الدماغ الأمامي تسجيل الكهربية في الزرد اليرقات

Summary

ووصف طريقة بسيطة لتسجيل إمكانات حقل خارج الخلية في الدماغ الأمامي الزرد اليرقات. الأسلوب يوفر قوية في الجسم الحي قراءة من الاستيلاء على غرار النشاط. ويمكن استخدام هذه التقنية مع يرقات اسماك الزرد المعدلة وراثيا تحمل جينات الصرع ذات الصلة أو المضبوطات أثار من قبل إدارة الأدوية الاختلاج.

Abstract

الصرع يؤثر على ما يقرب من 3 ملايين شخص في الولايات المتحدة ويصل إلى 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. يعرف بأنه حدوث النوبات دون سابق استفزاز عفوية، يمكن الحصول على الصرع نتيجة لإهانة إلى الدماغ أو طفرة جينية. الجهود المبذولة لضبط النموذج في المقام الأول تستخدم الحيوانات والشتائم المكتسبة (المخدرات الاختلاج، أو إصابات الدماغ التحفيز) والتلاعب الجيني (ضربة قاضية العقاقير، إعادة التركيب مثلي أو transgenesis) في القوارض. الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات ^1-3 التي يمكن أن توفر بديلا قيما للابحاث ومقره القوارض الصرع. وتستخدم على نطاق واسع الزرد في دراسة علم الوراثة الفقاريات أو التنمية، يحمل درجة عالية من التشابه الجيني للثدييات والتعبير عن homologs ل85٪ ~ من الطفرات المعروفة الإنسان بالصرع واحد الجينات. بسبب صغر حجمها (4-6 ملم في الطول)، يمكن الحفاظ على الزرد اليرقات في حجم السائل منخفضة تصل إلى 100 ميكرولتر خلال التنمية في وقت مبكر والأذربيجانيةYED في موضوع لوحات جيدة. يمكن إضافة الكواشف مباشرة إلى الحل الذي الأجنة تطوير وتبسيط إدارة المخدرات وتمكين الفحص السريع في الجسم الحي من المركبات اختبار ^4. ويمكن استخدام أليغنوكليوتيد] الاصطناعية (morpholinos)، الطفرات والزنك الاصبع نوكلياز والنهج المعدلة وراثيا لتوليد بسرعة ضربة قاضية أو طفرة في الجين الزرد ^5-7. تحمل هذه الخصائص الدراسات الزرد لم يسبق له مثيل تحليل القوة الإحصائية ميزة على القوارض في دراسة الاضطرابات العصبية مثل الصرع. لأن "معيار الذهب" للأبحاث الصرع هو رصد وتحليل غير طبيعية الإفرازات الكهربائية التي تنشأ في بنية الدماغ المركزية (أي، نوبات)، وهي طريقة لتسجيل نشاط المخ بكفاءة في الزرد اليرقات يوصف هنا. هذا الأسلوب هو التكيف من تقنيات التسجيل التقليدية خارج الخلية ويسمح لرصد طويل الأجل مستقرة من نشاط المخ في يرقات اسماك الزرد سليمة. Sوتظهر التسجيلات وافرة للمضبوطات الحادة التي تنتج عن تطبيق حمام المخدرات الاختلاج ونوبات عفوية سجلت في الأسماك المعدلة وراثيا.

Protocol

1. إنتاج البيض وكوكتيل

1. الزرد تربية يلي الإجراءات القياسية التي سبق وصفها ^8. لفترة وجيزة، يتم تعيين الزرد الكبار حتى في تربية الدبابات مع فواصل في المكان. عندما الاضواء في غرفة تأتي في صباح اليوم التالي، تتم إزالة فواصل من تربية الحيوانات الأليفة والأسماك الدبابات ما بين 20 و 60 دقيقة من الوقت التزاوج دون عائق.
2. يتم جمع البيض من الدبابات في تربية مصفاة وتشطف بالماء البيض. ثم يتم نقل البيض إلى طبق بيتري مع الماء البيض. تتم إزالة الحطام وبويضة غير مخصبة باستخدام ماصة نقل.
3. مكان طبق بتري تحتوي على البيض التي تم جمعها في حاضنة (28-32 ° C). يفقس البيض بعد نحو يومين بعد الإخصاب (DPF)، وإزالة أي المشيماء غيرها من الحطام مع ماصة نقل.
4. على اليوم المطلوب بعد الإخصاب (3-8 DPF) إزالة اليرقات طبق بتري تحتوي على السباحة بحرية ووضعت على مقاعد البدلاء المختبر في درجة حرارة الغرفة.

SS = "jove_title"> 2. مسرى مكروي سحب وإعداد

1. باستخدام مجتذب micropipette، سحب 1.2 مم OD البورسليكات الزجاج الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150 ملم مربع ماصة أو فارغة عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مسبقا. ويمكن استخدام مختلف OD الزجاج الشعيرات الدموية تبعا لنوع من مكبر للصوت headstage المتاحة.
2. Backload ومسرى مكروي مع حل خارج الخلية تسجيل (2 M كلوريد الصوديوم) باستخدام حقنة 1 مل مع فلتر حقنة Nalgene (4 ملم) وMicrofil خيوط (وارنر أدوات دقيقة) المرفقة. اهتزاز أو الاستفادة من البلعة نحو غيض إبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية.

3. الشلل في آجار

1. إعداد جديدة من حل 1.2٪ انخفاض ذوبان في الماء أجار نقطة البيض. مكان حل أجار في المياه مجموعة حمام في ~ 37 درجة مئوية.
2. إعداد ساترة مع غرفة تسجيل ومكان في الفريزر (5-10 دقيقة). ينبغي لدائرة تسجيل MATCح التي كانت على منصة الكهربية. نستخدم الأضواء حمام غرفة مفتوحة الماس من أدوات التصوير وارنر (نموذج RC-26GLP).
3. باستخدام ماصة باستور أو نقل أو مكان واحد الزرد اليرقات في قطرات صغيرة من الماء البيض في طبق نظيف طبق بتري. لهذا الحبرية، إضافة قطرات من محلول يحتوي على مخدر (0.02٪ tricaine) وكيل شل (1 ملغ / مل α-بنغاروتوكسين).
4. رصد الزرد لفقدان الحركة (5 إلى 10 دقائق).
5. إزالة ساترة / غرفة التسجيل من الفريزر. ضع دائرة على المسرح لstereomicroscope. باستخدام ماصة نقل، مزيج مل العديد من 1.2٪ منخفضة ذوبان نقطة مع قطرات الاغاروز حل ونقل (مع السمك) إلى الدائرة ساترة / التسجيل.
6. تلميح باستخدام ماصة أو إبرة حادة غرامة، يرقات موقف تحت stereomicroscope بحيث يتعرض الجانب الظهري من الأسماك إلى السطح هلام الاغاروز. السماح لتتصلب الاغاروز (5-10 دقيقة)، ثم باستخدام ملعقة مسطحة لنقل ب أجارقفل إلى دائرة تسجيل وضعت على منصة الكهربية.

3. خارج الخلية الميدانية تسجيل

1. إضافة 2-5 مل من وسائط تسجيل الزرد إلى غرفة تسجيل. إذا كانت التغييرات ضرورية المخدرات، يروي غرفة مع حل التسجيل بمعدل حوالي 1 مل / دقيقة. لا من الحل الأوكسجين الضروري تسجيل.
2. إدراج مسرى مكروي (حوالي 1 ميكرون قطر تلميح، 2-7 MΩ) في مكبر للصوت headstage شنت على مياداة مجهرية ثلاثية الأبعاد. تأكد من أن مياداة مجهرية هي في موقف مناسب للسماح لمجموعة من الحركة والتكيف. جعل تلميح مسرى مكروي في الطائرة نظر المجهر، وارتفاع قبالة المرحلة، واستخدام التكيف الخشنة أقل إلى نقطة أعلاه فقط وقليلا أمام رئيس الزرد.
3. مع مكبر للصوت في وضع "الجاري المشبك" صفر القطب.
4. استخدام التكيف الخشنة أقل غيض الكهربائي بحيث يمس فقط لياليurface من الزرد، قليلا أمام الدماغ الأمامي.
5. باستخدام خطوات التكيف غرامة دفع غيض الكهربائي حتى ثقوب الجلد من الزرد. السماح لتسوية ودفع الكهربائي ثم ميكرون عدة في الدماغ الأمامي.
6. تسجيل النشاط الكهربائي في وضع المشبك الجاري باستخدام برنامج Axoscope. يتم الحصول على البيانات بمعدل 10 كيلو هرتز أخذ العينات من.

النتائج

وترد أمثلة على تصريف الاستيلاء مثل electrographic سجلت في الدماغ المقدم من أجار جزءا لا يتجزأ من يرقات اسماك الزرد في الشكل 1. وقد أثار واسعة سعة التصريف انفجار متعددة في ارتفاع هذه العينات من خلال تطبيق حمام من المخدرات الاختلاج، و 40 ملي بيلوكاربين (في، 6 DPF) أو 1 ملي ...

Discussion

طريقة تسجيل خارج الخلية المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة من نشاط المخ. هذه التسجيلات هي مشابهة لرصد (EEG) تخطيط كهربية تستخدم عادة لتقييم وجود التفريغ الكهربائي غير طبيعي (أي الاستيلاء) في نماذج القوارض من الصرع ¹¹ و ¹² مريضا. ويمكن الجمع بين التسج?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
الاغاروز انصهار منخفضة	فيشر العلمية	BP1360-100	تذوب في وسائل الإعلام الجنين في 1.2٪
تسجيل وسائل الإعلام	فيشر العلمية	BP3581، P330-3، BP410-1، BP214-500، D16-1، C77-500	1 ملم كلوريد الصوديوم، 2.9 ملي بوكل، HEPES 10 مللى، و 1.2 ملم MgCl 2 و 10 ملي سكر العنب، 2.1 مم CaCl 2 الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 تقريبا مع هيدروكسيد الصوديوم N 1
Tricaine	آرجنت مختبرات	MS-222	0.02٪
α-بنغاروتوكسين	العلوم البيولوجية Tocris	2133	1 ملغ / مل
الزجاج الشعرية أنابيب	وارنر الصكوك	G120TF-3	سحب لمقاومة من 2 -7 MΩ
المشبك التصحيح مكبر للصوت	وارنر الصكوك	PC-505B	نستخدم مكبر للصوت وارنر في الوضع الحالي، المشبك؛ كسب تعيين في 2 بالسيارات / السلطة الفلسطينية وتصفية بسل وضعت في 2k. ويمكن استخدام نماذج مماثلة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
مرشح / مكبر للصوت	الدجاجة التكنولوجيا	FLA-01	نستخدم الدجاجة قبل مكبر للصوت؛ كسب تعيين في 10-20؛ قطع ضبط التردد في 2k-1؛ تصفية الشق في. ويمكن استخدام نماذج مماثلة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
محور عصبي A / D والبرامج مجلس Axoscope	الجزيئية الأجهزة	محور عصبي Digidata 1320A؛ Axoscope 8،2	ويتم جمع البيانات في Axoscope باستخدام فجوة خالية من وضع اقتنائها؛ أخذ العينات في 10 كيلوهرتز. ويمكن استخدام نماذج مماثلة والبرامج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
البيض المياه	الفوري المحيط		3 غرام ملح البحر المحيط فورية، 2 مل زرقة الميثيلين 0.1٪ في الماء منزوع الأيونات 10 مل