Antígenos funcional protegido glóbulos rojos por la membrana injerto de compactos Poligliceroles hiperramificados

Resumen

La modificación de membrana celular de las células rojas de la sangre (eritrocitos) con poliglicerol hiperramificado (HPG) se presenta. Los glóbulos rojos modificados se caracterizaron por partición acuoso de dos fases, la fragilidad osmótica y la lisis mediada por el complemento. El camuflaje de proteínas de superficie y los antígenos se evaluó usando la citometría de flujo y Micro Typing System (MTS) tarjetas de sangre fenotipificación.

Resumen

Glóbulos rojos (RBC) transfusión es vital para el tratamiento de una serie de problemas médicos agudos y crónicos, como la talasemia mayor y la anemia de células falciformes ^1-3. Debido a la presencia de gran cantidad de antígenos en la superficie de glóbulos rojos (~ 308 antígenos conocidos ^4), los pacientes en la terapia de transfusión de sangre crónica desarrollar aloanticuerpos debido a la coincidencia de la señorita antígenos menores en los glóbulos rojos transfundidos ^{4, 5.} El injerto de polímeros hidrófilos tales como polietilenglicol (PEG) y poliglicerol hiperramificado (HPG) forma una capa sobre la membrana de exclusión RBC que impide la interacción de los anticuerpos con los antígenos de superficie sin afectar el paso de moléculas pequeñas tales como el oxígeno, la glucosa y los iones ^3. En la actualidad no hay ningún método disponible para la generación de universales células rojas de la sangre de los donantes, en parte, debido a la enorme reto presentado por la presencia de gran número de antígenos (proteínas y carbohidratos basados) en la superficie de glóbulos rojos y la dl desarrollo de tales métodos mejorará significativamente la seguridad de la transfusión, y dramáticamente mejorar la disponibilidad y el uso de los glóbulos rojos. En este informe, los experimentos que se utilizan para desarrollar antígenos funcionales glóbulos rojos protegidas por la membrana de injerto de HPG y su caracterización se presentan. HPGs son altamente biocompatibles polímeros compactos ^{6, 7,} y se espera que se encuentra dentro del glicocálix célula que rodea la membrana lipídica ^{8, 9} y la máscara de antígenos de superficie de RBC ^{10, 11.}

Protocolo

A. Modificación de poliglicerol hiperramificado (SS-HPG)

1. Place liofilizó HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) en un matraz de fondo redondo y se seca durante la noche bajo vacío a 90 ° C.
2. Refrigerar el matraz a temperatura ambiente, y se disuelve el HPG se secó en piridina anhidra (3 ml).
3. Para funcionalizar aproximadamente ocho grupos hidroxilo en HPG con grupos carboxilo, añadir una cantidad catalítica de dimetilaminopiridina (una gota de 5 mg / ml de solución en piridina) a la solución HPG. A esta mezcla, agregar anhídrido succínico, (0,0067 g, 0,0664 mmol) disuelto en 0,5 ml de piridina gota a gota durante 10 min. Se agita la mezcla durante la noche a temperatura ambiente en atmósfera de argón.
4. Precipitar la mezcla en 40 ml de acetona fría (4 ° C) en un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugar utilizando un Beckman J2-MC centrifugar a 27.000 xg durante 15 min. Decantar el sobrenadante, y eliminar la acetona residual mediante lavado con argón a temperatura ambiente.
5. Para activar el carboxiLos grupos L con succinato de succinimidilo (SS) grupos, se disuelve el HPG carboxilo funcionalizado en 3 ml de DMF anhidra. Añadir N-hidroxisuccinimida (0,0077 g, 0,0664 mmol) y N, N'-diisopropilcarbodiimida (0,0084 g, 0,0664 mmol) a la solución HPG y se agita la mezcla durante la noche a temperatura ambiente en atmósfera de argón.
6. Se purifica el SS-HPG por precipitación en acetona fría.
7. Eliminar la acetona residual mediante lavado con argón.
8. Determinar la pureza de HPG modificado y el grado de funcionalización carboxilo y SS por protón ⁽¹ H) - análisis de RMN.

B. extracción de sangre total y la separación de los glóbulos rojos (eritrocitos)

1. Recoger sangre total (40% de hematocrito, 3 ml) a partir de donantes humanos sanos consintió en un tubo vacutainer de citrato.
2. Centrifugar el tubo de citrato a 1.000 xg durante 4 min.
3. Eliminar el sobrenadante que contiene el plasma y las plaquetas, y la capa intermedia buffy que contiene glóbulos blancos y platelets utilizando una pipeta Pasteur.
4. Transferir hematíes concentrados (80% de hematocrito, 1,2 ml) en un tubo de centrífuga de 12 ml Falcon, y añadir tampón PBS (8 ml, pH = 8,0) para lavar los eritrocitos.
5. Mezclar por inversión glóbulos rojos para obtener una distribución uniforme de células.
6. Centrifugar el tubo Falcon a 1.000 xg durante 4 min, y eliminar el sobrenadante.
7. Lavar los glóbulos rojos con PBS dos veces más repitiendo los pasos 5 y 6.
8. Lugar lleno-RBC (100 l) en 1,6 ml tubo Eppendorf, y añadir tampón de PBS (300 l, pH = 8,0) para obtener 20% de hematocrito RBC.

C. HPG injerto a los glóbulos rojos

1. Inmediatamente después de la precipitación de HPG modificada en acetona en paso A6, lugar SS-HPG (150 mg) en un vial de vidrio (1 dram), y se disuelven en tampón de PBS (300 l, pH = 8,0).
2. Añadir SS-HPG solución de polímero a 20% de hematocrito lavaron los glóbulos rojos para obtener un volumen final de 400 l y SS-HPG concentración que va desde 0,5 mm a 3 mm. Por ejemplo, para preparar los glóbulos rojos tratados con 0,5 mM SS-HPG, eliminar 36 l de PBS desde el lavado de glóbulos rojos y colocar 36 l de SS-HPG solución de polímero.
3. Vortex suavemente la suspensión y se colocan los tubos Eppendorf en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 1 hr.
4. Centrifugar los tubos Eppendorf a 1.000 xg durante 4 min, y pipetear el sobrenadante.
5. Añadir 1 ml de PBS para lavar los glóbulos rojos, centrifugar y separar el sobrenadante.
6. Añadir 1 ml de solución salina y lavar los glóbulos rojos dos veces en el paso 5.
7. Añadir 300 l de solución salina a 100 l de glóbulos rojos empaquetados (80% de hematocrito) a una concentración final de 20% de hematocrito.

D. Caracterización de HPG Modificado glóbulos rojos

Complemento I. lisis mediada

1. Recoger alrededor de 8 ml de sangre completa de donantes humanos sanos en BD tubo vacutainer de vidrio de suero, y permiten que la sangre coagule a temperatura ambiente durante 30 min.
2. Centrifugar el tubo a 2.000 xg durante 10 min y recoger alrededor de 3 ml de suero.
3. Un mililitro de la serum se colocó en un baño de agua a 60 ° C durante 30 minutos para preparar el suero inactivado por calor.
4. Añadir 60 l de suero dulce o suero inactivado por calor en un tubo Eppendorf que contiene 60 l de 20% de hematocrito HPG glóbulos rojos modificados o sin modificar los glóbulos rojos.
5. Incubar los RBC durante 1 hora a 37 ° C.
6. Para cuantificar la cantidad de hemoglobina en la suspensión celular, lugar 5,9 l de 20% de hematocrito de glóbulos rojos HPG modificados o no modificados células por triplicado en placas de 96 pocillos. Añadir 294 l de reactivo de Drabkin (un reactivo que se utiliza para cuantificar la cantidad de hemoglobina spectrophotomerically). Mezclar las células con el reactivo Drabkin pipeteando dentro y fuera. Medir la absorbancia de la cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX 190 lector de placas.
7. Para cuantificar la cantidad de hemoglobina en el sobrenadante, centrifugar las células a 13.000 xg durante 1 min. Place 50 l de sobrenadante por triplicado en una placa de 96 pocillos. Añadir 250 l de reactivo de Drabkin. Mezclar las células con el reactivo de Drabkinpipeteando dentro y fuera. Medir la absorbancia de la cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX 190 lector de placas.
8. Cuantificar la cantidad de células lisadas a partir de la proporción de hemoglobina en el sobrenadante (paso 7) y la hemoglobina total en la muestra (paso 6) ^{8, 11, 12.}

II. El camuflaje de los antígenos mayores y menores que utilizan tarjetas de MTS

1. Place 50 l de HPG modificado RBC (10% de hematocrito) en un tubo Eppendorf, se centrifuga a 1.000 xg durante 1 min, y eliminar el sobrenadante.
2. Añadir 110 l de MTS diluyente al sedimento celular y se homogeneiza la suspensión de células por pipeteo de entrada y salida.
3. Añadir 11 l de suspensión celular a cada columna de gel de mini. Evitar tocar el gel durante la adición.
4. Localizar tarjetas de MTS en un soporte de la tarjeta de centrífuga y centrifugar a 156 xg durante 6 min.
5. Protección de los antígenos de superficie se determina a partir de la ubicación de RBC en la columna de gel de mini, basado en la fabricaciónDescripción r.

III. Acuoso de dos mediciones de fase de partición

1. Preparar 500 kDa de dextrano / PEG 8 kDa sistema de dos separación de fases compuesta de (5% de dextrano 500k, 4% de PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosfato) de acuerdo con ^13.
2. Centrifugar a 433 xg durante 10 min a temperatura ambiente para obtener un sistema de dos fases (dextrano en la parte inferior).
3. Separar las dos fases cuidadosamente.
4. Alícuota de 1,0 ml de la fase de PEG superior en un tubo de marcado (con fondo cóncavo), añadir 20 l de hematocrito 20% RBC HPG modificado, y células mezclar suavemente con un movimiento rápido.
5. Añadir 0,5 ml de la fase superior que contiene las células a 0,5 ml de una fase inferior, y mezclar el sistema suavemente con un movimiento rápido.
6. Colocar el tubo en el banco durante ~ 2 min para el sistema para separar y determinar la localización de las células en el sistema. La localización de los glóbulos rojos (en la fase de PEG superior, en la fase de dextrano inferior o en ambos) es función del grado de modificación y molecularpeso de HPG.

IV. Mediciones de fragilidad osmótica

1. Preparar soluciones de NaCl, con concentraciones que van de 0 a 0,9 (w / v)%.
2. Colocar 0,4 ml de soluciones de NaCl en 1,5 ml de tubos Eppendorf.
3. Añadir 20 l de eritrocitos (20% de hematocrito) en las soluciones de NaCl.
4. Células de mezclar cuidadosamente por inversión y se colocan en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min.
5. Suspender las células cuidadosamente por inversión. Tomar 50 l de suspensión de RBC y añadirlo a un 1 ml de reactivo de Drabkin, colocó en una cubeta. Mezclar las células con el reactivo Drabkin pipeteando dentro y fuera. Medir la absorbancia de la cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lector.
6. Para cuantificar la cantidad de hemoglobina en el sobrenadante, centrifugar las células a 1.000 xg durante 1 min. Añadir 200 l de sobrenadante a 1 ml de reactivo de Drabkin en una cubeta. Mezclar las células con el reactivo Drabkin pipeteando dentro y fuera. Medir la absorbancia de la hemoglobin cyanoderivative a 540 nm utilizando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lector.
7. Calcular la cantidad de células lisadas en solución de NaCl diferente de la relación de la cantidad de hemoglobina en el sobrenadante (etapa 6) a la cantidad total de hemoglobina en la suspensión de células (paso 5).

V. mediciones de citometría de flujo - Protección de Rhesus-D (RhD) antígeno

1. Añadir 5 l de control o HPG glóbulos rojos modificados (20% de hematocrito) en triplicado a tampón PBS suplementado con 0,5% de BSA hasta un volumen total de 25 l.
2. Añadir 25 l de FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) adquirido de Biodiagnostics cociente (PA, EE.UU.).
3. Incubar la mezcla durante 30 min a 37 ° C en un baño de agua.
4. Se lava la mezcla con 1,5 ml de tampón PBS dos veces. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para eliminar el sobrenadante.
5. Suspender los eritrocitos en solución salina de 1 ml, y transferir la suspensión en 4 ml de tubo de flujo BD de citometría de flujo.
6. Analizar el uso FACSCanto II flow citómetro, la adquisición de 5.000 eventos en la puerta de RBC control, y el uso de eventos completos para el análisis.

VI. Mediciones de citometría de flujo - Expresión de CD47

1. Añadir 1,54 l de control o HPG glóbulos rojos modificados (20% de hematocrito) en triplicado a tampón PBS suplementado con 0,5% de BSA hasta un volumen total de 44 l.
2. Añadir 6 l de ficoeritrina (PE) de ratón marcado con anti-CD47 humanos adquiridos de BD Biosciences (NJ, EE.UU.).
3. Incubar la mezcla durante 30 min a 37 ° C en un baño de agua.
4. Se lava la mezcla con 1,5 ml de tampón PBS durante dos veces. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para eliminar el sobrenadante.
5. Suspender los eritrocitos en 1 ml de solución salina, y pasar a través de 26 G 5/8 de la aguja para minimizar la agregación celular.
6. Transferir la suspensión a 4 ml de tubo de flujo BD citometría de flujo.
7. Analizar el uso FACSCanto citómetro de flujo II, la adquisición de 10.000 eventos en la puerta de RBC control.

Resultados

Camuflaje de antígeno Rhesus D y proteína de superficie CD47 RBC se cuantificaron por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales marcados fluorescentes, y un resultado representativo se da en la figura 1. En caso de HPG de injerto de glóbulos rojos (gris), la intensidad de la disminución de la señal (pico desplaza a la izquierda) en comparación con el control de los glóbulos rojos (rojo y verde) que indica una reducción en la unión a los anticuerpos a la superficie celular que ind...

Discusión

Los glóbulos rojos de donantes universales tienen un gran potencial en la disponibilidad de sangre y la mejora de la seguridad de la terapia transfusional. Los glóbulos rojos también se consideran prometedores vehículos de administración de fármacos debido a su larga circulación y la biocompatibilidad inherente ^{14, 15.} Los experimentos presentados en este trabajo evaluar la características in vitro de HPG eritrocitos modificados. La propiedades in vitro y en

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glicidol	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canadá)
Metilato de potasio	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
Piridina anhidra	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
4-dimetilaminopiridina	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
Anhídrido succínico	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
Acetona	Fisher Scientific		(ON, Canadá)
Dimetilformamida anhidra	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
N-hidroxisuccinimida	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
N, N'-diisopropilcarbodiimida	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
MTS tarjetas			Micro Typing System (MTS) tarjetas (FL, EE.UU.)
Dextrano 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Suecia)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Cociente Biodiagnostics		(PA, EE.UU.)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(Nueva Jersey, EE.UU.)
Reactivo de Drabkin	Sigma Aldrich		(ON, Canadá)
			Tabla. Productos químicos y reactivos utilizados para el injerto de polímeros HPG a RBC membrana y su análisis.