماتوكريت، 1.2 مل) في أنبوب مل فالكون 12 أجهزة الطرد المركزي، وإضافة PBS العازلة (8 مل، ودرجة الحموضة = 8.0) لغسل كرات الدم الحمراء.
5. مزيج من كرات الدم الحمراء انعكاس للحصول على توزيع موحد الخلية.
6. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب فالكون في 1،000 x ج لمدة 4 دقائق، وإزالة طاف.
7. غسل كرات الدم الحمراء مرتين مع PBS أكثر بتكرار الخطوات 5 و 6.
8. المكان معبأة كرات الدم الحمراء (100 ميكرولتر) في 1.6 مل أنبوب إيبندورف، وإضافة PBS العازلة (300 ميكرولتر، ودرجة الحموضة = 8.0) للحصول على كرات الدم الحمراء الهيماتوكريت 20٪.

C. HPG التطعيم لكرات الدم الحمراء

1. مباشرة بعد هطول الأمطار من HPG تعديل في الأسيتون في خطوة A6، مكان SS-HPG (150 ملغ) في قارورة زجاج (1 DRAM)، وحل في المخزن المؤقت PBS (300 ميكرولتر، ودرجة الحموضة = 8.0).
2. إضافة SS-HPG البوليمر في حل الهيماتوكريت 20٪ غسلها كرات الدم الحمراء للحصول على الحجم النهائي من 400 ميكرولتر وSS-HPG التركيز التي تتراوح من 0.5 مم إلى 3 مم. على سبيل المثال كرات الدم الحمراء لإعداد تعامل مع 0.5 مم SS-HPG، إزالة 36 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من RBC غسلها ووضع 36 ميكرولتر من حل البوليمر SS-HPG.
3. دوامة تعليق بلطف ووضع أنابيب إيبندورف على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
4. أجهزة الطرد المركزي أنابيب إيبندورف في 1،000 x ج لمدة 4 دقائق، وماصة من طاف.
5. إضافة 1 مل من كرات الدم الحمراء لغسل PBS، الطرد المركزي وإزالة طاف.
6. إضافة 1 مل المالحة وغسل كرات الدم الحمراء ومرتين في الخطوة 5.
7. إضافة 300 ميكرولتر من المياه المالحة إلى 100 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء معبأة (80 الهيماتوكريت٪) إلى تركيز النهائي من الهيماتوكريت 20٪.

D. توصيف HPG معدلة كرات الدم الحمراء

I. تحلل بوساطة تكمل

1. جمع نحو 8 مل من الدم الكامل من الجهات المانحة الإنسان الصحية في أنبوب المصل vacutainer BD الزجاج، والسماح على تجلط الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 2000 x ج لمدة 10 دقيقة، وجمع حوالي 3 مل من المصل.
3. واحد ملليلتر من سيروم وضعت في حمام مائي عند درجة 60 ° لمدة 30 دقيقة لإعداد مصل الحرارة المعطل.
4. إضافة 60 ميكرولتر من الدم الطازج أو مصل المعطل الحرارة إلى أنبوب إيبندورف التي تحتوي على 60 ميكرولتر من 20٪ كرات الدم الحمراء الهيماتوكريت HPG تعديل أو كرات الدم الحمراء غير المعدل.
5. احتضان لمدة 1 ساعة كرات الدم الحمراء عند 37 ° C.
6. لتحديد كمية الهيموجلوبين في التعليق الخلية، مكان 5،9 ميكرولتر من الهيماتوكريت 20٪ من كرات الدم الحمراء HPG تعديل أو خلايا معدلة في ثلاث نسخ في 96 لوحة جيدا. إضافة 294 ميكرولتر من كاشف للDrabkin (كاشف يستخدم لقياس كمية الهيموجلوبين spectrophotomerically). خلط الخلايا مع كاشف Drabkin من قبل pipetting داخل وخارج. قياس الامتصاصية من الهيموغلوبين في cyanoderivative 540 نيوتن متر باستخدام قارئ لوحة SPECTRA MAX 190.
7. لتحديد كمية الهيموجلوبين في طاف، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 13000 x ج لمدة 1 دقيقة. المكان 50 ميكرولتر من طاف في ثلاث نسخ في لوحة 96 أيضا. إضافة 250 ميكرولتر من كاشف للDrabkin. الخلايا مزيج مع كاشف للDrabkinبواسطة pipetting داخل وخارج. قياس الامتصاصية من الهيموغلوبين في cyanoderivative 540 نيوتن متر باستخدام قارئ لوحة SPECTRA MAX 190.
8. تحديد كمية الخلايا هي lysed من نسبة الهيموجلوبين في طاف (الخطوة 7) والهيموجلوبين في العينة الإجمالية (الخطوة 6) ^{8، 11، 12.}

II. والتمويه من مولدات المضادات الرئيسية والثانوية باستخدام بطاقات MTS

1. 50 ميكرولتر من مكان HPG تعديل RBC (10٪ الهيماتوكريت) في أنبوب إيبندورف، الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف.
2. إضافة 110 ميكرولتر من مادة التخفيف MTS إلى بيليه الخلية والتجانس تعليق خلية pipetting داخل وخارج.
3. إضافة 11 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل عمود هلام البسيطة. تجنب لمس خلال هلام إضافة.
4. تحديد موقع بطاقات MTS في جهاز للطرد المركزي حامل البطاقة، وأجهزة الطرد المركزي في 156 x ج لمدة 6 دقائق.
5. يتم تحديد مستضدات حماية السطحية من موقع RBC في العمود هلام مصغرة، استنادا إلى تصنيعص الوصف.

III. مائي قسم المرحلة الثانية القياسات

1. إعداد 500 كيلو دالتون دكستران / 8 كيلو دالتون PEG فصل المرحلة الثانية نظام يتألف من (5٪ ديكستران 500K، PEG 4٪ 8K، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات) وفقا ^ل13.
2. أجهزة الطرد المركزي في 433 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحصول على نظام المرحلة الثانية (ديكستران في الأسفل).
3. فصل المرحلتين بعناية.
4. قسامة 1.0 مل من المرحلة PEG العليا في أنبوب الموسومة (أسفل مقعرة)، إضافة 20 ميكرولتر من 20٪ الهيماتوكريت RBC تعديل HPG، والخلايا مزيج بلطف عبها.
5. إضافة 0.5 مل من المرحلة العليا التي تحتوي على الخلايا إلى 0.5 مل من أدنى مرحلة، وتخلط بلطف النظام عبها.
6. وضع أنبوب على مقاعد البدلاء لحد أدنى 2 ~ لنظام لفصل، وتحديد موقع الخلايا في النظام. توطين كرات الدم الحمراء (في المرحلة العليا PEG، في مرحلة أقل ديكستران أو في كليهما) هي دالة لدرجة التعديل والجزيئيةوزن HPG.

IV. قياسات هشاشة التناضحي

1. إعداد حلول كلوريد الصوديوم مع تركيزات التي تتراوح من 0 إلى 0.9 (W / V)٪.
2. المكان 0،4 مل من كلوريد الصوديوم في 1،5 حلول أنابيب إيبندورف مل.
3. إضافة 20 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء (20٪ الهيماتوكريت) في حلول كلوريد الصوديوم.
4. مزيج بعناية من قبل خلايا قلب ووضعها في حمام مائي في C ° 37 لمدة 30 دقيقة.
5. تعليق بعناية من قبل خلايا قلب. تأخذ 50 ميكرولتر من التعليق RBC وإضافته إلى كاشف مل Drabkin في 1، وضعت في كوفيت. خلط الخلايا مع كاشف Drabkin من قبل pipetting داخل وخارج. قياس الامتصاصية من الهيموغلوبين في cyanoderivative 540 نيوتن متر باستخدام بيكمان كولتر DU 730 UV / VIS القارئ.
6. لتحديد كمية الهيموجلوبين في طاف، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة. أضف 200 ميكرولتر من طاف إلى 1 مل من كاشف Drabkin في كوفيت. خلط الخلايا مع كاشف Drabkin من قبل pipetting داخل وخارج. قياس الامتصاصية للhemoglobin cyanoderivative في 540 نيوتن متر باستخدام بيكمان كولتر DU 730 UV / VIS القارئ.
7. حساب كمية خلايا lysed في محلول كلوريد الصوديوم تختلف عن نسبة الهيموجلوبين المبلغ في طاف (الخطوة 6) إلى المبلغ الإجمالي للالهيموغلوبين في خلايا التعليق (الخطوة 5).

قياسات التدفق الخلوي V. - حماية D-القرد (RHD) المستضد

1. إضافة 5 ميكرولتر من السيطرة أو تعديل HPG كرات الدم الحمراء (20٪ الهيماتوكريت) في ثلاث نسخ إلى المخزن المؤقت PBS تستكمل مع 0.5٪ BSA إلى وحدة تخزين ما مجموعه 25 ميكرولتر.
2. إضافة 25 ميكرولتر من FITC D المضادة للريسوس وحيدة النسيلة (RHD) تم شراؤها من Biodiagnostics القسمة (PA، الولايات المتحدة الأمريكية).
3. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في حمام مائي.
4. غسل الخليط مع 1.5 مل PBS العازلة مرتين. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة طاف.
5. تعليق كرات الدم الحمراء في محلول ملحي 1 مل، ونقل إلى تعليق 4 مل أنبوب تدفق BD التدفق الخلوي.
6. تحليل باستخدام FACSCanto II فلوث عداد الكريات، والحصول على 5000 الأحداث على بوابة التحكم RBC، واستخدام الأحداث كلها لتحليلها.

VI. قياسات التدفق الخلوي - التعبير عن CD47

1. إضافة ميكرولتر من 1،54 السيطرة أو تعديل HPG كرات الدم الحمراء (20٪ الهيماتوكريت) في ثلاث نسخ إلى المخزن المؤقت PBS تستكمل مع 0.5٪ BSA إلى وحدة تخزين ما مجموعه 44 ميكرولتر.
2. إضافة 6 ميكرولتر من فيكوإيريترين (PE) المسمى الماوس المضادة للCD47 الإنسان شراؤها من العلوم البيولوجية دينار بحريني (NJ، الولايات المتحدة الأمريكية).
3. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في حمام مائي.
4. غسل الخليط مع 1.5 مل PBS عازلة للمرة الثانية على. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة طاف.
5. تعليق كرات الدم الحمراء في 1 مل المالحة، وتمرير من خلال 26 G 5/8 إلى تقليل إبرة التثاقل الخلية.
6. نقل التعليق إلى 4 مل أنبوب تدفق BD التدفق الخلوي.
7. تحليل باستخدام FACSCanto II قياس التدفق الخلوي، والحصول على 10000 الأحداث على بوابة التحكم RBC.

النتائج

وتم قياس كمية المستضد D تمويه من القرد والبروتين CD47 السطحية RBC بواسطة التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة التي تحمل علامات الفلورسنت وحيدة النسيلة، ويتم إعطاء النتيجة ممثل في الشكل 1. في حالة HPG-المطعمة كرات الدم الحمراء (الرمادي)، وانخفضت كثافة إشارة (الذ...

Discussion

كرات الدم الحمراء المانحة عالمية تتمتع بإمكانيات كبيرة في توافر الدم وتعزيز سلامة نقل الدم للعلاج. وتعتبر واعدة أيضا كرات الدم الحمراء المركبات تسليم المخدرات بسبب تداولها طويلة وتوافق مع الحياة المتأصلة ^{14 و 15.} التجارب المقدمة في هذه الورقة تقييم المختبر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
غليسيدول	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON، كندا)
ميثيل البوتاسيوم	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
اللامائية بيريدين	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
4-Dimethylaminopyridine	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
السكسينيك أنهيدريد	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
الأسيتون	فيشر العلمية		(ON، كندا)
ثنائي ميثيل الفورماميد اللامائية	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
N-Hydroxysuccinimide	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
N، N'-Diisopropylcarbodiimide	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
MTS بطاقات			الكتابة الدقيقة نظام (MTS) بطاقات (FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
ديكستران 500 كيلو دالتون	المواد الكيميائية الجميلة فارماسيا		(السويد)
PEG 8 كيلو دالتون	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
FITC حيدة النسيلة المضادة للريسوس D (RHD)	حاصل Biodiagnostics		(PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
PE حيدة النسيلة المضادة للCD47	BD العلوم البيولوجية		(NJ، الولايات المتحدة الأمريكية)
Drabkin كاشف	سيغما الدريتش		(ON، كندا)
			الجدول. المواد الكيميائية والكواشف المستخدمة في تطعيم HPG البوليمرات لغشاء RBC وتحليلها.