JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الدراسات البيوكيميائية البيوفيزيائية والتفاعلات بين المجالات بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ من مواجهة التحديات التقنية كثيرة، وأولها هو الحصول على المواد المناسبة الدراسة. توضح هذه المقالة بروتوكول لإنتاج وتنقية ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات الببتيد عبر الغشاء التي هي مناسبة لتحليل الهيكلية التي كتبها صدى حل المغناطيسي النووي (NMR) والتطبيقات التحليلية الأخرى.

Abstract

التفاعلات الجسدية بين المجالات ألفا حلزونية للدهون، بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من لعب دورا حاسما في للطي والتجمع مجمعات البروتين غشاء والعمليات الدينامية في مثل عبر الغشاء (TM) إشارات وتنظيم مستويات البروتين على سطح الخلية. فهم السمات الهيكلية قيادة رابطة تسلسل معين يتطلب تحليلات متطورة البيوكيميائية البيوفيزيائية والمجمعات الببتيد TM. ومع ذلك، فإن hydrophobicity متطرفة من المجالات TM يجعل من الصعب جدا على التعامل مع تقنيات الكيمياء باستخدام معيار الببتيد، وإنتاج المواد الدراسية مناسبة غالبا ما يثبت التحدي باهظة. تحديد الظروف التي يمكن أن الببتيدات اعتماد التشكل حلزونية الشكل مستقرة والمجمعات يضيف تلقائيا على مستوى مزيد من الصعوبة. هنا نقدم إجراء لإنتاج وطي أو مثنوي مغاير المجمعات الببتيد TM من المواد التي يتم التعبير عنها في E. مضيق بين قمتينالأول، مما يسمح بإدراج تسميات النظائر المستقرة لالرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو غير الطبيعية الأحماض الأمينية لتطبيقات أخرى غير مكلفة نسبيا. والابتكار الرئيسي في هذا الأسلوب هو أن يتم إنتاج مجمعات TM وتنقيته والتجمعات (ثاني كبريتيد-crosslinked) المرتبطة تساهميا التي يمكن أن تشكل هياكل مستقرة، والقياس المتكافئ متجانسة عندما أعيد إلى الدهون والمنظفات أو غيرها من المواد غشاء المحاكاة. نقدم أيضا إجراءات بعناية الأمثل للتعبير وتنقية التي تنطبق على قدم المساواة سواء المنتجة أو واحدة المجالات TM المجمعات crosslinked وتقديم المشورة للتكيف هذه الأساليب لتسلسل TM الجديدة.

Introduction

تفاصيل هذا البروتوكول إجراء ضعنا لإنتاج ثاني كبريتيد المجمعات استقرت عبر الغشاء من الببتيدات (TM) للدراسات الهيكلية باستخدام NMR الحل. الإجراء يستفيد من التعبير القوي التي يوفرها نظام الانصهار ΔtrpLE1413 (انظر أدناه)، ويسمح إنشاء المجمعات الببتيد TM تكوين المعرفة باستخدام تقنيات متطورة وضع العلامات النظائر مستقرة-NMR لتجارب حديثة متعددة الأبعاد. لقد استخدمنا هذه التقنيات لتحديد هياكل NMR عدة كشفت معلومات جديدة هامة حول كيفية تجميع الخلايا اللمفاوية-تفعيل immunoreceptors من عدة مفارز بروتين الغشاء من خلال التفاعل بين المجالات التي TM (مشاركة مؤخرا في 1). هذه التقنيات قابلة للتطبيق على العديد من أنظمة البروتين الغشاء، فضلا عن مجموعة واسعة من الأساليب التحليلية المصب بالإضافة إلى NMR الحل. في حين أن المثال المذكور هنا يستخدم بقايا السيستين الأصليلإنشاء مجمع الذي يحاكي بشكل طبيعي ثاني كبريتيد العبودي البروتين، وتصميم على ما يرام أيضا مناسبة لخلق السندات ثاني كبريتيد هندسيا لتحقيق الاستقرار في المجمعات التي تقام عادة معا عن طريق أضعف التفاعلات غير التساهمية، مثل هومو ومثنوي مغاير المجمعات TM من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) بين أفراد الأسرة أو البروتينات 2-4 heterodimeric αβ المجمعات إنتغرين 5،6.

تسلسل الببتيد مسعور للغاية مثل تلك المستمدة من الدهون طبقة ثنائية، والتي تمتد أجزاء من البروتينات TM هي الموضوعات الصعبة للغاية للدراسات كيميائية حيوية والفيزيائية الحيوية. بالإضافة إلى كونها صعبة للغاية لمعالجة باستخدام البروتين القياسية وتقنيات الكيمياء الببتيد، فإنها غالبا ما تكون سامة جدا للخلايا وبالتالي فهي صعبة لإنتاج recombinantly. نحن 7،8 9-11 وغيرها كان لها كبير معربا عن نجاح هذه تسلسل الببتيد الصعب في البكتيريا كما هو الحال في الإطار كربوكسي لمحطةاندماج لنسخة معدلة من تسلسل ΔtrpLE1413 المستمدة من E. القولونية الحزب OPERON 12. يمكن أن تنتج عن ببتيد ~ 13 كيلو دالتون trpLE المشفرة بواسطة هذا التسلسل عند مستويات مرتفعة في ظل المروج T7 ويتم ترجمة تماما لإدراج الهيئات حيث يتم التحايل المشاكل المتعلقة سمية و / أو عدم الاستقرار. تعديل تسلسل إضافة محطة الأمينية 9-13 و الحامض الاميني العلامة القضاء على بقايا ميثيونين الداخلية والسيستين من تسلسل 14 trpLE يسمح trpLE الببتيد اندماج ليكون منقى من قبل اللوني تقارب المعادن ايون وهضمها باستخدام بروميد السيانوجين (CNBr ) للافراج عن تسلسل الببتيد المطلوب. وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح للتعبير عن أكثر من اثني عشر سلاسل مختلفة مثل اندماج trpLE تمثل شظايا البروتين غشاء التي تحتوي على ما يصل إلى أربعة مجالات TM (7،8 والنتائج غير المنشورة، وانظر أيضا قسم المناقشات).

الالابتكار الرئيسية في هذا البروتوكول هو تحديد الشروط التي بموجبها غير منظم وقابل للذوبان جدا سيئة trpLE-TM اندماج يمكن أن يكون بكفاءة ثاني كبريتيد-crosslinked في سياق تبسيط العمل. كما تم عدة جوانب ذات الإنتاجية العالية المناولة والتعبير وتنقية المنتجات الببتيد الأمثل بدقة، والتوصيات المقدمة هنا هي نفس القدر من الأهمية لإنتاج ثاني كبريتيد غير crosslinked-(أحادى) منتجات الببتيد TM.

Protocol

1. الاستنساخ وتصميم تعبيد

استنساخ متواليات من الفائدة في ناقلات PMM الببتيد (التي يمكن توفيرها حسب الطلب) باستخدام HindIII والمواقع تقييد BamHI (انظر الشكل 1). وينبغي إدراج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي تتضمن، وفقا للترتيب التالي: موقع HindIII؛ كودون واحد وميثيونين لانشقاق CNBr، وE. القولونية كودون الأمثل الببتيد تسلسل الترميز؛ لكودون وقف؛ موقع BamHI. ينبغي القضاء على جميع methionines أخرى في الببتيد وينبغي تجنب تسلسل ثنائي الببتيد ASP المؤيد وسوف أيضا أن المشقوق في الظروف الحمضية.

وينبغي الأخذ A بقايا السيستين فريدة من نوعها في كل تسلسل الببتيد وفقا لتحديد المواقع المطلوب من ثاني كبريتيد تشعبي في مجمع النهائي، وينبغي تحور جميع cysteines أخرى لسيرين. البلازميد يحمل كاسيت المقاومة الكاناميسين للاختيار.

2. التعبير عن trpLE-peptiدي فيوجن

  1. وتشكل العقيمة مرشح M9/Kan المتوسطة النمو ضئيلة (0.1 ملي CaCl 2، 2 مم MgSO 4، 3 ز / L KH 2 PO 4، 7.5 غ / L نا 2 HPO 4 · 2H 2 O، 0.5 جم / L كلوريد الصوديوم، 1 غرام / لتر كلور NH 4، 4 ز / L الجلوكوز، 50 كبريتات الكاناميسين ملغ / L). تكملة مع سنتروم الزنك لإكمال لتوفير B-الفيتامينات والمعادن النزرة: حل 1 قرص في 40 مل O 2 H مع خلط لمدة 30 دقيقة، الطرد المركزي لإزالة المواد غير القابلة للذوبان ومعقمة تصفية طاف البرتقال متجر في محلول C ° 4 في الظلام لتصل إلى 2 أسابيع، واستخدام 4 مل / لتر في M9.
    ملاحظة: قد يتم تضمين 15 N التخصيب NH 4 الكلورين، 13 C-المخصب الجلوكوز أو غيره من السلائف مستقرة-النظائر التي تحمل علامات في M9 المتوسطة في هذه المرحلة اذا شئت.
  2. تطعيم 100 مل ثقافة كاتب من تحول حديثا BL21 E. سلالة (DE3) الإشريكية المتوسطة في M9/Kan. تنمو بين عشية وضحاها في C ° 37 مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  3. في صباح اليوم التالي، والتحقق من OD 600 من ثقافة كاتب - هذا ينبغي أن يكون في حدود 2 أو أكبر. تمييع الثقافة 100 مل كاتب في حجم L 1-سنتروم مجموعه M9 تستكمل المتوسطة. انقسم الى اثنين قوارير L 2 حيرة (500 مل الثقافة في كل قارورة) وينمو بمعدل 37 ° C عند 140 دورة في الدقيقة تهتز حتى تصل إلى 600 OD 0.6.
  4. تعيين درجة الحرارة إلى 18 ° شاكر C وتستمر لتهز 1 ساعة، والسماح لتبرد تماما الثقافات قبل التعريفي.
  5. أخذ عينة ما قبل التوجيهي للSDS-PAGE تحليل (ما يعادل 50 ميكرولتر من ثقافة في OD 600 = 1)، ثم يضاف إلى تركيز IPTG 0.1 ملم النهائي للحث على التعبير عن الانصهار trpLE الببتيد. تواصل نموها في 18 ° C/140 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها (16-20 ساعة) تحت تحريض IPTG.

3. إدراج إعداد الجسم والنيكل ربط مصفوفة

  1. وOD النهائي 600 من الثقافات بين عشية وضحاها في التعبير المتوسطة الحد الأدنى هو متغير وSHOULD يكون بين 2.5 و 5.0. أخذ عينة للتحليل SDS-PAGE (ما يعادل 50 ميكرولتر من ثقافة في OD 600 = 1) وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في ز X 5،000.
  2. إعادة تعليق بيليه الخلية من الثقافة L 1 في 50 مل العازلة تحلل (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 20 ملي β-ME، 0.2 M كلوريد الصوديوم). ويمكن تخزين تعليق خلية مجمدة لتجهيز في وقت لاحق.
  3. ليز الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد في الطاقة الإنتاجية القصوى لمدة 1 دقيقة والباقي على الجليد لمدة 5 دقائق. نستخدم Sonicator Misonix 3000 (خرج 600 واط كحد أقصى) مع طرف ½ بوصة عالية الكثافة للاستبدال. تكرار صوتنة / التبريد لمدة ثلاث دورات.
  4. جمع غير قابلة للذوبان إدراج الجسم (IB) المواد بواسطة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في XG 20000 وتجاهل طاف. ويجوز للفضفاضة، طبقة رقيقة من الخلايا الحطام الفاتحة تكون مرئية على رأس بيليه IB كثيفة، ويمكن غسلها بعيدا عن استخدام المياه أو المخزن المؤقت مع الإثارة لطيف. يمكن تكرار الخطوات 3.3 و 3.4 لتحسين نقاء الكسر إذا IB منتدياتالحمراء. ينبغي أن تؤخذ عينات من المواد وطاف بيليه لتحليل SDS-PAGE لتأكيد trpLE-TM توطين الانصهار للهيئات إدراج.
  5. حل الكريات في محلول IB غوانيدين (6 M الجوانيدين حمض الهيدروكلوريك، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، تريتون 1٪ X-100، 5 ملي β-ME)، وذلك باستخدام 25-50 مل لكل لتر من الثقافة معالجتها. وهذه الخطوة تتطلب عدة ساعات مع الانفعالات وصوتنة خفيفة في بعض الأحيان.
  6. مسح المحللة IB بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 ساعة عند 75،000-100،000 XG ° C. و 20 صب طاف وفلتر من خلال غشاء ميكرون 0.2.
  7. الجمع بين مسح IB المحللة، في أنبوب 50 مل المخروطية أو أكبر سفينة يمكن إغلاق آمن، مع الراتنج تقارب النيكل التي تم غسلها بالماء ومعايرتها لحل الجوانيدين. استخدام الراتنج 3-4 مل لكل لتر من استقر الثقافة المجهزة للاندماج التي تعبر عن لدرجة مماثلة لtrpLE-DAP12TM هو موضح هنا (الشكل 3، لين 2). ربط دفعة من احتضان بين عشية وضحاها في غرفة ر emperature مع خلط لطيف.

4. على العمود مؤكسد يشابك

  1. تحميل التعليق IB الراتنج المحللة / النيكل في عمود خطورة تدفق فارغة بدعم السرير يسهل اختراقها، مضيفا مستمر حتى وحدة التخزين بالكامل من خلال تدفقات. جمع وطرح جانبا flowthrough، والتي قد لا تزال تحتوي على البروتين الانصهار غير منضم.
  2. غسل الراتنج النيكل من تدفق الجاذبية مع وحدات التخزين السرير 5 من محلول اليوريا (8 M اليوريا و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم) تحتوي على 5 ملي β-ME.
  3. غسل الراتنج النيكل مرة أخرى مع وحدات التخزين السرير 5 من محلول اليوريا دون ME-β.
  4. غسل الراتنج النيكل مرة الثالثة مع وحدات التخزين السرير 5 من محلول اليوريا الذي تم تستكمل مع 20 ميكرون كبريتات النحاس 4 و 2 مم أكسدة الجلوتاثيون. بعد هذا يغسل، إغلاق منفذ العمود واحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح القصوى تشكيل السندات ثاني كبريتيد.

5. TFA شطف والكمي

المحتوى "> تنبيه: حمض Trifluoroacetic (TFA) يؤدي بحروق شديدة على ملامسة الجلد والأبخرة هي مزعجة للغاية وينبغي أن تستخدم فقط TFA المركزة في الدخان هود الكيميائية المعتمدة مع حماية العين وقفازات اللاتكس غير تحقق من التوافق الكيميائي للجميع. المواد المستخدمة؛ البولي بروبلين متوافق مع جميع الخطوات من هذا البروتوكول.

  1. تغسل الحل اليوريا المؤكسدة السرير مع وحدات التخزين 10 من المياه وتجفيف السرير عمود من خلال تطبيق خط فراغ إلى مخرج العمود.
  2. إغلاق منفذ عمود وإضافة وحدات السرير 1.5 من TFA (99-100٪) أنيق. تحريك الراتنج النيكل مع ملعقة صغيرة لضمان التعرض حتى لحمض واحتضان لمدة 5 دقائق. فتح منفذ العمود وجمع شطافة الحامض، الضغط بلطف مع حقنة أو مضغوط الخطوط الجوية إذا لزم الأمر لطرد جميع من السائل.
  3. كرر الخطوة شطف حمض مع حجم السرير آخر TFA 1.5 من أنيق. العمل بسرعة على هذه الخطوة لتجنب تفكك كامل للbeadeد الاغاروز المصفوفة. يمكن تحديد العائد البروتين في هذه المرحلة وفقا للمعادلة بئر لامبرت ومعامل الانقراض النظرية المولي من تسلسل trpLE الببتيد. تمييع عينة من شطافة TFA (1:20 حتي 01:50) في trifluoroethanol (TFE) وقياس الامتصاصية في 280 نانومتر، وذلك باستخدام TFA / TFE في التخفيف نفس فارغة.

6. CNBr الهضم

تنبيه: بروميد السيانوجين (CNBr) هي سامة للغاية وينبغي التعامل معها فقط في غطاء محرك السيارة الكيميائية المعتمدة الدخان. هناك حاجة على الاطلاق بما في ذلك معدات الوقاية الشخصية نظارات السلامة، والقفازات معطف المختبر غير اللاتكس. CNBr هو رد الفعل للرطوبة ويجب أن يقدم إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح. اتصل بمكتب السلامة المؤسسية حصول على تعليمات حول تحييد / التخلص من CNBr الملوثة حلول والمواد.

  1. يخفف من حمض شطافة إلى 80٪ تركيز TFA النهائي بالإضافة نقطه نقطه من الماء في حين خلط بلطف. إذا كان يعجل أشكال، وهوي ي مرة أخرى وحدة تخزين صغيرة (0.5 إلى 1 مل) من TFA أنيق حتى حل يوضح، ثم إعادة الصحيحة إلى 80٪ مع الماء. اتخاذ 5 ميكرولتر قبل هضم عينة لتحليل SDS-PAGE وتجميد في النيتروجين السائل وlyophilizing العينة على الفور.
  2. إضافة إلى ما يقرب من بلورات CNBr 0.2 جم / مل، مع الحرص على الموازنة بين المواد الكيميائية السامة بأمان في أنابيب مغلقة قبل وزنه، أو باستخدام ميزان داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية الدخان. المزيج بلطف حتى يذوب تماما. طرد وختم وعاء التفاعل تحت غاز خامل (النتروجين أو الأرجون تيار) واحتضان 3-4 في ساعة درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الضوء.
  3. اتخاذ 5 ميكرولتر بعد هضم عينة للتحليل SDS-PAGE وتجميد ويجفد على الفور. نقل رد الفعل هضم السليلوز إلى كاسيت أو أنابيب غسيل الكلى مجدد (خلات السليلوز سوف تذوب في حمض مركزة) مع قطع الوزن الجزيئي من 3.5 كيلو دالتون أو أقل، وفقا لحجم المجمع الببتيد المتوقعة. Dialyze بين عشية وضحاها إلى 4 L من الماء فيالكيميائية غطاء الدخان للحد من تركيز TFA وتتحلل أي CNBr غير المتفاعل. يترك مجالا في الكاسيت أو أنابيب غسيل الكلى لزيادة كبيرة في حجم (بما يصل الى اثنين إلى ثلاثة أضعاف) خلال غسيل الكلى بين عشية وضحاها.
  4. إزالة محلول التفاعل مع مدال يعجل علقت من كاسيت غسيل الكلى أو أنابيب (أكثر من البروتين سوف يعجل عندما يتم تقليل تركيز TFA) ونقل إلى أنابيب التعليق 50 مل المخروطية. تجميد ويجفد لإزالة المياه وآثار CNBr / TFA. هذه الخطوة من المرجح أن تتطلب عدة أيام.
    تنبيه: يتعين على كل من رد الفعل هضم مدال والمياه غسيل الكلى لا تزال تعامل على أنها سامة والتعامل معها / التخلص مع الاحتياطات المناسبة.
  5. يجوز تحليل العينات من الثقافات من مراحل ما قبل الحصاد والحث، وإدراج طاف بيليه والجسم، وCNBr شطافة TFA-هضم المواد بواسطة SDS-PAGE. إعداد عينات عن طريق التسخين إلى 95 ° C في LDS إينفيتروجن sampl NuPAGEه العازلة. وينبغي إعداد TFA شطافة وهضم العينات في ظروف كل من خفض وغير المختزلة لتسهيل تحديد وتقييم المنتج يشابك التأكسدي.
  6. فصل العينات على 12٪ NuPAGE مكرر تريس هلام مادة الأكريلاميد مسبقة الصب باستخدام SDS-MES عازلة للتشغيل الأمثل للقرار منتجات أصغر هضم.

7. عكس المرحلة HPLC تنقية ثاني كبريتيد-crosslinked مجمعات الببتيد

  1. حل ما يصل الى 100 ملغ من منتجات هضم مجفف بالتجميد في 2-3 مل حمض الفورميك أنيق وتحميلها في إحدى إعدادي النطاق (21.2 × 150 مم) اجيلنت ZORBAX SB-300 C3 PrepHT عمود في المذيبات A (الأسيتونيتريل عادة 10-20٪ أو 5 -10٪ الأيزوبروبانول في الماء مع TFA 0.1٪).
  2. أزل المنتجات دايجست في التدرج من المذيبات B (الأسيتونيتريل أو الأيزوبروبانول مع TFA 0.1٪) خلال حجم العمود لا يقل عن 5. انظر المناقشة للحصول على اقتراحات بشأن اختيار الظروف المثلى للالتدرج تسلسل الببتيد مختلفة.
  3. أخذ50-100 ميكرولتر من العينات كل جزء HPLC لSDS-PAGE تحليل وتجميد ويجفد على الفور. إزالة المذيبات HPLC سريعا ويجب أن يكون كاملا في 1-2 ساعة.
  4. إعداد عينات مجفف بالتجميد HPLC لSDS-PAGE عن طريق تسخين لC ° 95 في NuPAGE إينفيتروجن العازلة عينة LDS مع عدم وجود عامل مختزل. تبريد وتقسيم كل عينة بالتساوي في أنابيب microcentrifuge 2، بإضافة 100 مم إلى DTT واحد منهم لفترة وجيزة وإعادة التسخين.
  5. فصل انخفاض وغير المنخفض عينات HPLC على 12٪ NuPAGE مكرر تريس هلام مادة الأكريلاميد مسبقة الصب مع MES-SDS تشغيل المخزن المؤقت على النحو الوارد أعلاه. الصغيرة، الببتيدات مسعور في كثير من الأحيان لا يستغرق Coomassie جيدا وصمة عار قد لا تعمل في أوزانها الجزيئية المتوقعة. ومع ذلك، يجب مقارنة العينات انخفاض وغير المنخفض تسهيل التعرف على المنتجات الببتيد crosslinked وتقييم النقاء.
  6. تحليل المرشح التي تحتوي على الببتيد الكسور بواسطة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الطيران من (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي (انظر المناقشة) لتحديد الأنواع ذات الأهمية وتأكيد كتلته المتوقعة.
  7. الجمع، وتجميد يجفد الكسور HPLC يحتوي على نقية، crosslinked مجمع الببتيد TM واتخاذ الوزن الجاف للمنتج النهائي لتحديد العائد. قد الكسور ذات المحتوى العالي الأيزوبروبانول لا تزال مجمدة. إذا الكسور الببتيد تجف وصولا الى فيلم بدلا من منتج مجفف بالتجميد رقيق، وإعادة حل الفيلم تماما في كمية صغيرة من hexafluoroisopropanol النقي (HFIP)، وتجميد يجفد مرة أخرى. يجب على المنتج HFIP المعالجة تكون صغيرة، مخروط الأبيض الذي يميل بسهولة وزنه.

النتائج

مستوى التعبير عن تحقيق اندماج trpLE هو متغير ويعتمد اعتمادا كبيرا على تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد المرفقة. ويبين الشكل 3 تحليل SDS-PAGE الحث قبل (حارة 1) وتستغرق وقتا من الحصاد (حارة 2) عينات من الثقافة التي أسفرت عن حوالي 120 ملغ من الذهب الخالص، والانصهار trpLE-DAP1...

Discussion

التعبير عن trpLE-TM اندماج. في تجربتنا، يتم التعبير عن سوء trpLE-TM اندماج في ثقافة المتوسط ​​الغنية في 37 ° C، والظروف الثقافة الموصوفة هنا أثبتت نجاحها لسلاسل مختلفة تحتوي على العديد من 1-4 TM المجالات مع عائدات تتراوح 50 حتي 150 ملغ / لتر من الانصهار، نقية سليمة. اندماج ترم?...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgements

يتم توفير التمويل لهذا العمل من قبل الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (NHMRC المشروع منحة ل1011352 MEC وMJC؛ المستقلة البنية التحتية معاهد البحوث خطة دعم [IRIISS] منحة لWEHI) وحكومة فيكتوريا (VESKI الابتكار زمالة لMEC؛ الفيكتوري الدولة الدعم الحكومي البنية التحتية التشغيلية لWEHI). MEC زميل الملكة اليزابيث الثانية لمجلس البحوث الأسترالية. EFXB يعترف بدعم من برنامج المنح الدراسية هيلدا نورما شوستر في جامعة ملبورن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
السيانوجين بروميد ALDRICH P.No-C91492، CAS-506-68-3 مادة خطرة. البضائع الخطرة. السامة جدا عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع. الاتصال مع الأحماض يحرر غاز سام للغاية. شديدة السمية للكائنات المائية، قد تسبب على المدى الطويل آثار سلبية في البيئة المائية.
Trifluoroacetic حمض SIGMA-ALDRICH P.CODE-1000984387 عدد CAS، 76-05-1 مادة خطرة. البضائع الخطرة. وأسبابه بحروق شديدة. ضار عن طريق الإستنشاق. ضارة بالكائنات المائية، قد تسبب على المدى الطويل آثار سلبية في البيئة المائية.
2-المركابتويثانول SIGMA-ALDRICH P.No M7154، CAS 60-24-2 رقم مادة خطرة. البضائع الخطرة. سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع. تهيج الجلد. خطر وقوع أضرار خطيرة للعيون. قد تسبب حساسية الجلد عن طريق الاتصال شديدة السمية للكائنات المائية، قد تسبب على المدى الطويل آثار سلبية في البيئة المائية.
1،1،1،3،3،3-Hexafluoro-2-بروبانول SIGMA-ALDRICH رقم المنتج 52512، CAS-لا. 920-66-1 مادة خطرة. البضائع الخطرة. ضار عن طريق الإستنشاق وإن بلع. تسبب الحروق.
حمض الفورميك ميرك KGaA K41186564 القابلة للاشتعال السائلة وبخار. يسبب حروقا جلدية شديدة والأضرار التي تصيب العين.
اليوريا UNIVAR، AJAX FINECHEM رقم المنتج، 817، CAS-لا 57-13-6 عند تسخينها، ديسمبرomposes إلى ثاني أكسيد الكربون والأمونيا، وإذا أحرقت، تنبعث كميات صغيرة من أكاسيد النيتروجين. يمكن أن يسبب احمرار وتهيج الجلد والعينين.
الجوانيدين هيدروكلوريد Amresco P.No-M110، CAS رقم: 50-01-1 ضار إذا ما ابتلع، والأسباب الخطيرة تهيج العين، ويسبب تهيج الجلد، السمية الحادة عن طريق الفم، الجلد مهيجة مهيجة العين.
TRITON X-100 SIGMA عدد T8532-المنتج CAS رقم: 9002-93-1 تريتون X-100 هي المنظفات غير أيوني، العنصر النشط 100٪، والذي يستخدم غالبا في التطبيقات الحيوية لإذابة البروتينات. تريتون X-100 لا يوجد لديه خصائص مضادة للميكروبات ويعتبر معتدل نسبيا غير يبدل طبيعة المنظفات
له لاختيار النيكل والانجذاب هلام SIGMA-ALDRICH كتالوج-P6611 ارقام IS-اختار جل تقارب النيكل هو معدن أيون يجمد تقارب اللوني (IMAC) المنتج. وHIS-اختار نيكش تقارب الهلام هو كلاب الملكية quadridentate على الاغاروز مطرز المكلفة النيكل التي تم تصميمها خصيصا لربط الحامض الاميني التي تحتوي على البروتينات.
(-)-الجلوتاثيون، تتأكسد SIGMA-ALDRICH كتالوج الأسطوانات 150568
Misonix S-3000 sonicator QSONICA S-3000 (توقف) ماكس انتاج الطاقة 600 واط. 1/2-inch استبدال معلومات سرية التحقيق يأخذ 1/2-inch عالية الكثافة، نصائح كبيرة الحجم ومجموعة من كثافة عالية، وانخفاض الحجم النصائح. أقرب النماذج المتاحة حاليا من هذه الشركة هي Q500 Q700 و.
RP-HPLC: نظام بيولوجي اللوني DuoFlow، الإصدار 5.3 البرمجيات بيو راد مختبرات كتالوج ارقام 760-0047، التكوين رقم: AU500571، المسلسل: 484BR3705 الببتيدات بربط عكس المرحلة الأعمدة HPLC في AQ عاليةومزال الطور المتحرك وueous من الأعمدة HPLC RP مع مرحلة عالية موبايل العضوية. في RP يتم فصل الببتيدات HPLC يعتمد على طابعها مسعور. ويمكن فصل الببتيدات عن طريق تشغيل الانحدار الخطي من المذيبات العضوية.
HT الإعدادية C3 ZORBAX العمود HPLC 300SB التحليلي، 21،2 × 150 ملم، 5 ميكرومتر حجم الجسيمات اجيلنت رقم المنتج: 895150-909 عكس المرحلة HPLC كولوم
NuPAGE 12٪ مكرر تريس الهلام الحياة تكنولوجيز NP0341BOX المواد الهلامية يلقي ظلالا من قبل لبروتين الكهربائي
الشريحة-A-G2 Lyzer كاسيت غسيل الكلى، 3.5K MWCO الحرارية العلمية رقم المنتج: 87724 عينة غسيل الكلى

References

  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
  3. Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
  4. Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
  5. Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
  6. Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
  7. Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
  8. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
  9. Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
  10. Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
  11. Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
  12. Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
  13. North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
  14. Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
  15. Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
  16. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
  17. Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
  18. Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
  19. Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73 HPLC HPLC TFA CNBr NMR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved