Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Özet

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Özet

Çeşitli insan ve fare kolon kanseri hücre hatları kurulmuştur, bu tür birden fazla hücre katmanları, bazal-apikal kutup, ayırt etmek yeteneği ve anoikis gibi kolon tümörlerinin fizyolojik bütünlüğü kolon kanseri edilen hücre hatlarında korunmaz. Mevcut çalışmada, Sato T et al. ^1, kolon tümörlerinde önemli fizyolojik özelliklerini korur uyarlanmıştır kültür birincil fare kolon tümör organoids için bir yöntemi gösterir. Bu yöntem, tümör hücrelerinin normal göre besin kısıtlayıcı koşullar üzerinde büyümeyi sürdürmek ilkesine göre fare kolon tümör doku toplanması, komşu normal kolon epitel ayrışma, tek bir hücre içine Kolon tümör hücreleri sindirim, Matrigel içine Kolon tümör hücreleri gömme ve seçici kültür oluşmaktadır epitel hücreleri.

Genetik olarak değiştirilmiş fareler izole ise primer tümör organoids tümör özerk fonksiyon değerlendirmek için çok kullanışlı bir sistem sağlamakBelirli genlerin iyon. Ayrıca, tümör organoids gen teslim meditasyon virüsünün genetik manipülasyon için uygun olan, kolon kanser oluşumunda yer alan bu nedenle sinyal yolları da yoğun aşırı veya demonte incelenmiştir olabilir. Primer tümör organoids kültür kolon tümörogenez için mekanizmalar ve tedavi yöntemleri incelemek için bir fizyolojik ilgili ve uygulanabilir bir yol sağlar.

Giriş

Bağırsak epitel hücreleri çoğalmaya başlar ve omurgalı vücut ^2,3 diğer tüm dokular geride bıraktı, olağanüstü bir hızla ters çevirin. Bağırsak kök hücreler (ISC) ve transit yalıtım hücreleri de dahil olmak üzere bölünen hücreleri ya salgı (kadeh, Paneth ve enteroendokrin) hücreleri veya enterositler ³ farklılaşırlar. ISC mahzenin tabanında yer alır. Paneth hücrelerinin kript altına aşağı hareket ve diğer soy villus ^3,4 için yukarı göç ise, uzun ömürlü. Burada hücreler Mikrobiyota dahil olmak üzere mide içeriğine maruz kalan ve bir anoikis bağlı apoptotik mekanizma yoluyla villus ipuçları dökülür. Kolon villus ve Paneth hücrelerinin yoksun olsa da, dengesini korumak için mekanizma ⁴ benzer.

Wnt sinyal yolu bağırsak çoğalması ve ISC bakım ⁴ çok önemli bir rol oynadığı edilmiştir. Inci silinmesiE transkripsiyon faktörü TCF4, Wnt sinyal bir alt efektör, bağırsak kök hücre ve doku ⁵ sonraki arıza kaybına yol açar. Benzer şekilde, Wnt inhibitör DKK1 transgenik ifade epitel proliferasyonu azaltır ve salgı hücre soyları ⁶ tüketir. Tersine, Wnt agonist R-spondin-1 aşırı bağırsak crypt hücrelerinin ⁷ güçlü ve hızla yayılması neden olur.

Bağırsak dengesini için Wnt sinyal önemi göz önüne alındığında, Wnt yolu mutasyonlar sık kolon kanseri ⁸ gözlenmektedir. Kolon kanseri Amerika Birleşik Devletleri ⁹ kanserden ölüm üçüncü önde gelen nedenidir. Kırmızı et ve alkol ile aşırı diyet fiziksel aktivite azalır ve kalıtsal ve somatik mutasyonlar kolon kanseri ^10,11 risk faktörleri olarak kabul edilir. Adenomatöz polipozis koli (Süm) gen, önemli bir Wnt sinyal faktör, pa bir çoğunda mutasyona uğramışailesel, sporadik ve kolit ile ilişkili kolon kanseri ^12,13 ile hastaları. Axin2 ve β-katenin dahil olmak üzere Wnt sinyal yolu ile ilgili diğer faktörlerin mutasyonlar da kolon kanseri ^14,15 gözlenmektedir. Ancak, kolon kanseri için kesin mekanizması ve etkin tedavi hala eksiktir. Kolon kanseri için moleküler mekanizmaların soruşturma kolaylaştırmak için, agresif hücre tipi için iyi huylu kanser ilerleme farklı aşamalarında temsil eden insan kolon kanseri hücre hatları ^16-18 kurulmuştur. Farklı metastatik özelliklere sahip Fare kolon karsinoma hücre çizgileri ^19,20 mevcuttur. Yakından in vivo durumda taklit eder ve daha fazla fizyolojik olarak ilgili verileri ²¹ oluşturmak için Bununla birlikte, birincil hücreler veya organoid kültürleri dönüştürülmüş hücre çizgileri tercih edilir. En kolon kanseri hücre çizgileri elde edilen sonik, plakasına bağlı olarak tek tabakalı ya da hücre süspansiyonları olarak büyürapikal-bazolateral yönelim ve hücreler arasındaki sıkı bağlantıları g. Farklılaşmış hücrelerin villus ipuçları ulaşmak ve ²² döken olarak Ayrıca, in vivo normal ve tümör bağırsak epitel hücrelerinde apoptoz olarak adlandırılan anoikis kendiliğinden bir formu tabi. Bu özellikler, hücre hatlarında özetlemek zordur, fakat kolon kanseri ²³ gelişim sürecinde önemlidir. Bu özellikler, primer organoids tutulur. Buna ek olarak, tümör organoid in vivo çalışmalar, kültürler ile karşılaştırıldığında genlerin tümör otonom işlevleri değerlendirmek için etkili bir sistem sağlar. Bağırsak in vivo genetik manipülasyon özellikle bağırsak-özel sürücüler kullanılarak transgenik ve / veya nakavt fareler yaratarak bir zaman alan bir süreçtir. Ancak, tümör organoids kolayca viral aracılı genetik manipülasyon için uygun ve bu nedenle hassas moleküler mekanizmaları değerlendirmek için harika bir araçtır. Primer intestinal tümör organoid kültür have uygun bir ve güçlü bir teknik olduğu gösterilmiştir. Birincil bağırsak hücre kültürü tek bir yetişkin Lgr5 + kök hücre ²⁴ in vitro crypt-villus yapısı ile fonksiyonel bağırsak organoids kurabilir. Bu organoids nakledilen ve rejenerasyon ²⁵ için hasarlı kolon doku içine engrafted olabilir. Kültür koşulları daha da adaptasyon fare kolon ve insan ince bağırsak ve ¹ uygun kolondan benzer epitel organoids yapmıştı. Bazal kültür ortamı ve EGF primer fare kolon tümör organoids ¹ büyüme için yeterli iken, birinci, normal kolon epitel kültür, bazal kültür ortamı için hem de EGF, Noggin, R-spondin ve Wnt3a büyüme faktörleri dahil olmak üzere, çok önemlidir. Burada ayrıntılı bir protokol, izole kültür ve kolon tümör organoids oluşturmak için açıklar.

Protokol

1. Kolon Tümör İzolasyon ve Hücre Ayrışma

1. Bağırsak tümörleri her sürekli veya tedaviye bağlı kolon kanseri modeli izole edilebilir. Farenin _CO2 ile ötenazi edilmelidir. Kolon daha sonra soğuk fosfat-tamponlu salin (PBS) ile yıkanmış, toplanmış ve boylamasına açılmıştır. Bir stereomikroskopta tümör içeren bölgelerin belirlenmesi, bir makas ile incelemek ve soğuk PBS ile yıkayın.
2. EDTA şelasyon tampon tümörleri içeren bağırsak parçaları (2 mM EDTA, 5.6 mmol / L Na ₂ HPO _4, 8.0 mmol / L KH ₂ PO _4, 96.2 mmol / L NaCl, 1.6 mmol / L KCl, 43.4 mmol / L sakaroz, inkübe Buz üzerinde 60 dakika süre ile 54.9 mg / L D-sorbitol, 0.5 mmol / L damıtılmış su içinde DL-ditiyotretol).
3. Tümör hücreleri mezenşimin takılı kalır ise şelasyon sonra, normal bağırsak epitel hücrelerinin çoğu, ayrılacaktır. Normal epitel hücreleri içeren şelasyon tampon kapalı aspireve geriye kalan tümör yıkayın 5 ml soğuk şelasyon tamponu ile bir kez daha parçalar.
4. Şelasyon tampon kapalı aspire, 5 ml soğuk 1x PBS ile tümör parçaları yıkayın.
5. 1x PBS aspire, sindirim tamponu olarak tümör parçası (% 2.5 fetal sığır serumu, penisilin 1 ünite / ml streptomisin içinde 1 ug / ml ve 2.5 ng / ml amfoterisin B, 200 U / ml tip IV kollajenaz, inkübasyon 37 ° C'de 2 saat boyunca 125 ug / Dulbecco Modified Eagle Medium mi tip II dispaz) ° C '
6. Tümör parçası 1 dakika normal yerçekimi altında yerleşmek, ve 15 ml şahin tüp süpernatant toplamak için izin verin. Pelet 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edilir ve 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile 5 ml PBS ile bir kez yıkayın ile tek bir hücre süspansiyonu tümör süpernatan.

2. Bağırsak Tümör Kültür

1. Hemasitometre kullanarak izole tek tümör hücreleri saymak, 500 ul PBS ile tümör hücre pelletini tekrar.
2. Yüzde Pelet tümör hücreleri3 dakika boyunca 200 x g'de rifuging ve oyuk başına 50 ul Matrigel başına 15.000 hücre, 24-yuvalı plakalar içinde buz ve plaka üzerinde 5 mg / ml Matrigel bunları tekrar süspansiyon haline getirin.
3. Matrigel 37 ° C'de 15 dakika boyunca polimerize ve 500 de bazal / ml kültür ortamı (penisilin 1 ünite / ml streptomisin içinde 1 ug / ml ve 2.5 ng / ml amfoterisin B, 10 mmol / L Hepes katalım , 2mm Glutamax, 1x N2 ek, 1x B27 takviyesi, Gelişmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium/F12 1 mmol / L N-asetilsistein) 50 ng / ml fare EGF içeren.

3. Kurulmuş Organoids bakımı

1. Haftada bir EGF 2 gün ve geçiş organoids 01:05 her içeren bazal kültür ortamı değiştirin.
2. Pasajı, taze bazal kültür ortamı ile kültür ortamı değiştirin. Mekanik kesilmiş ipuçları ile bir P1000 pipet kullanarak organoids ve Matrigel bozabilir ve 15 ml şahin tüp içine aktarın. Ayrıca mekanik ayrışma bir yangın cilalı Pasteur boru kullanılarak elde edilirtte.
3. 2 dakika boyunca 200 xg'de bazal kültür ortamı ve santrifüj 5 ml ayrışmış organoids yıkayın.
4. Süpernatantı atın, Matrigel ile pelet tekrar süspansiyon ve yukarıda açıklandığı gibi kültür ortamı ekleyin.

4. Depolama ve Kuruluş Organoids Kurtarma

1. Uzun süreli depolama için, en az 2 yıl boyunca kararlı sıvı N ₂ organoids dondurma. Donma organoids için ipuçları kesilmiş ve 15 ml şahin tüp içine transferi ile bir P1000 pipet kullanarak bozabilir.
2. 2 dakika boyunca 200 xg'de bazal kültür ortamı ve santrifüj 5 ml ayrışmış organoids yıkayın.
3. Süpernatant atılır, Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren pelletini.
4. 1.5 ml cryotubes içine transfer hücreleri, daha sonra ° C derin dondurucu bir soğutma hızı elde etmek için -80 bir Nalgene Bay Frosty dondurma konteyner ve mağaza tüpleri koymak-1 ° C / dak. Gece boyunca inkübasyondan sonra, sıvı _N2 tüpler içine aktarın.
5. Geri almak için, dondurulmuş organoids hızla 37 ° yukarıda açıklanan koşullarla Matrigel ve kültür tekrar süspansiyon C su banyosunda, aşağı doğru döndürün, bazal kültür ortamı ile yıkayın. Tekrar çözülür

5. RNA Ekstraksiyon, Protein Ekstraksiyon ve İmmünohistokimya

1. RNA ekstraksiyonu: geçişi için yukarıda tarif edildiği gibi hücreler toplanır. RNA, üretici talimatlarına göre PicoPure ^TM RNA İzolasyon Kiti ile izole edilmiştir.
2. Protein Ekstraksiyonu: Yukarıda tarif edilen ve (100 ul radyoimmüno deney tamponu içinde lize RIPA olarak Hücre topakları toplanır, 50 mmol / L Tris-HCl, pH 7.5, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA,% 1 NP-40, 0.1 1x proteaz inhibitörü ile% SDS).
3. İmmünohistokimya: hücre kültür ortamı kapalı aspire, Cryo-kalıp içine kesme ipuçları ile P1000 pipet ile tümör organoids transferi ve tis hemen dondurmakkuru buz ile dondurma orta (OCT) dava. Dondurulmuş Bölüm 7 mikron kesilir ve daha önce ²⁶ açıklandığı gibi boyandı.

Sonuçlar

^{/ Mouse} Şekil 1'de gösterilmiştir üç aylık Apc ^dk bir kolon tümör organoid oluşumu zaman ders. 0. günde, tek hücre kaplama (Şekil 1A) takiben birkaç saat gözlenebilir. 1. günde, refrakter çekirdekleri ile kolon tümör epitel hücreleri gözlenebilir atlattı. 3. gün de, hücrelerin boyutunu iki katına çıktı. 6. günde, organoid büyüklüğü on kat daha fazla genişletilmiş ve orta apoptoz işaretleri göstermiştir. Gün 14, or...

Tartışmalar

Bu protokolde tarif edilen deneysel prosedürler farelerdeki primer fare kolon tümörlerinde, izolasyonu ve kültürü için izin verir. Protokol Dr Clevers grup ^1,24,27 tarafından yapılan ufuklar iş uyarlanmıştır. Biz tümör organoids daha iyi verim almak için sindirim süresi ve kollajenaz konsantrasyonu optimize edilmiş. Kritik adımlar tümör tek hücre içine hücre sindirim, Matrigel tabanda ve seçici kültürünü içerir. Tümör hücre sindirim için, sırayla kolon tümörlerinde etkin a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356234	5 mg/ml
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188	375U/mg
Dispase	Gibco	17105-041	1.8U/mg
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010
Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural	Invitrogen	53003-018
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	100 x
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	50 x
Glutamax-I	Gibco	35050-079	100x
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165-5G
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
PicoPureTM RNA Isolation Kit	Invitrogen	KIT0204