애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

요약

애벌레의 zebrafish forebrain에서 세포 필드 잠재력을 기록하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 강력한를 제공합니다 생체 내 읽기에서의 활동 압수 같은. 이 기술은 간질 관련 유전자 또는 convul​​sant 약의 투여에 의해 evoked 발작을 들고 유전자 변형 zebrafish의 애벌레와 함께 사용할 수 있습니다.

초록

간질은 미국에서 3 백만 명에 이르는 사람들과 최대 50,000,000명 전 세계적으로 영향을 미칩니다. 자연 부당한 발작의 발생으로 정의, 간질은 뇌 또는 유전자 변이에 대한 모욕의 결과로 획득 할 수 있습니다. 동물 모델 압류에 대한 노력은 주로 활용 설치류의 모욕 (convul​​sant 약물, 자극 또는 뇌 손상)과 유전자 조작을 (안티센스 최저, 상동 재조합 또는 transgenesis) 획득했습니다. Zebrafish는 쥐 기반 간질 연구에 귀중한 대안을 제공 할 수 척추 모델 시스템 ^1~3아르. Zebrafish는 척추 동물의 유전자 또는 개발 연구에서 널리 사용되며, 포유 동물에 대한 유전 적 유사성의 높은 학위를 전시 및 알려진 인간 단일 유전자 간질 변이 ~ 85 %를 homologs을 표현한다. 때문에 자신의 작은 크기 (길이 4~6mm)로, zebrafish의 유충은 초기 개발 및 arra 동안 100 μl의 낮은 유체 볼륨에 유지 할 수 있습니다멀티 잘 접시에 yed. 시약은 배아는 약물 관리를 단순화하고 테스트 화합물 ⁴ 생체 검사에서 빠른 있도록 개발 된 솔루션에 직접 추가 할 수 있습니다. 합성 oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, 아연 손가락 nuclease와 유전자 변형 접근 방식은 빠른 속도로 ^5-7 zebrafish의 유전자 최저 또는 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 속성은 zebrafish 연구 한테 그런 간질과 같은 신경 질환의 연구에서 동물에 비해 전례없는 통계 전력 분석 이점을 여유. 간질 연구를위한 "금 표준"중앙 뇌 구조 (즉, 발작), 효율적으로 애벌레의 zebrafish의 뇌 활동을 기록하는 방법에 발생한 이상 전기 방전을 감시하고 분석하는 것입니다 때문에 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 기존의 세포 녹화 기술의 적응이며, 그대로 zebrafish 애벌레의 뇌 활동의 안정적인 장기 모니터링 할 수 있습니다. 에스충분한 녹음은 유전자 변형 물고기에 기록 convul​​sant 마약과 자연 발작의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도 급성 발작에 표시됩니다.

프로토콜

1. 계란 생산 및 수집

1. Zebrafish 축산는 이전 ⁸ 설명한 표준 절차를 따릅니다. 간단히, 성인 zebrafish는 장소에 디바이더와 탱크를 사육에 자리 잡고 있습니다. 방에 불이 다음 아침에 왔을 때, 디바이더는 탱크와 생선이 방해받지 결합 시간의 약 20-60 분 수 있습니다 사육에서 제거됩니다.
2. 번식 탱크에서 달걀은 스트레이너에 수집 달걀 물에 헹구어 있습니다. 달걀은 다음 달걀 물과 페트리 접시으로 전송됩니다. Unfertilized 달걀과 잔해가 전송 피펫을 사용하여 제거됩니다.
3. 보육에 수집 된 계란 (28-32 ° C)를 포함하는 장소 페트리 접시. 계란 이틀 후 수정을 (dpf) 주변, 부화 후, 전송 피펫과 융모막 및 기타 이물질을 제거합니다.
4. 원하는 일에 후 수정을 (3-8 dpf)는 실온에서 실험실 벤치에서 자유롭게 수영 유충과 장소를 포함하는 페트리 접시를 제거합니다.

2. Microelectrode 당겨 및 준비

1. micropipette의 풀러를 사용하여 1.2 mm OD 붕규산 유리는 바보 퍼티 램프 위에 누워하여 150mm 페트리 접시 또는 빈 피펫 상자에 두 개의 바늘과 가게에 모세관 당긴다. 바늘 사전에 당겨 수 있습니다. 다른 OD 유리 모세 혈관이 가능한 앰프 headstage의 종류에 따라 사용할 수 있습니다.
2. Nalgene 주사기 필터 (4 mm)과 Microfil 필라멘트 (워너 정밀 계측기) 첨부와 1 ML의 주사기를 사용하여 세포 녹화 솔루션 (2 M NaCl)과 Backload microelectrode. 남은 몇 또는 전혀 거품이 될 때까지 바늘 끝 방향으로 bolus를 흔들어하거나 누릅니다.

3. 한천의 고정

1. 계란 물에 1.2 % 낮은 녹는 점 한천의 새로운 솔루션을 준비합니다. ~ 37 ° C.에서 물 목욕 세트의 장소 한천 솔루션
2. 냉장고에 기록 챔버 및 장소 (5-10 분)와 coverslip을 준비합니다. 녹음 챔버 matc해야합니다H는하는 전기 생리학의 장비에 사용됩니다. 우리는 워너 악기 (모델 RC-26GLP)에서 로우 프로파일 공개 다이아몬드 목욕 이미징 챔버를 사용합니다.
3. 파스퇴르 또는 전송 피펫, 깨끗한 페트리 접시 판에 달걀 물을 작은 물방울에 놓으 애벌레의 zebrafish을 사용합니다. 이 비말에, 마취 (0.02 % tricaine)과 전신 마비 에이전트 (1 MG / ML α-bungarotoxin)를 포함하는 솔루션의 비말을 추가합니다.
4. 운동의 손실 (5-10 분)에 대한 zebrafish를 모니터링합니다.
5. 냉동실에서 coverslip / 녹음 챔버를 제거합니다. stereomicroscope의 무대에 챔버를 놓습니다. 전송 피펫 사용 비말과 coverslip / 녹음 챔버로 전송 솔루션 (물고기)에 1.2 % 낮은 녹는 점 아가로 오스의 여러 ML을 섞는다.
6. 피펫 팁 또는 고급 무딘 바늘, 물고기의 등 부분은 아가로 오스 겔 표면에 노출 될 수 있도록 stereomicroscope 아래에 위치 애벌레을 사용합니다. 다음 평면 주걱 전송에게 한천 B를 사용하여 강화 (5-10 분)에 아가로 오스 허용전기 생리학의 유정에서 설정 기록 챔버에 고정.

3. 세포 필드 레코딩

1. 녹음 챔버에 zebrafish 기록 매체 2-5 ML을 추가합니다. 약물 변경 사항은 약 1 ML / 분의 속도로 레코딩 솔루션을 필요 perfuse 챔버 경우. 녹화 솔루션의 어떠한 산소가 필요하지 않습니다.
2. 3 차원 micromanipulator에 장착 증폭기 headstage에 microelectrode를 (약 1 μm 팁 직경 MΩ 2-7)를 넣습니다. micromanipulator은 움직임과 조정의 범위를 허용 할 수있는 적절한 위치에 있는지 확인합니다. 무대에서 내려 높은 현미경의 전망의 비행기, 그리고 위하고 약간 zebrafish의 머리 앞의 지점으로 낮은 정밀 조정을 사용하여에 microelectrode 팁을 가져와.
3. "전류 클램프"모드 제로 전극의 앰프를 갖추고 있습니다.
4. 그냥 s를 만지고 있도록 정밀 조정 할 낮은 전극 팁을 사용하여약간 forebrain 앞의 zebrafish의 urface.
5. 이 zebrafish의 피부를 구멍까지 미세 조정 단계를 사용하면 전극 팁을 부활 시켰습니다. forebrain에 몇 미크론를 해결 한 후 전극을 향상 할 수 있도록 허용합니다.
6. Axoscope 소프트웨어를 사용하여 전류 클램프 모드에서 전기 활동을 기록합니다. 데이터는 10 kHz에서의 샘플링 속도에서 획득됩니다.

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결과

한천 - 임베디드 zebrafish 애벌레의 forebrain에 기록 electrographic 발작과 같은 방전의 예는 그림 1에 표시됩니다. 또는 1 밀리미터 picrotoxin (B에, 8 dpf),이 샘플에서 큰 진폭 멀티 스파이크 버스트 방전은 convul​​sant 약의 목욕 응용 프로그램을, 40 밀리미터 pilocarpine (6 dpf의)에 의해 evoked했다. 이 음반에 고정하고 한천 - 임베디드 zebrafish는 지속적으로 90 분에에 모니터링하고 있습니다. 물고?...

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토론

여기에 제시된 세포 녹화 방법은 뇌 활동의 매우 민감하고 빠른 분석이 가능합니다. 이 음반은 일반적으로 간질 환자 ^{11 12} 쥐 모델에서 비정상적인 전기 방전 (즉, 발작)의 존재를 평가하는 데 사용 electroencephalographic (EEG) 모니터링 유사합니다. 여기에 표시된대로 세포 녹음, 약리 조작과 함께 사용할 수 있습니다. 레코딩 이러한 유형의도 유전자 변형 zebrafish 잠재적 인 간질 phenotypes?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
아가로 오스 낮은 녹는	피셔 - 과학	BP1360-100	1.2 %에서 배아 미디어에서 디졸브
기록 미디어	피셔 - 과학	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 ㎜ NaCl, 2.9 MM KCl, 10 MM의 HEPES, 1.2 MM MgCl 2, 10 MM 덱스 트로 오스, 2.1 MM CaCl 2 1 N NaOH로 약 7.3로 산도를
Tricaine	은빛 연구소	MS-222	0.02 %
α-bungarotoxin	Bioscience Tocris	2133	1 MG / ML
모세관 유리 튜브	워너 악기	G120TF -3	MΩ이 -7의 저항에 당겨
패치 클램프 증폭기	워너 악기	PC-505B	우리는 전류 클램프 모드에서 워너 증폭기를 사용하여, 이득은 2K로 설정 2 MV / PA 및 베셀 필터에서 설정합니다. 비교 모델은 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다.
필터 / 앰프	백조 기술	FLA-01	10-20에서 설정 게인; 1 2K로 설정 컷 - 오프 주파수, 노치 필터에 우리는 백조 사전 증폭기를 사용합니다. 비교 모델은 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다.
축삭 A / D 보드와 Axoscope 소프트웨어	분자 장치	축삭 Digidata 1320A, Axoscope 8.2	데이터는 간격이없는 수집 모드를 사용 Axoscope에 수집, 10 kHz에서에서 샘플링. 비교 모델 및 프로그램은 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다.
달걀 물을	인스턴트 오션		3g 인스턴트 오션 바다 소금, 10 ML 탈 이온수 2 ML 0.1 % 메틸렌 블루