في المختبر الثقافة عضوي من أورام القولون ماوس

Summary

يوصف وهناك طريقة بسيطة لإنشاء الابتدائي الفئران القولون عضوي الورم. هذا الأسلوب يستخدم ميزة أن الخلايا السرطانية القولون البقاء على قيد الحياة وتنمو لتصبح organoids في وسائل الإعلام التي تحتوي على عوامل النمو محدودة، في حين القولون العادي الظهارية لا.

Abstract

وقد وضعت العديد من خطوط الخلايا السرطانية القولون الإنسان والفئران، لا يتم الاحتفاظ سلامة فيزيولوجي من أورام القولون مثل طبقات متعددة الخلية، قطبية القاعدية القمي، والقدرة على التمييز، وanoikis في سرطان خطوط الخلايا المشتقة القولون. يوضح هذه الدراسة طريقة لزراعة الأولية الماوس القولون organoids ورم مقتبس من ساتو T وآخرون. ^1، الذي يحتفظ ميزات فيزيولوجي مهم من أورام القولون. يتكون هذا الأسلوب من القولون جمع الماوس ورم الأنسجة المجاورة ظهارة القولون العادي تفارق والقولون ورم خلايا الهضم داخل الخلايا واحد، تضمين الخلايا السرطانية في القولون matrigel، وثقافة انتقائية تقوم على مبدأ أن الخلايا السرطانية الحفاظ على النمو على الحد من الظروف المغذيات مقارنة إلى وضعها الطبيعي الخلايا الظهارية.

وorganoids الورم الرئيسي إذا المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا توفير نظام مفيد جدا لتقييم FUNCT مستقلة ورمأيون من جينات معينة. وعلاوة على ذلك، فإن organoids الورم قابلة للتلاعب الجيني بواسطة فيروس التأمل توصيل الجينات؛ مسارات بالتالي يشير تشارك في تكون الأورام القولون ويمكن أيضا أن يتم التحقيق على نطاق واسع من قبل من overexpression أو ضربة قاضية. يوفر الابتدائي ورم ثقافة organoids وسيلة الفسيولوجية ذات الصلة ومجدية لدراسة الآليات والطرائق العلاجية لتكون الأورام القولون.

Introduction

الخلايا الظهارية في الأمعاء تتكاثر وتسليم بمعدل غير عادي، متجاوزا جميع الأنسجة الأخرى في الجسم الفقاريات ^2،3. وتقسيم الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية المعوية (ISC) والعبور تضخيم الخلايا تفرق في إما إفرازي (القدح، بانيت وenteroendocrine) أو الخلايا المعوية ^3. يقع ISC في قاعدة سرداب. خلايا بانيت تحريك لأسفل إلى الجزء السفلي من الخبايا وتكون طويلة الأمد، في حين الأنساب الأخرى تهاجر نحو الأعلي للالزغب ^3،4. هنا تتعرض الخلايا لمحتويات القناة الهضمية بما في ذلك مجهريات البقعة ويتم تسليط من النصائح زغابة من خلال آلية أفكارك anoikis التي يسببها. على الرغم من أن القولون يفتقر الزغب والخلايا بانيت، وآلية للحفاظ على التوازن مشابه ^4.

وقد تورط مسار الإشارات WNT في لعب دورا حاسما في انتشار المعوية والصيانة ISC ^4. حذف من اله عامل النسخ TCF4، وهو المستجيب المصب من إشارات WNT، يؤدي إلى فقدان الخلايا الجذعية المعوية والانهيار اللاحق للنسيج ^5. وبالمثل، التعبير المعدلة وراثيا من DKK1 المانع WNT يقلل من انتشار الظهارية ويستنزف الأنساب الخلية الإفرازية ^6. وعلى العكس، overexpression من ناهض WNT R-spondin-1 الحث انتشار قوي والسريع للخلايا المعوية سرداب ^7.

ونظرا لأهمية إشارات WNT لتوازن الأمعاء، وكثيرا ما لوحظ الطفرات مسار WNT في سرطان القولون ^8. سرطان القولون هو ثالث سبب رئيسي للوفاة من السرطان في الولايات المتحدة ^9. المدخول الغذائي الزائدة مع اللحوم الحمراء والكحول، انخفاض النشاط البدني، والموروثة وتعتبر الطفرات الجسدية لتكون عوامل خطر الإصابة بسرطان القولون ^10،11. وتحور القولونية المرجلات غدومي (APC) الجينات، عاملا رئيسيا إشارات WNT، في أغلبية السلطة الفلسطينيةtients مع العائلية، متفرقة، والتهاب القولون المرتبط بسرطان القولون ^12،13. ويلاحظ الطفرات من العوامل الأخرى المشاركة في WNT مسار الإشارات بما في ذلك Axin2 وβ كاتينين أيضا في سرطان القولون ^14،15. ومع ذلك، فإن آلية دقيقة وعلاج فعال لسرطان القولون لا تزال تفتقر. لتسهيل التحقيق في الآليات الجزيئية لسرطان القولون، تم إنشاء خطوط الخلايا البشرية سرطان القولون تمثل مراحل مختلفة من تطور السرطان من حميدة إلى نوع من الخلايا العدوانية ^16-18. الماوس القولون خطوط الخلايا السرطانية مع خصائص النقيلي مختلفة متوفرة ^19،20 أيضا. ومع ذلك، ويفضل الخلايا الأولية أو الثقافات عضوي أكثر من خطوط الخلايا تحولت لأنها تحاكي عن كثب في حالة الجسم الحي وتوليد المزيد من البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ^21. معظم القولون وسرطان خطوط الخلايا المشتقة تنمو كما أحادي الطبقة التي تعلق على لوحة أو الايقاف الخلية، lackinز من التوجه قمية-basolateral ومنعطفات ضيقة بين الخلايا. أيضا، والخلايا الظهارية في الأمعاء العادية والورم في الجسم الحي الخضوع لشكل عفوي من موت الخلايا المبرمج anoikis توصف بأنها خلايا متمايزة تصل إلى نصائح زغابة ويتم تسليط ^22. هذه الميزات يصعب ألخص في خطوط الخلايا ولكنها مهمة في العملية التنموية من سرطان القولون ^23. تتم المحافظة على هذه الميزات في organoids الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافات عضوي ورم توفير نظام فعال لتقييم وظائف مستقلة ورم من الجينات مقارنة في الدراسات المجراة. التلاعب الجيني في الجسم الحي من الأمعاء هي عملية تستغرق وقتا طويلا ولا سيما من خلال خلق المعدلة وراثيا و / أو الفئران خروج المغلوب باستخدام برامج تشغيل الأمعاء محددة. ومع ذلك، فإن organoids الورم قابلة بسهولة لالفيروسية التلاعب الجيني بوساطة وبالتالي أداة عظيمة لتقييم الآليات الجزيئية الدقيقة. الأولية المعوية الثقافات عضوي ورم هفثبت الإلكترونية لتكون تقنية مجدية وقوية. يمكن زراعة الخلايا المعوية الأولية إنشاء organoids المعوية وظيفية مع هيكل سرداب-الزغب في المختبر من بالغ واحد Lgr5 + الخلايا الجذعية ^24. هذه organoids يمكن زرعها والمغروسة في الأنسجة التالفة القولون لتجديد ^25. قد مزيد من الشروط ثقافة التكيف جعلت organoids الظهارية مماثلة من القولون والأمعاء الدقيقة الماوس الإنسان والقولون مجدية ^1. للتعليم الابتدائي العادي القولون ظهارة الثقافة، ثقافة المتوسط ​​القاعدية، فضلا عن عوامل النمو بما في ذلك صندوق تعديل العولمة الأوروبي، رأس، R-spondin وWnt3a ضرورية، في حين بصل متوسطة الثقافة وصندوق تعديل العولمة الأوروبي يكفي لزراعة الماوس القولون organoids الورم الرئيسي ^1. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لعزل، والثقافة، وتوليد organoids ورم القولون.

Protocol

1. القولون عزل الورم والتفكك الخليوي

1. الأورام المعوية يمكن عزلها عن أي نموذج سرطان القولون متفرقة أو المعاملة التي يسببها. وينبغي أن يتم التخلص من الفئران مع CO _2. ثم يتم جمع نقطتين، مع مسح الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفتحت طوليا. تحديد المناطق التي تحتوي على الأورام باستخدام stereomicroscope، تشريح مع زوج من مقص، ويغسل مع برنامج تلفزيوني الباردة.
2. احتضان شظايا المعوية تحتوي على الأورام في المخزن عملية إزالة معدن ثقيل EDTA (2 ملم EDTA، 5.6 ملمول / لتر نا ₂ هبو _4، 8.0 ملمول / لتر KH ₂ PO _4، 96.2 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم، 1.6 ملمول / لتر بوكل، 43.4 مليمول / لتر سكروز، 54.9 مليمول / لتر D-السوربيتول، 0.5 ملمول / لتر DL-dithiothreitol في الماء المقطر) لمدة 60 دقيقة على الجليد.
3. بعد عملية إزالة معدن ثقيل، سيتم فصل معظم الخلايا الظهارية في الأمعاء الطبيعي، في حين أن الخلايا السرطانية سوف لا تزال تعلق على اللحمة المتوسطة. نضح قبالة العازلة عملية إزالة معدن ثقيل تحتوي على الخلايا الظهارية العاديوغسل الورم بقايا شظايا واحد المزيد من الوقت مع 5 مل العازلة عملية إزالة معدن ثقيل الباردة.
4. نضح قبالة العازلة عملية إزالة معدن ثقيل، وغسل شظايا الورم مع 5 مل الباردة 1X PBS.
5. نضح قبالة 1X PBS، احتضان شظايا ورم في المخزن الهضم (2.5٪ مصل بقري جنيني، 1 وحدة / مل من البنسلين، 1 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين، و 2.5 نانوغرام / مل من الأمفوتريسين B، 200 U / مل النوع الرابع كولاجيناز، 125 ميكروغرام / مل نوع II dispase في Dulbecco في التعديل النسر متوسطة) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
6. السماح للجزء ورم ليستقر تحت الجاذبية الطبيعية لمدة 1 دقيقة، وجمع طاف في أنبوب 15 مل الصقر. بيليه الورم خلية واحدة تعليق طاف بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق ويغسل مرة واحدة مع 5 مل PBS بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.

2. ثقافة ورم معوي

1. Resuspend وبيليه الخلية السرطانية مع 500 ميكرولتر PBS، عد الخلايا السرطانية واحدة معزولة باستخدام عدادة الكريات.
2. بيليه الخلايا السرطانية بواسطة المائةrifuging في 200 x ج لمدة 3 دقائق، و resuspend لهم في 5 ملغ / مل Matrigel على الجليد وطبق في 24 لوحات جيدة في 15،000 خلية لكل ميكرولتر من 50 Matrigel لكل بئر.
3. السماح للMatrigel تتبلمر لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإضافة 500 ميكرولتر / بصل جيدا مستنبت (1 وحدة / مل من البنسلين، 1 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين، و 2.5 نانوغرام / مل من الأمفوتريسين B، 10 ملمول / لتر HEPES ، 2mm في Glutamax، 1X N2 الملحق، 1X B27 الملحق، 1 مليمول / لتر N-أسيتيل في المتقدم Dulbecco لتعديل النسر Medium/F12) تحتوي على 50 نانوغرام / مل EGF الفئران.

3. صيانة Organoids تأسست

1. تغيير ثقافة المتوسط ​​القاعدية التي تحتوي على صندوق تعديل العولمة الأوروبي كل يوم 2 ومرور organoids 01:05 مرة واحدة في الأسبوع.
2. لالركض، تحل محل الثقافة المتوسطة مع الطازجة مستنبت القاعدية. تعطل ميكانيكيا organoids وMatrigel باستخدام ماصة P1000 مع نصائح بقطع ونقل إلى 15 مل أنبوب الصقر. ويتم تحقيق مزيد من التفكك الميكانيكية باستخدام النار مصقول باستور الأنابيبتتي.
3. غسل organoids فصلها مع 5 مل من بصل متوسطة الثقافة والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة.
4. تجاهل طاف، resuspend الكرية مع Matrigel وإضافة مستنبت كما هو موضح أعلاه.

4. تخزين واسترداد Organoids تأسست

1. للتخزين على المدى الطويل، وتجميد organoids في السائل N ₂ التي هي مستقرة لمدة 2 سنوات على الأقل. لorganoids تجميد وتعطيل باستخدام ماصة P1000 مع نصائح بقطع ونقل إلى 15 مل أنبوب الصقر.
2. غسل organoids فصلها مع 5 مل من بصل متوسطة الثقافة والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة.
3. تجاهل طاف، resuspend الكرية مع Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).
4. نقل الخلايا إلى 1.5 cryotubes مل، ثم وضع الأنابيب في Nalgene السيد حاوية تجميد متجمد وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية إلى تحقيق معدل التبريدمن -1 ° C / دقيقة. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، ونقل إلى أنابيب السائل N _2.
5. للانتعاش، وإذابة organoids المجمدة بسرعة في 37 ° C حمام الماء، ويغسل مع مستنبت القاعدية، وتدور باستمرار، في resuspend Matrigel والثقافة مع الشروط المذكورة أعلاه.

5. استخراج الحمض النووي الريبي، استخراج البروتين والمناعية

1. استخراج الحمض النووي الريبي: يتم جمعها الخلايا كما هو موضح أعلاه لمرور. يتم عزل الحمض النووي الريبي مع PicoPure ^TM عزل الحمض النووي الريبي عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. استخراج البروتين: الكريات خلية يتم جمعها كما هو موضح أعلاه و lysed في 100 ميكرولتر العازلة فحص الترسيب المناعي الشعاعي (RIPA؛ 50 مليمول / لتر تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 ملمول / لتر كلوريد الصوديوم، 2 ملمول / لتر EDTA، 1٪ NP-40، 0.1 ٪ SDS) مع 1X مثبط البروتياز.
3. المناعية: نضح قبالة المتوسطة خلية ثقافة، نقل organoids الورم مع ماصة P1000 مع نصائح بقطع في البرد العفن وتجمد على الفور في TISمقاضاة تجميد المتوسطة (أكتوبر) مع الثلج الجاف. وقطعت أقسام المجمدة في 7 ميكرون والملون كما هو موضح سابقا ^26.

النتائج

على مدار الساعة من القولون ورم تشكيل عضوي من APC ^ودقيقة لمدة ثلاثة أشهر من العمر ^/ ويرد ⁺ الماوس في الشكل 1. في اليوم 0، ويمكن ملاحظة الخلايا واحد عدة ساعات بعد تصفيح (الشكل 1A). في يوم 1، نجا القولون ورم الخلايا الظهارية مع نواة المق?...

Discussion

فإن الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول إتاحة العزلة والثقافة من أورام القولون الفئران الأولية. ويتم تكييف البروتوكول من العمل المنوي القيام به من قبل الدكتور كليفرز مجموعة ^1،24،27. نحن الأمثل الوقت الهضم والتركيز كولاجيناز للحصول على محصول أفضل من o...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356234	5 mg/ml
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188	375U/mg
Dispase	Gibco	17105-041	1.8U/mg
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010
Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural	Invitrogen	53003-018
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	100 x
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	50 x
Glutamax-I	Gibco	35050-079	100x
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165-5G
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
PicoPureTM RNA Isolation Kit	Invitrogen	KIT0204