Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Özet

Hyperbranched poligliserol (HPG) ile kırmızı kan hücrelerinin hücre zarı modifikasyonu (eritrositler) sunulmuştur. Modifiye RBCs sulu iki faz bölümleme, osmotik frajilitesi ve kompleman aracılı lizis ile karakterize edildi. Yüzey proteinleri ve antijenlerin kamuflaj akım sitometri ve Mikro Yazma Sistemi (MTS) kan fenotipleme kartları kullanılarak değerlendirilmiştir.

Özet

Kırmızı kan hücresi (RBC) transfüzyonu gibi talasemi ve orak hücreli anemi ^1-3 gibi akut ve kronik sağlık sorunları bir dizi tedavi için hayati önem taşımaktadır. RBC yüzey (~ 308 bilinen antijen ^4), kronik kan transfüzyonu hastalarda eritrosit transfüzyonu, ^{4, 5,} küçük antijen bayan maçı nedeniyle alloantibodies geliştirmek üzerinde çok sayıda antijen varlığı nedeniyle. Polietilen glikol (PEG) ve hyperbranched poligliserol (HPG) gibi hidrofilik polimerler eklenme oksijen, glukoz, ve iyon ³ gibi küçük moleküllerin geçit etkilemeden yüzey antijenleri ile antikorların etkileşimi engelleyen RBC zar üzerinde bir dışlama bir tabaka oluşturur. Şu anda herhangi bir yöntem çünkü RBC yüzey ve D antijenlerinin çok sayıda (göre protein ve karbonhidrat) varlığı tarafından sunulan zor bir meydan okuma parçası olarak evrensel verici kırmızı kan hücrelerinin üretimi için kullanılabilirBu tür yöntemlerin evelopment anlamlı transfüzyon güvenliği artırmak ve dramatik RBCs durumu ve kullanımı artıracaktır. Bu raporda, HPG ve karakterizasyonunu greftleme membran antijen korunan fonksiyonel RBCs geliştirmek için kullanılan deneyler sunulmuştur. HPGS son derece kompakt polimerler ^{6, 7,} biyo-uyumlu, ve lipid membran ^{8, 9} ve maske RBC yüzey antijenleri ^{10, 11,} çevreleyen hücre glycocalyx içinde bulunması beklenmektedir.

Protokol

A. Hyperbranched poligliserol Modifikasyonu (SS-HPG)

1. Sıra bir tabanı yuvarlak bir şişe içerisinde 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mol) HPG liyofilize edildi ve 90 C'de vakum altında gece boyunca kurutun ° C.
2. Oda sıcaklığına soğutmak şişeye, ve susuz piridin (3 ml) içinde kuru HPG çözülür.
3. Karboksil grupları ile HPG üzerinde yaklaşık olarak sekiz hidroksil gruplarının fonksiyonalize, HPG çözeltisine dimetilaminopiridin ve katalitik miktarda (piridin içinde 5 mg / ml çözeltisinin bir damla) ekleyin. Bu karışıma, 10 dakika boyunca akıllı 0.5 ml piridin içinde çözülür damla (0.0067 g, 0,0664 mmol) ve süksinik anhidrit ilave edin. Argon altında oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılır.
4. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne soğuk aseton (4 ° C) 40 ml karışım çökelti, ve 15 dakika süreyle 27,000 x g bir Beckman J2-MC santrifüjü kullanılarak santrifüj. Süpernatant süzün ve oda sıcaklığında, argon püskürtülerek kalıntı aseton çıkarın.
5. Karboksi etkinleştirmek içinsüksinimidil süksinat (SS) grupları ile l gruplan, susuz DMF içindeki 3 ml karboksil fonksiyonalitesine sahip HPG çözülür. HPG çözelti, N-hidroksisüksinimid (0.0077 g, 0,0664 mol) ve N, N'-diizopropilkarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mol) eklenir ve argon altında oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılır.
6. Soğuk aseton yağış tarafından SS-HPG arındırın.
7. Argon püskürtülerek kalıntı aseton çıkarın.
8. NMR analizi değiştirilmiş - HPG saflık ve proton ⁽¹ H) karboksil ve SS işlevsellik derecesini belirler.

B. Tam Kan Toplama ve kırmızı kan hücrelerinin ayrılması (eritrositler)

1. Bir sitrat Vacutainer tüpüne sağlıklı insan donörlerden razı tam kan (% 40 Hematokrit, 3 ml) toplayın.
2. 4 dakika boyunca 1.000 xg'de sitrat tüp santrifüjleyin.
3. Plazma ve trombosit içeren Süpernatantı ve beyaz kan hücreleri ve platele içeren ara buffy coatPasteur pipeti kullanarak ts.
4. 12 ml Falcon santrifüj tüpü içine paketlenmiş eritrositler (% 80 Hematokrit, 1.2 ml) aktarın ve eritrosit yıkamak için PBS tamponu (8 mL, pH = 8.0) ilave edilir.
5. Üniform hücre dağılımı elde etmek için ters çevirerek RBCs karıştırın.
6. 4 dakika boyunca 1.000 xg'de Falcon tüp santrifüjleyin ve süpernatant kaldırmak.
7. 5. ve 6. adımları tekrarlayarak PBS iki kez daha sahip eritrositler yıkayın.
8. Sıra 1.6 ml Eppendorf tüpüne (100 ul)-alyuvarlar paketlenmiş ve% 20 Hematokrit, eritrositler elde etmek için PBS tamponu (300 ul, pH = 8.0) ilave edilir.

C. HPG eritrositler için Aşılama

1. Hemen adımda A6 aseton içinde değiştirilmiş HPG, yer çökelme sonra bir cam şişeye (1 dram) ve PBS tamponu (300 ul, pH = 8.0) içinde çözülür SS-HPG (150 mg).
2. % 20 Hematokrit içine SS-HPG polimer solüsyonu eklenir ve 400 ul 0.5 mM ile 3 mm arasında değişir ve SS-HPG konsantrasyonunun bir nihai hacim elde etmek için eritrositler yıkanır. Örneğin, 0.5 mM ile muamele eritrositler hazırlamak için SS-HPG, yıkanmış eritrosit gelen PBS 36 ul kaldırmak ve SS-HPG polimer çözeltisine 36 ul yerleştirin.
3. Girdap nazikçe ve süspansiyon 1 saat boyunca oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde Eppendorf tüpleri.
4. 4 dakika boyunca 1.000 xg'de Eppendorf tüpler Santrifüj ve supernatant dışarı Pipeti.
5. , RBC yıkama santrifüjden süpernatant kaldırmak PBS 1 ml ekleyin.
6. 1 ml serum fizyolojik ekleyin ve iki kat 5. adımda RBCs yıkayın.
7. % 20 Hematokrit, bir nihai konsantrasyona kadar paketlenmiş eritrositler 100 ul (% 80 Hematokrit) ile tuzlu su 300 ul ekle.

Modifiye RBCs HPG D. Karakterizasyonu

I. Kompleman aracılı lizis

1. Sağlıklı insan donörlerden alınan serum BD Vacutainer cam tüp içine tam kanın yaklaşık 8 ml toplamak, ve 30 dakika süreyle oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin kan.
2. 10 dakika boyunca 2.000 xg'de tüp santrifüjleyin ve serum yaklaşık 3 ml toplamak.
3. Seru Bir mililitrem ısıyla inaktive serum hazırlamak için 30 dakika için 60 ° C sıcaklıkta bir su banyosuna yerleştirildi.
4. 20% Hematokrit HPG modifiye eritrositler veya değiştirilmemiş RBCs 60 ul içeren bir Eppendorf tüp içine taze serum veya ısı inaktive serum 60 ul ekleyin.
5. 37, 1 saat boyunca inkübe eritrositler ° C.
6. Hücre süspansiyonu hemoglobin miktar yer 96 kuyulu plaka içinde üç kopya olarak değiştirilmiş ya da değiştirilmemiş alyuvarlar hücreleri HPG% 20 hematokrit 5.9 ul ölçmek için. Drabkin reaktifi (spectrophotomerically hemoglobin miktarını ölçmek için kullanılan bir reaktif) 294 ul ekle. Ve dışarı pipetleme Drabkin reaktifi ile hücreleri karıştırın. SPECTRA MAX 190 plaka okuyucu kullanarak 540 nm'de hemoglobin cyanoderivative arasında absorbansları ölçülür.
7. Üstte yüzen madde içindeki hemoglobin miktarını ölçmek için, 1 dakika için 13.000 x g santrifüj hücreleri. 96 plaka üç nüsha halinde süpernatant Yeri 50 ul. Drabkin reaktifi 250 ul ekleyin. Drabkin reaktifi ile karıştırın hücrelerive dışarı pipetleme. SPECTRA MAX 190 plaka okuyucu kullanarak 540 nm'de hemoglobin cyanoderivative arasında absorbansları ölçülür.
8. Örnek olarak üstte yüzen madde içindeki hemoglobin oranı (adım 7) ve toplam hemoglobin (adım 6) ^{8, 11, 12} gelen erimiş hücrelerinin miktarını ölçmek.

II. MTS kartlarını kullanarak majör ve minör antijenlerinin kamuflaj

1. Sıra 50 bir Eppendorf tüp HPG modifiye RBC (10% Hematokrit), 1 dk için 1.000 xg'de santrifüj ul ve süpernatant kaldırmak.
2. Hücre pelletini MTS seyreltici 110 ul ekleyin ve dışarı pipetleme hücre süspansiyonu homojenize.
3. Her mini jel kolon hücre süspansiyonu 11 ul ekleyin. Ilavesi sırasında jel dokunmaktan kaçının.
4. Bir santrifüj kartı yuvasına MTS kartları bulun ve 6 dakika boyunca 156 xg'de santrifüj.
5. Yüzey antijenlerinin korunması üretimi esas olarak, mini jel kolon içinde RBC konumu belirlenirr açıklaması.

III. Sulu iki faz bölüm ölçümleri

1. Dekstran 500 kDa ^{13 'e} göre (% 5 dekstran 500K,% 4 PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosfat) oluşan / PEG 8 kDa iki faz ayırma sistemi hazırlayın.
2. Iki fazlı bir sistem (alt dekstran) elde etmek üzere oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 433 x g'de santrifüjleyin.
3. Dikkatlice iki aşamadan ayırın.
4. Bir etiketli tüp (konkav dipli) içine üst PEG faz kısım 1.0 ml getirerek yavaşça 20% 20 hematokrit HPG modifiye RBC ul ve karıştırın hücreleri ekleyin.
5. Daha düşük bir faz ile 0.5 mL hücre içerir, ve hafifçe vurarak yavaşça sistemi karıştırmak üst faz 0.5 ml ilave edilir.
6. Ayırmak ve sistemindeki hücrelerin in yerini belirlemek için sistem için ~ 2 dk için tezgah üzerinde yerleştirilir. Eritrosit lokalizasyonu (üst faz PEG, alt dekstran faz ya da her ikisi de) ve moleküler değişiklik derecesi ile işlevHPG ağırlığı.

IV. Ozmotik frajilite ölçümleri

1. 0 ila 0.9 (w / v)% arasında değişmektedir ve konsantrasyonu NaCl çözeltisi hazırlayın.
2. 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine NaCl solüsyonlarının Yeri 0.4 ml.
3. NaCl solüsyonlarının içine eritrositler (% 20 hematokrit) 20 ul ekleyin.
4. Inversiyon ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosunda koyun tarafından dikkatle Mix hücreleri.
5. Inversiyon tarafından dikkatle hücreleri erteleyin. RBC süspansiyonu 50 ul al ve bir küvet içine yerleştirilmiş 1 ml Drabkin reaktifi, eklemek. Ve dışarı pipetleme Drabkin reaktifi ile hücreleri karıştırın. BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS okuyucusu kullanarak 540 nm'de hemoglobin cyanoderivative arasında absorbansları ölçülür.
6. Üstte yüzen madde içindeki hemoglobin miktarını ölçmek için, 1 dakika için 1000 x g hücreler santrifüj. Bir küvet içinde Drabkin reaktifi 1 ml süpernatan 200 ul ekle. Ve dışarı pipetleme Drabkin reaktifi ile hücreleri karıştırın. Hemogl ve absorbansı ölçülürBECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS okuyucusu kullanarak 540 nm'de Tobin cyanoderivative.
7. Hücre süspansiyonu (adım 5) içinde hemoglobin toplam miktarı için üstte yüzen madde içindeki hemoglobin miktar oranı (adım 6) farklı NaCI çözeltisi içinde lize hücrelerinin miktarını hesaplar.

V. Flow sitometri ölçümleri - Rh-D Korunması (Rh) antijen

1. 5 kontrol ul ve 25 ul toplam hacim ile% 0.5 BSA ile takviye PBS tamponu ile üç kopya halinde HPG değiştirilmiş eritrositler (% 20 hematokrit) ekleyin.
2. Bölüm Biodiagnostics (PA, ABD) satın FITC monoklonal anti-Rh D (RHD) 25 ul ekle.
3. Bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika için karışımın inkübe edin.
4. 1.5 ml PBS tamponu ile iki kere yıkayın karışım. Süpernatant kaldırmak için 1 dakika boyunca 1.000 xg'de santrifüjleyin.
5. 1 ml serum fizyolojik içine RBCs Askıya ve 4 ml akım BD flow sitometri tüpüne süspansiyonu aktarın.
6. FACSCanto II flo kullanılarak analizw sitometresinin, RBC kontrol kapısı üzerinde 5000 olayları edinme ve analiz için tüm olayları kullanın.

VI. Flow sitometri ölçümleri - CD47 ekspresyonu

1. 1.54 kontrol ul ya da 44 ul toplam hacim ile% 0.5 BSA ile takviye PBS tamponu ile üç kopya halinde HPG değiştirilmiş eritrositler (% 20 hematokrit) ekleyin.
2. BD Biosciences (New Jersey, ABD) 'den satın fare anti-insan CD47 etiketli phycoerythrin (PE) ve 6 ul ekle.
3. Bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika için karışımın inkübe edin.
4. Iki kere 1.5 ml PBS tamponu ile karışım yıkayın. Süpernatant kaldırmak için 1 dakika boyunca 1.000 xg'de santrifüjleyin.
5. 1 ml serum fizyolojik içine RBCs Askıya ve hücre topaklanma en aza indirmek için 26 G 5/8 iğne geçer.
6. 4 ml akım BD flow sitometri tüpüne süspansiyonu aktarın.
7. RBC kumanda ızgarası üzerinde 10.000 olayları edinme, FACSCanto II akış sitometresinin kullanarak analiz edin.

Sonuçlar

Rh D antijen CD47 ve RBC yüzey proteini Kamuflaj floresan işaretli monoklonal antikorlar kullanılarak akış sitometresi ile ölçüldü, ve bir temsili sonucu, Şekil 1 'de verilmiştir. HPG-aşılı eritrositler durumunda (gri), sinyalin yoğunluğu yüzeyi proteinlerini maskeleme belirtmek hücre yüzeyine bağlanarak antikorlar bir azalma gösteren kontrol eritrositler (kırmızı ve yeşil) ile karşılaştırıldığında (sola doğru kayar tepe noktası) azalmıştır .

Tartışmalar

Evrensel donör eritrositler kan transfüzyonu tedavisi için artan kan kullanılabilirliği ve güvenliği büyük bir potansiyele sahiptir. Eritrosit aynı zamanda uzun sirkülasyon ve doğal biyolojik ^{uyumluluk, 14, 15} bağlı olarak umut verici bir ilaç verme araçları olarak kabul edilir. Bu yazıda sunulan deneyler modifiye RBCs HPG in vitro özellikleri değerlendirir. In vitro özelliklerine ve HPG modifiye RBCs vivo dolaşımda son ^{8, 11} bizim grupta incelenmi?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glisidol	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
Trimetilolpropan	Fluka		(ON, Kanada)
Potasyum metilat	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
Susuz piridin	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
4-Dimetilaminopiridin	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
Süksinik anhidrit	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
Aseton	Fisher Scientific		(ON, Kanada)
Susuz dimetil formamid	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
N-hidroksisüksinimid	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
N, N'-diizopropilkarbodiimid	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
MTS kartları			Micro Typing System (MTS) kartlar (FL, ABD)
Dekstran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(İsveç)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
FITC monoklonal anti-Rh D (Rh)	Bölüm Biodiagnostics		(PA, ABD)
PE monoklonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, ABD)
Drabkin reaktifi	Sigma Aldrich		(ON, Kanada)
			Tablo. RBC membran ve onların analizi polimerlerin HPG aşılama için kullanılan kimyasallar ve reaktifler.