Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Resumo

Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um forte In vivo Leitura de apreensão como atividade. Esta técnica pode ser utilizada com larvas do peixe geneticamente modificada carregando epilepsia genes relacionados ou convulsões evocadas pela administração de fármacos convulsivos.

Resumo

A epilepsia afeta cerca de 3 milhões de pessoas nos Estados Unidos e até 50 milhões de pessoas em todo o mundo. Definido como a ocorrência de convulsões espontâneas não provocados, a epilepsia pode ser adquirido como resultado de um insulto ao cérebro ou a uma mutação genética. Os esforços para convulsões modelo em animais têm utilizado principalmente adquiridos insultos (fármacos convulsivos, estimulação ou lesão cerebral) e manipulações genéticas (knockdown antisense, a recombinação homóloga ou transgénese) em roedores. Zebrafish é um sistema modelo de vertebrados ^1-3 que poderia fornecer uma alternativa valiosa para roedor pesquisa baseada em epilepsia. Peixe-zebra são amplamente utilizados no estudo da genética de vertebrados ou de desenvolvimento, exibem um elevado grau de semelhança genética para os mamíferos e expressam homólogos de ~ 85% de humanos conhecidos mutações de um único gene de epilepsia. Devido ao seu tamanho pequeno (4-6 mm de comprimento), larvas de peixe-zebra pode ser mantida em volumes de fluidos tão baixo como 100 ul durante o desenvolvimento inicial e arraYED em multi-poços. Os reagentes podem ser adicionados directamente à solução em que os embriões se desenvolvem, o que simplifica a administração do fármaco e permitindo uma rápida no rastreio in vivo de compostos de teste ^4. Os oligonucleótidos sintéticos (morpholinos), mutagénese, dedo de zinco nuclease e abordagens transgénicas podem ser utilizadas para gerar rapidamente knockdown gene ou mutação no peixe-zebra ^5-7. Estas propriedades pagar estudos zebrafish uma vantagem sem precedentes análise estatística poder sobre roedores para o estudo de distúrbios neurológicos como a epilepsia. Porque o "padrão ouro" para a pesquisa a epilepsia é monitorar e analisar as descargas elétricas anormais que se originam em uma estrutura cerebral central (isto é, convulsões), um método eficiente para registrar a atividade cerebral em larvas do peixe-zebra é descrito aqui. Este método é uma adaptação de técnicas convencionais de gravação extracelular e permite a monitorização a longo prazo estável de actividade do cérebro em larvas do peixe intacta. Sgravações amplas são mostrados para convulsões agudas induzidas pela aplicação de banho de drogas convulsivas e apreensões espontâneas gravadas em um peixe geneticamente modificado.

Protocolo

1. Produção de ovos e Cobrança

1. Zebrafish criação segue procedimento padrão descrito anteriormente ^8. Resumidamente, zebrafish adultos são criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Quando as luzes da sala de vir na manhã seguinte, divisórias são removidas de reprodução tanques e os peixes são permitidos aproximadamente 20 a 60 minutos de tempo de acasalamento imperturbável.
2. Ovos de tanques de criação são coletados em uma peneira e lavadas com água de ovo. Os ovos são então transferidos para uma placa de Petri com água de ovo. Ovos não fertilizados e detritos são removidos utilizando uma pipeta de transferência.
3. Prato lugar Petri contendo os ovos recolhidos numa incubadora (28-32 ° C). Após eclosão dos ovos, cerca de dois dias após a fertilização (dpf), remova córion e qualquer outros detritos com uma pipeta de transferência.
4. No dia desejado pós-fertilização (3-8 dpf) remover uma placa de Petri contendo larvas livremente natação e lugar na bancada do laboratório à temperatura ambiente.

2. Microeletrodo Puxando e Preparação

1. Usando um extrator micropipeta, puxe de 1,2 mm de diâmetro externo de borosilicato capilar de vidro em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 mm ou caixa de pipeta vazio que coloca sobre rampas bolinha de borracha. As agulhas podem ser puxado com antecedência. Diferente OD capilares de vidro podem ser usados, dependendo do tipo de andar de entrada do amplificador disponível.
2. Microeléctrodo protelar o com solução de gravação extracelular (2 M NaCl) utilizando uma seringa de 1 ml com uma seringa de filtro Nalgene (4 mm) e de filamentos Microfil (Warner Instruments Precision) ligado. Agite ou o bolo em direção à ponta da agulha até que haja algumas bolhas ou nenhuma restantes.

3. Imobilização em Agar

1. Prepara-se uma solução fresca de 1,2% de agar baixo ponto de fusão em água ovo. Solução de agar em lugar de um conjunto banho de água a ~ 37 ° C.
2. Prepare uma lamela com câmara de gravação e coloque no freezer (5-10 min). A câmara de gravação deve MatCh que é utilizado na plataforma de electrofisiologia. Nós usamos um baixo perfil aberto diamante câmara de banho de imagem da Warner Instruments (modelo RC-26GLP).
3. Utilizando uma pipeta de Pasteur ou transferência, um peixe-zebra lugar larval em uma pequena gota de água ovo em uma placa de Petri limpa. Para esta gotícula, adicionar uma gota de uma solução contendo um anestésico (0,02% tricaina) e agente paralisante (1 mg / ml α-bungarotoxina).
4. Monitorar zebrafish para perda de movimento (5 a 10 min).
5. Retirar as lamelas / câmara de gravação do freezer. Coloque câmara no palco de um estereomicroscópio. Utilizando uma pipeta de transferência, misturar de alguns ml de 1,2% de agarose de ponto de fusão baixo com gota e solução de transferência (com peixe) para a câmara de lamela / gravação.
6. Utilizando uma ponta de pipeta ou agulha romba fina, larvas de posição sob o estereomicroscópio, de modo que o dorso do peixe é exposto à superfície do gel de agarose. Permitir agarose para endurecer (5-10 min), em seguida, utilizando uma espátula plana a transferência b agarbloquear a uma câmara de gravação criado em uma plataforma de eletrofisiologia.

3. Gravação de campo extracelular

1. Adicionar 2-5 ml de meio de registo para o peixe-zebra câmara de gravação. Se as mudanças de droga são de câmara, necessário perfundir com solução de gravação a uma velocidade de aproximadamente 1 ml / min. Não oxigenação da solução de gravação é necessária.
2. Inserir um microeléctrodo (aproximadamente 1 diâmetro de ponta um, 2-7 MQ) no andar de entrada do amplificador montado num micromanipulador tridimensional. Verificar se o micromanipulador está numa posição apropriada para permitir uma amplitude de movimento e ajustamento. Coloque a extremidade do microeléctrodo para dentro do plano de vista do microscópio, elevado para fora do palco, e utilizando o ajuste grosseiro inferior a um ponto imediatamente acima e ligeiramente à frente da cabeça do peixe-zebra.
3. Com o amplificador em "grampo-atual" modo de zero, o eletrodo.
4. Usando ajuste grosso inferior ponta do eletrodo para que ele só toca o surface do peixe-zebra, ligeiramente à frente da parte anterior do cérebro.
5. Usando etapas de ajuste fino avançar a ponta do eléctrodo até que perfura a pele do peixe-zebra. Deixar depositar e depois avançar o eletrodo vários microns em prosencéfalo.
6. Registrar a atividade elétrica no grampo de modo atual usando o software Axoscope. Os dados são adquiridos a uma taxa de amostragem de 10 kHz.

Resultados

Exemplos de descarga do tipo convulsivas electrográfico gravado no cérebro anterior de um agar-embedded larvas do peixe são mostrados na Figura 1. De grande amplitude de descarga explosão multi-pico nas amostras foi evocado por aplicação de banho de um fármaco convulsivo, 40 mM de pilocarpina (em A, 6 dpf) ou 1 mM de picrotoxina (em B, 8 dpf). Nestes registos, imobilizado e de ágar-embedded zebrafish são monitorados continuamente durante até 90 min. Peixe permanecem viáveis ​​nestas condi...

Discussão

O método de gravação extracelular aqui apresentada permite uma análise muito sensível e rápido de atividade cerebral. Estas gravações são análogos a monitorização (EEG) eletroencefalográficos vulgarmente usado para avaliar a presença de descarga eléctrica anormal (isto é, convulsões) em modelos de roedores de epilepsia e ¹¹ pacientes ^12. Gravações extracelulares podem ser combinadas com as manipulações farmacológicas, como mostrado aqui. Estes tipos de gravações pod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Agarose de fusão baixo	Fisher-Científico	BP1360-100	Dissolver em mídia de embrião em 1,2%
Mídia de gravação	Fisher-Científico	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM de NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM de HEPES, 1,2 mM de MgCl2, 10 mM de dextrose, 2,1 mM CaCl 2 o pH para aproximadamente 7,3 com NaOH 1 N
Tricaina	Argent Labs	MS-222	0,02%
α-bungarotoxina	Tocris Bioscience	2133	1 mg / ml
Um tubo de vidro capilar	Warner Instruments	G120TF-3	Puxar a uma resistência de 2 -7 MQ
Amplificador de fixação de membranas	Warner Instruments	PC-505B	Nós usamos um amplificador Warner no modo de fixação de corrente; Ganho fixado em 2 mV / PA e filtro de Bessel fixado em 2K. Modelos comparáveis ​​podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante.
Filtro amplificador /	Cygnus Tecnologia	FLA-01	Nós usamos um Cygnus pré-amplificador; Ganho fixado em 10-20; Frequência de corte fixada em 1-2K; filtro Notch IN. Modelos comparáveis ​​podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante.
Axon A / D bordo e software Axoscope	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2	Os dados são coletados em Axoscope usando lacuna livre modo de aquisição; amostragem de 10 kHz. Modelos comparáveis ​​e os programas podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante.
Água ovo	Instant Oceano		3 g Instantânea Oceano mar de sal, 2 ml de azul de metileno 0,1% em 10 ml de água deionizada