生产二硫键稳定的跨膜肽复合物的结构研究

摘要

膜嵌入蛋白结构域之间的相互作用的生物物理和生物化学的研究面临许多技术上的挑战，首先是获得适当的学习材料。本文描述了一种用于生产和纯化二硫键稳定的的跨膜肽复合物，是适合用于结构分析通过溶液的核磁共振（NMR）和其他的分析应用的协议。

摘要

脂质嵌入的膜蛋白，α-螺旋结构域之间的物理相互作用起着至关重要的作用，在膜蛋白复合体的折叠和装配和跨膜（TM）信令和细胞表面蛋白水平的调节，例如动态过程。了解这些关联的特定序列的结构特点，需要复杂的生物物理和生物化学分析TM肽复合物。然而，TM域的极端疏水性使得它们非常难以操纵使用标准的肽化学技术，生产合适的学习材料常常被证明是令人望而却步具有挑战性的。确定的条件下，肽可以采用稳定的螺旋构象，并形成复合物， 自发地增加了更深一层的难度。在这里，我们提出了一种程序，均聚物或杂二聚体TM肽复合物，从材料的生产是在大肠杆菌中表达的关口，从而允许稳定同位素标签用于核磁共振（NMR）或其他应用程序相对廉价的非天然存在的氨基酸的掺入。在此方法中的关键的创新是作为共价结合 （二硫键交联的）组件改组为洗涤剂，脂质或其他膜-模拟物时，可以形成稳定的，化学计量的和均质的结构，TM配合物的生产和纯化。我们还提出了精心优化的程序也同样适用，无论是生产单TM域或交联复合物的表达和纯化，并提供这些方法来适应新的TM序列的意见。

引言

该协议的细节一个过程中，我们已开发生产出二硫键稳定的复合物的跨膜肽（TM）采用溶液NMR结构研究。这个过程需要利用所提供的强大的表达ΔtrpLE1413融合系统（见下文），并允许使用先进的稳定同位素标记技术，现代化的多维NMR实验TM肽复合物的定义组成。我们采用这些技术来确定的NMR结构淋巴细胞活化免疫受体如何从多个膜蛋白亚基组装TM域之间的相互作用^（1）最近检讨发现重要的新信息。这些技术适用于许多其他的膜蛋白的系统，以及广泛的下游除了溶液的NMR分析方法。虽然这里给出的例子利用本地的半胱氨酸残基创建一个复杂的，模仿自然的二硫键键合的蛋白，设计是同样适合于创建工程二硫键稳定的复合物，通常是由较弱，均聚物和杂二聚体TM配合物的非共价相互作用，如保持在一起表皮生长因子受体（EGFR）家族蛋白^2-4或异源二聚体αβ整合复合物^5,6。

非常疏水的肽序列，如那些来自脂质双层跨越TM蛋白的部分是极为困难的课题，生物化学和生物物理研究。除了是非常具有挑战性的操作使用标准的蛋白质和多肽化学技术，他们往往对细胞的毒性，因此难以产生重组。我们^7,8和^9-11有显着的成功表达这样的困难在细菌的肽序列帧中的羧基端来自大肠杆菌的修改版本的ΔtrpLE1413序列融合到大肠杆菌色氨酸操纵^12。 〜13 kDa的trpLE由该序列编码的多肽可以在T7启动子下的高的水平，并产生完全定位于包涵体的问题有关的毒性和/或不稳定的规避。该序列通过加入一种氨基末端9-组氨酸标记¹³和消除从trpLE序列内部蛋氨酸和半胱氨酸残基^，14允许trpLE-肽融合到由金属离子亲和层析法进行纯化和消化使用溴化氰（CNBr改性），以释放所需的肽序列。我们已经成功地使用这个系统来表达更多的十几家不同序列的trpLE融合膜蛋白片段包含多达四个TM域名^（7,8和未公布结果;也见讨论部分）。

“在本协议中的关键创新是确定的条件下，其中的的非结构化和难溶trpLE-TM融合可以有效地二硫键交联的背景下，一个精简的工作流程。高收益的表达，处理和纯化的多肽产品的几个方面也得到了彻底的优化，这里提出的建议同样适用于非二硫键交联（单体）TM肽产品的生产。

研究方案

1。克隆的结构和设计

感兴趣的序列克隆到PMM-肽用HindIII和BamHI限制性位点（参见图1）的载体（可以按要求提供）。按以下顺序：一个HindⅢ位点的双链DNA，插入应纳入CNBr裂解; E 的一个单一的蛋氨酸密码子大肠杆菌密码子优化的编码序列的肽，一个终止密码子，一个BamHⅠ位点。应消除所有其他的肽中的蛋氨酸和二肽序列天冬 - 亲应避免，因为它也可以在酸性条件下裂解。

一个独特的半胱氨酸残基应被引入每个肽序列，根据所需的定位，在最终的复合物的二硫化物交联，和所有其他半胱氨酸应突变为丝氨酸。该质粒携带用于选择卡那霉素抗性盒。

2。表达trpLE-pepti的去融合

1. 化妆和无菌过滤器M9/Kan最小的生长培养基中（0.1毫的CaCl _2，2mM的用MgSO _4，3克/升KH ₂ PO _4，7.5克/升的Na ₂ HPO _{4·2H 2} O，0.5克/升的NaCl， 1克/升NH _{4 Cl的} ，4的g / L葡萄糖，50mg / L的硫酸卡那霉素）。补充中枢完成A提供B族维生素和微量金属元素：1片溶解在40毫升H _{2 O}混合30分钟，离心除去不溶物和无菌过滤器的橙色上清锌。在4℃下在黑暗中，长达2个星期，并使用4 ml / L的在M9存储原液。
   注^：15 N-富集的NH _{4 Cl的} ^{，13 C-}富集的葡萄糖或其他稳定的同位素标记的前体可以被包括在M9培养基中，在此阶段，如果需要的话。
2. 接种到100毫升的新鲜转化BL21（DE3）菌株E.发酵大肠杆菌中M9/Kan介质。在37℃下生长过夜以200rpm振荡。
3. 第二天早晨，检查起动文化的OD ₆₀₀ -这应该是在2或更大的范围内。稀释到1升中心区补充的M9培养基中的总体积为100毫升发酵。分裂成两个2升的折流板的烧瓶（在每个烧瓶中的500毫升培养），生长于37℃下摇动，在140的转速，直到OD ₆₀₀达到0.6。
4. 振动筛温度设定到18°C，并继续振荡1小时，使文化完全冷却后方可上岗。
5. 以诱导前样品进行SDS-PAGE分析（相当于50微升从培养在OD ₆₀₀ = 1），然后添加IPTG至终浓度0.1mM的诱导表达的trpLE-肽融合。在18°C/140转过夜（16-20小时），在IPTG诱导下继续保持增长。

3。包涵体的制备及镍基绑定

1. 在基本培养基上过夜表达培养最终OD ₆₀₀是可变的，昭民联是在2.5和5.0之间。 SDS-PAGE分析以用样品（相当于50微升从培养物的OD ₆₀₀ = 1），并以5,000×g离心20分钟收集细胞。
2. 来自1 L培养在50ml裂解缓冲液中（50mM的Tris-HCl 20mM的pH为7.5，β-ME，0.2M NaCl）中重悬细胞沉淀。可以冷冻贮存，购买处理的细胞悬浮液。
3. 通过超声处理裂解细胞，在冰上在最大输出为1分钟，休息5分钟，在冰上。我们使用Misonix的超声波仪，3000（最大输出功率600瓦），一个半英寸高强度更换的提示。重复为三个周期的超声波处理/冷却。
4. 通过离心收集不溶性包含体（IB）的材料，在20,000 xg离心15分钟，并弃去上清液。浅色的细胞碎片松散的，薄层顶部致密的IB丸可以是可见的，这可以使用温和搅拌的水或缓冲液与被冲走。步骤3.3和3.4可重复，以提高纯度的IB部分，如果德斯黎红色。应采取的沉淀和上清材料的样品SDS-PAGE分析，以确认trpLE-TM的融合本土化，包涵体。
5. 将IB颗粒溶解在胍溶液（6M的盐酸胍，50mM的pH为8.0的Tris-HCl，200 mM氯化钠，1％的Triton X-100，5mM的β-ME），使用25-50毫升每升培养处理。这一步将需要好几个小时，与搅拌，偶有轻度超声。
6. 在75,000-100,000 xg离心1小时和20℃，溶胞产物通过离心清除IB滗析出上清液，通过0.2微米的膜过滤器。
7. 联合清零IB裂解液，在50毫升锥形管或更大范围内的可以封闭的容器安全，与镍亲和树脂已与水和平衡到胍溶液洗涤。使用3-4毫升结算的每公升树脂处理文化的融合，表达了类似的程度，，作为trpLE-DAP12TM在这里显示（ 图3，泳道2）。批量绑定孵育过夜房T emperature与温和的混合。

4。列的氧化交联

1. IB裂解液/镍树脂悬浮加载到一个空的重力流柱与多孔床的支持，不断增加，直到整个体积流量通过。搜集和整理一边穿过峰，这可能仍包含未绑定的融合蛋白。
2. 用5个床体积的含有5mMβ-ME的尿素水溶液（8M尿素，50mM的pH为8.0的Tris-HCl，200mM NaCl的），通过重力流的镍树脂洗净。
3. 镍树脂，再与洗净的5个床体积的尿素溶液， 没有 β-ME的。
4. 镍洗净树脂用5柱床体积的尿素水溶液，已补充用20μMCuSO _4的氧化型谷胱甘肽和2mM三分之一时间。此冲洗后，关闭柱出口，并在室温下孵育30分钟，以允许最大的二硫键的形成。

5。 TFA洗脱和定量分析

内容“> 注意：三氟乙酸（TFA）导致严重的烧伤与皮肤接触和烟雾有强烈刺激性。集中TFA只应使用经批准的化学通风柜的用眼保护和非乳胶手套。检查所有的化学相容性所用材料，聚丙烯兼容此协议的所有步骤。

1. 洗出来的氧化剂的尿素溶液与10个床体积的水，并通过施加真空线柱出口干燥柱床。
2. 关闭柱出口增加1.5床体积的整齐（99-100％）TFA。搅拌镍树脂与一个小抹刀将确保甚至暴露于酸，孵育5分钟。打开柱出口，收集的酸性洗脱液，轻轻加压如有必要，用注射器或压缩空气管线推所有的液体。
3. 重复酸洗脱步骤与1.5床体积的纯TFA。快速工作，在此步骤中，以避免完全溶解的beadeð琼脂糖基质。蛋白质产量可确定在这一点上，按照比尔 - 朗伯方程和理论的trpLE肽序列的摩尔消光系数。稀释的TFA洗脱液（1:20至1:50）的三氟乙醇（TFE）的样品，并测量在280nm处的吸光度，使用TFA / TFE，在相同的稀释作为空白。

6。溴化氰消化

注意：溴化氰（CNBr）是剧毒，只有在经批准的化学通风柜应处理。个人防护装备，包括防护眼镜，实验室外套，非乳胶手套是绝对必要的。溴化氰反应水分，并应提请冷却至室温后再开。请联系您的机构安全办公室中/出售的CNBR污染的解决方案和材料上的说明。

1. 通过滴加水稀释到80％的最终的TFA浓度的酸的洗脱液，同时轻轻混合。如果沉淀物的形式，日体积小（0.5〜1毫升）的纯TFA，直至溶液澄清，然后重新正确与水的80％。取5微升预消化的样品进行SDS-PAGE分析，在液氮中冻结，并立即冷冻干燥样品。
2. 到约0.2克/毫升，添加的CNBr晶体照顾权衡的有毒化学品的安全封闭的，预先称重的试管中，或使用化学通风柜内部的平衡。轻轻混匀，直至完全溶解。冲洗和惰性气体（氮或氩气流）下密封反应容器中，并在室温下孵育3-4小时，避光。
3. 5微升，消化后的样品进行SDS-PAGE分析，并立即冻结和冻干。摘要反应转移用截留分子量为3.5 kDa的或更少的再生纤维素透析盒或管（醋酸纤维素溶解在浓酸），根据预期的肽复合物的大小。透析过夜，4升的水在化学通风柜，以减少的TFA浓度和分解任何未反应的CNBr。留出空间，在透析磁带或管道的量显着增加（高达两到三倍），在透析过夜。
4. 取出透析的透析盒或管（大部分蛋白质会析出时，反式脂肪酸的浓度降低）悬浮沉淀的反应溶液和悬浮液转移到50毫升锥形管。冻结并冷冻干燥以除去水和溴化氰/ TFA的痕迹。此步骤是可能需要数天。
   注意：透析的消化反应和透析用水应继续被视为有毒适当的预防措施和处理/处置。
5. 预诱导和收获阶段，包涵体上清液和沉淀，TFA洗脱液和溴化氰消化的材料的培养的样品可以通过SDS-PAGE分析。准备样品通过加热至95℃，在Invitrogen公司的NuPAGE LDS SAMPLË缓冲区。 TFA洗脱液和消化样品应准备在还原和非还原条件​​下的氧化交联，以促进产品的识别和评价。
6. 分离出的样品在12％的NuPAGE预制双 - 三丙烯酰胺凝胶使用MES-SDS电泳缓冲液为最小的消化产品的最佳分辨率。

7。二硫键交联的肽复合物的反相HPLC纯化

1. 溶解冻干消化产品100毫克到2-3毫升整齐甲酸和负载到制备规模（21.2×150毫米）中的Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT端在溶剂A中（通常为10-20％乙腈或5列-10％异丙醇在水中含0.1％TFA）。
2. 洗脱梯度的溶剂B（用0.1％TFA的乙腈或异丙醇）中的至少5倍柱体积的摘要产品。建议选择最优梯度条件不同的肽序列进行讨论。
3. 采取50-100微升样品从每个HPLC级分的SDS-PAGE分析和冻结并立即冷冻干燥。高效液相色谱法溶剂的去除是快速的，应在1-2小时完成。
4. 准备冷冻干燥的HPLC样品进行SDS-PAGE，通过加热至95℃，Invitrogen公司的NuPAGE LDS样品缓冲液中， 与没有还原剂 。冷却，平均每个样品拆分成2个离心管中，加入100 mM的DTT他们重新加热简要之一。
5. 分隔的还原和非还原的HPLC样品，在12％的NuPAGE预制双 - 三丙烯酰胺凝胶与MES-SDS运行缓冲液，如上。小，疏水性多肽往往不考马斯染色以及可能无法运行在预期的分子量。然而，还原和非还原的样品相比，应便于识别的交联的肽纯度的产品和评估。
6. 分析的候选肽的部分，由基质辅助激光解吸电离飞行时间，飞行（MALDI-F）质谱（见讨论），以确定该物种的利益，并确认其预期的质量。
7. 结合，冻结和冻干HPLC含有纯的，交联的TM肽复合物的级分，并采取干重量为最终产物，以确定产量。异丙醇含量高的分数可能不会保持冻结。如果肽级分干燥的膜，而不是一个蓬松的冻干产品，重新溶解膜完全纯的六氟异丙醇（HFIP）的一个小体积中，冻结并再次冻干。的的HFIP过的产品应该是一个小的，白色的圆锥体，轻松放倒，称重。

结果

trpLE融合实现的表达水平是可变的和严重依赖于连接的肽的氨基酸序列， 图3示出了预诱导的SDS-PAGE分析（泳道1）和时间的收获（泳道2）从文化，取得了约120毫克的纯的，完整trpLE DAP12TM融合从1升的文化和4毫升镍基样品。所有的trpLE DAP12TM融合的定位包涵体的沉淀（泳道4），而不是为上清液（泳道3）。

约70％的镍-纯化trpLE DAP12TM融合是二硫键交联的二聚体形式（ <...

讨论

根据我们的经验， 表达的融合trpLE-TM。trpLE-TM融合低表达丰富的培养基中在37℃下，和这里所描述的培养条件为许多不同的序列，含有一至四个TM域，产率范围已证明是成功的为50〜150 mg / L的纯的，完整的融合。融合编码三-或四-TM G蛋白偶联受体片段（人CCR5 TM1-TM3和TM4-TM7分别）或人类信号肽肽酶（4 TM域;见文献^15）的芯催化片段代表在此范围内的最低的表达的水平，而这里所使用的序...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
溴化氰	ALDRICH	P.No，CAS-506-C91492-68-3	有害物质。危险品。非常吸入毒性，与皮肤接触和吞食。与酸接触会产生剧毒气体。对水生生物有剧毒，可能对水生环境造成长期的不良影响。
三氟乙酸	SIGMA-ALDRICH	P.CODE 1000984387，CAS编号76-05-1	有害物质。危险品，造成严重灼伤。吸入有害。对水生生物有害，可能对水生环境造成长期的不良影响。
2 - 巯基乙醇	SIGMA-ALDRICH	P.No M7154，CAS编号60-24-2	有害物质。危险品 。吸入，皮肤接触及若食入。对皮肤有刺激性。严重伤害眼睛的危险。皮肤接触可能引起过敏。对水生生物有剧毒，可能对水生环境造成长期的不良影响。
1,1,1,3,3,3 - 六氟-2 - 丙醇	SIGMA-ALDRICH	产品编号52512，CAS编号。 920-66-1	有害物质。危险品 。吸入有害，如果吞食。引致灼伤。
蚁酸	默克	K41186564	易燃液体和蒸气。造成严重皮肤灼伤和眼损伤。
尿素	UNIVAR，AJAX FINECHEM	产品型号，817，CAS编号57-13-6	当加热时，十二月omposes二氧化碳和氨;如果烧掉，发出少量的氮氧化物。会导致红肿和刺激皮肤和眼睛。
盐酸胍	AMRESCO	P.No-M110，CAS号码：50-01-1	如果吞下将是有害的，造成严重眼刺激，使皮肤有刺激性，急性口服毒性，皮肤刺激性，对眼睛有刺激性。
TRITON X-100	SIGMA	产品编号T8532 CAS编号：9002-93-1	的Triton X-100是一种非离子洗涤剂，100％活性成分，通常被用在以溶解蛋白质的生化应用。的Triton X-100具有无抗菌性能，并考虑了相对温和的非变性洗涤剂
他选择镍亲和凝胶	SIGMA-ALDRICH	产品目录号P6611	IS-选择镍亲和凝胶是一种固定化金属离子亲和层析（IMAC）产品。他的选择尼克EL亲和凝胶是一种专有的四齿螯合，组氨酸含有蛋白质的特异性结合，目的是用镍珠状琼脂糖收取。
（ - ） - 谷胱甘肽，氧化	SIGMA-ALDRICH	目录NUM 150568
Misonix S-3000超声波仪	QSONICA	S-3000（已停产）	最大功率输出600瓦。 2英寸可更换的尖探针采用2英寸的高强度，高容量的提示和一系列的高强度，低容量的提示。最近的机型，目前该公司的Q500和Q700。
RP-HPLC：生物DuoFlow层析系统，软件5.3版	Bio-Rad公司实验室	目录编号760-0047，配置编号：AU500571，序列号：484BR3705	肽结合反相HPLC色谱柱在高AQueous流动相，洗脱RP HPLC柱高有机流动相。在反相高效液相色谱法分离的肽根据其疏水性。肽可通过运行的有机溶剂的线性梯度分离。
准备HT C3 ZORBAX 300SB分析HPLC柱，21.2×150毫米，5微米的颗粒大小	安捷伦	产品编号：895150-909	反相HPLC柱
的NuPAGE 12％的Bis-Tris凝胶	Life Technologies公司	NP0341BOX	前投凝胶蛋白电泳
幻灯片-A仪G2透析的带3.5K MWCO	Thermo Scientific的	产品编号：87724	样品透析