In-vitro-Kultur von Organoide Primäre Maus Kolontumoren

Zusammenfassung

Eine einfache Methode zur primären murinen Kolontumor organoide etablieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaft, dass Kolontumorzellen überleben und wachsen in Organoiden in Medien, die begrenzte Wachstumsfaktoren, während normale Kolonepithelzellen nicht tun.

Zusammenfassung

Mehrere Menschen und der Maus Darmkrebs-Zelllinien etabliert haben, sind physiologische Integrität Kolontumoren wie mehrere Zellschichten, Basal-apikale Polarität, die Fähigkeit, zu differenzieren und nicht in anoikis Darmkrebs abgeleiteten Zelllinien erhalten. Die vorliegende Studie zeigt, ein Verfahren zur Kultivierung von primären Maus Kolontumors organoids von Sato T et al. ^1, die wichtige physiologische Funktionen Kolontumoren behält angepasst. Dieses Verfahren besteht aus Maus Colontumorgewebe Sammlung, neben normalen Kolonepithel Dissoziation Kolontumorzellen Verdauung in einzelne Zellen, die Einbettung Kolontumorzellen in Matrigel und selektive Kultur beruht auf dem Grundsatz, dass Tumorzellen das Wachstum auf limitierende Nährstoff Bedingungen gewährleisten im Vergleich zu normalen Epithelzellen.

Der Primärtumor Organoiden wenn aus genetisch veränderten Mäusen isoliert bieten einen sehr nützlichen System Tumor autonomen Funkt beurteilenIonen bestimmter Gene. Darüber hinaus sind die Tumor organoids zugänglich genetische Manipulation von Virus nachgedacht Gentransfer; daher Signalwege im Dickdarm Tumorentstehung beteiligt könnte auch weitgehend durch Überexpression oder Knockdown untersucht werden. Primärtumor Organoiden Kultur bietet eine physiologische relevant und machbar Mittel, um die Mechanismen und therapeutischen Modalitäten für Doppelpunkt Tumorentstehung zu untersuchen.

Einleitung

Die intestinalen Epithelzellen vermehren und drehen auf einer außerordentlichen Geschwindigkeit und übertraf damit alle anderen Geweben im Körper Wirbeltier ^2,3. Die teilenden Zellen, einschließlich Darm-Stammzellen (ISC) und Transit-Verstärkung Zellen differenzieren entweder in sekretorischen (Kelch, Paneth und enteroendokrinen) Zellen oder Enterozyten ^3. Das ISC ist an der Basis der Krypta. Panethzellen nach unten auf den Boden des Krypten und sind langlebig, während andere Linien nach oben wandern, um den Darmzotten ^3,4. Hier werden die Zellen in den Darm Inhalte einschließlich Mikroflora ausgesetzt und werden von den villus Tipps durch eine anoikis-induzierte Apoptose-Mechanismus zu vergießen. Obwohl die Doppelpunkt fehlt Zotten und Panethzellen, ist der Mechanismus für die Aufrechterhaltung der Homöostase ähnlich ^4.

Der Wnt-Signalweg ist in eine entscheidende Rolle in der intestinalen Proliferation und ISC Wartung ⁴ gebracht worden. Löschung von the Transkriptionsfaktor TCF4, ein nachgeschalteter Effektor der Wnt-Signalweg, führt zum Verlust der intestinalen Stammzellen und die anschließende Aufteilung des Gewebes ^5. Ebenso reduziert transgene Expression der Wnt-Inhibitor DKK1 die epithelialen Proliferation und erschöpft sekretorischen Zelllinien ^6. Umgekehrt induziert die Überexpression des Wnt-Agonisten R-spondin-1 potente und rasche Verbreitung der intestinalen Kryptenzellen ^7.

Angesichts der Bedeutung der Wnt-Signalweg für intestinale Homöostase, sind Wnt-Signalweg Mutationen häufig in Darmkrebs ⁸ beobachtet. Darmkrebs ist die dritthäufigste Todesursache durch Krebs in den Vereinigten Staaten ^9. Excess Nahrungsaufnahme mit rotem Fleisch und Alkohol, Bewegungsmangel und geerbt und somatische Mutationen gelten als Risikofaktoren für Darmkrebs ^10,11 sein. Die adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen, ein Schlüssel Wnt-Faktor ist in der Mehrzahl der pa mutiertenPatienten mit familiärer, sporadisch, und Colitis-assoziierten Darmkrebs ^12,13. Mutationen von anderen Faktoren in Wnt-Signalweg einschließlich Axin2 und β-Catenin beteiligt sind auch bei Darmkrebs ^14,15 beobachtet. Jedoch ist die genaue Mechanismus und wirksame Therapie für Darmkrebs noch aus. Um die Untersuchung der molekularen Mechanismen für Darmkrebs zu erleichtern, haben menschliche Darmkrebs-Zelllinien, die verschiedene Stufen der Tumorprogression von einer gutartigen zu einer aggressiven Zelltyp wurden ^16-18 etabliert. Maus Kolonkarzinomzelllinien mit verschiedenen metastasierenden Eigenschaften sind auch ^19,20. Dennoch sind Primärzellen oder organoide Kulturen über transformierten Zelllinien bevorzugt, weil sie genau imitieren die in vivo-Zustand und erzeugen mehr physiologisch relevanten Daten ^21. Die meisten Dickdarm-Krebs-Zelllinien wachsen als Monolayer an der Platte befestigt oder als Zellsuspensionen lacking apikalen basolateralen Orientierung und Tight Junctions zwischen den Zellen. Außerdem unterziehen normalen und Tumor-intestinalen Epithelzellen in vivo eine spontane Form der Apoptose bezeichnet anoikis wie die differenzierten Zellen die villus Tipps erreichen und Schuppen ^22. Diese Funktionen sind nur schwer in Zelllinien rekapitulieren, sind aber in den Entwicklungsprozess von Darmkrebs ²³ wichtig. Diese Funktionen werden in primäre Organoiden gepflegt. Darüber hinaus bieten die Tumorzellen organoiden Kulturen ein wirksames System zur Tumor autonomen Funktion der Gene im Vergleich zu in-vivo-Studien zu beurteilen. Genetische Manipulation in vivo des Darms ist ein zeitaufwendiger Prozess vor allem durch die Schaffung von transgenen und / oder Knockout-Mäusen mit Darm-spezifischen Treibern. Allerdings sind die Tumor Organoiden leicht zugänglich, um virale vermittelte genetische Manipulationen und damit ein großes Werkzeug für die Beurteilung der genauen molekularen Mechanismen. Primäre Darmtumor organoide Kulturen have demonstriert worden, um eine praktikable und leistungsfähige Technik sein. Primäre Darm Zellkultur funktionelle Darm Organoiden mit Krypta-Darmzotten Struktur in vitro herzustellen aus einer einzigen Erwachsenen Lgr5 + Stammzellen ^24. Diese Organoiden können transplantiert werden und eingepflanzt in ein beschädigtes Gewebe zur Regeneration Doppelpunkt ^25. Weitere Anpassung der Kulturbedingungen hatte ähnliche epithelialen Organoiden von Maus Doppelpunkt und menschlichen Dünndarm und Dickdarm möglich ¹ gemacht. Für primären normalen Kolonepithel Kultur, basale Kulturmedium sowie Wachstumsfaktoren, einschließlich EGF, Noggin, R-und spondin Wnt3a sind unerlässlich, während basale Kulturmedium und EGF ist ausreichend für wachsende primäre Maustaste Kolontumor Organoiden ^1. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren, Kultur und erzeugen Kolontumor Organoiden.

Protokoll

1. Colon Tumor Isolation und Zelldissoziation

1. Intestinale Tumoren können von jedem sporadische oder Behandlung induzierten Dickdarmkrebs Modell isoliert werden. Die Mäuse sollten mit CO ₂ eingeschläfert werden. Doppelpunkte werden dann gesammelt, gespült mit kaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und der Länge nach geöffnet. Identifizieren Regionen mit Tumoren mit einem Stereomikroskop, sezieren mit einer Schere, und waschen mit kaltem PBS.
2. Inkubieren Darm-Fragmente, die Tumoren in EDTA-Chelat-Puffer (2 mM EDTA, 5,6 mmol / L Na ₂ HPO _4, 8,0 mmol / L KH ₂ PO _4, 96,2 mmol / L NaCl, 1,6 mmol / L KCl, 43,4 mmol / L Saccharose, 54,9 mmol / l D-Sorbit, 0,5 mmol / l DL-Dithiothreitol in destilliertem Wasser) für 60 min auf Eis.
3. Nach Chelat, werden die meisten der normalen intestinalen Epithelzellen abgetrennt werden, während Tumorzellen Mesenchym befestigt bleiben wird. Absaugen die Chelatbildung Puffer mit normalen Epithelzellenund wäscht den Rest Tumorfragmente ein weiteres Mal mit 5 ml kaltem Puffer Chelatbildung.
4. Absaugen die Chelatbildung Puffer waschen Tumorfragmente mit 5 ml kaltem 1x PBS.
5. Absaugen des 1x PBS, Inkubation Tumorfragmente bei der Verdauung Puffer (2,5% fötalem Rinderserum, 1 Einheit / ml Penicillin, 1 ug / ml Streptomycin und 2,5 ng / ml Amphotericin B, 200 U / ml Kollagenase Typ IV, 125 ug / ml Typ II Dispase in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium) für 2 Stunden bei 37 ° C.
6. Lassen Sie die Tumorfragment unter normalen Schwerkraft für 1 min absetzen, und den Überstand in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Pellet die einzelne Zelle Tumor Suspension Überstand durch Zentrifugation bei 200 xg für 3 min und waschen einmal mit 5 ml PBS durch Zentrifugation bei 200 xg für 3 min.

2. Kultur Darm Tumor

1. Resuspendieren der Tumorzelle Pellet mit 500 ul PBS, zählen isolierte einzelne Tumorzellen mit einer Zählkammer.
2. Pellet Tumorzellen durch centrifuging bei 200 × g für 3 min, und resuspendieren sie in 5 mg / ml Matrigel auf Eis und Platte in Platten mit 24 Vertiefungen mit 15.000 Zellen pro 50 ul pro Vertiefung Matrigel.
3. Lassen Sie die Matrigel für 15 min polymerisiert bei 37 ° C, und fügen Sie 500 ul / Vertiefung basalen Kulturmedium (1 Einheit / ml Penicillin, 1 ug / ml Streptomycin und 2,5 ng / ml Amphotericin B, 10 mmol / L HEPES , 2 mM Glutamax, 1x N2 Ergänzung, 1x B27 Ergänzung, 1 mmol / L N-Acetylcystein in Modified Adler Erweiterte Dulbecco Medium/F12) mit 50 ng / ml Maus-EGF.

3. Wartung Gegründet Organoide

1. Ändern basalen Kulturmedium mit EGF alle 2 Tage und Passage Organoiden 01.05 einmal pro Woche.
2. Für Passagieren, ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches basalen Kulturmedium. Mechanisch stören Organoiden und Matrigel mit einem P1000 mit Spitzen abgeschnitten und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Weitere mechanische Dissoziation wird erreicht, indem ein Feuer polierten Pasteur Rohrtte.
3. Waschen Sie distanzierte Organoiden mit 5 ml der basalen Kulturmedium und Zentrifuge bei 200 xg für 2 min.
4. Überstand verwerfen, das Pellet mit Matrigel und fügen Kulturmedium wie oben beschrieben.

4. Speicher-und Recovery von Gegründet Organoide

1. Für die langfristige Lagerung einfrieren Organoiden in flüssigem N _2, die stabil sind für mindestens 2 Jahre. Zum Einfrieren Organoiden, stören mit einem P1000 mit Spitzen abgeschnitten und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen.
2. Waschen Sie distanzierte Organoiden mit 5 ml der basalen Kulturmedium und Zentrifuge bei 200 xg für 2 min.
3. Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), enthaltend 20% fötales Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
4. Transfer-Zellen in 1,5 ml Kryoröhrchen, dann die Rohre in einer Nalgene Mr. Frosty Einfrieren Behälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank, eine Kühlung zu erzielenvon -1 ° C / min. Nach Inkubation über Nacht übertragen Röhrchen in flüssigem N _2.
5. Für die Wiederherstellung werden die gefrorenen Organoiden schnell in einem 37 ° C Wasserbad, waschen mit basalen Kulturmedium, Spin-down, in Matrigel und Kultur mit oben beschriebenen Bedingungen resuspendieren. Aufgetaut

5. RNA-Extraktion, Protein Extraction und Immunhistochemie

1. RNA-Extraktion: Die Zellen werden gesammelt, wie oben beschrieben, für den Durchgang. RNA wird mit PicoPure ^TM RNA Isolation Kit nach den Anweisungen des Herstellers isoliert.
2. Protein Extraction: Zellpellets werden gesammelt wie oben beschrieben und lysiert in 100 ul Assaypuffer Radioimmunfällung (RIPA, 50 mmol / l Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol / l NaCl, 2 mmol / l EDTA, 1% NP-40, 0,1 % SDS) mit 1x Proteasehemmer.
3. Immunhistochemie: Absaugen Zellkulturmedium, übertragen Tumor Organoiden mit P1000 mit Spitzen aus in Cryo-Form geschnitten und sofort einfrieren in tisverklagen Einfriermedium (OCT) mit Trockeneis. Gefrierschnitte wurden bei 7 um geschnitten und gefärbt, wie zuvor beschrieben ^26.

Ergebnisse

Der zeitliche Verlauf eines Kolontumor organoide Bildung von einem drei Monate alten ^{ApcMin / +} Maus ist in Abbildung 1 dargestellt. Am Tag 0, könnten einzelne Zellen mehrere Stunden nach der Beschichtung (Abbildung 1A) beobachtet werden. Am Tag 1, überlebten Kolontumors Epithelzellen mit feuerfesten Kerne beobachtet werden. Am Tag 3, verdoppelte sich die Größe der Zellen. Am Tag 6, erweitert die Größe der organoide mehr als das Zehnfache und zeigte Anzeichen v...

Diskussion

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben wird zur Isolierung und Kultivierung von primären murinen Kolontumoren ermöglichen. Das Protokoll wird von bahnbrechenden Arbeit von Dr. Clevers Gruppe ^1,24,27 getan angepasst. Wir optimierten die Verdauung Zeit und Kollagenasekonzentration um eine bessere Ausbeute des Tumors Organoiden bekommen. Die kritischen Schritte umfassen Tumorzelle Verdauung in einzelne Zellen, Matrigel Resuspension und selektive Kultur. Für Tumorzellen Verdauung, um ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356234	5 mg/ml
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188	375U/mg
Dispase	Gibco	17105-041	1.8U/mg
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010
Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural	Invitrogen	53003-018
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	100 x
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	50 x
Glutamax-I	Gibco	35050-079	100x
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165-5G
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
PicoPureTM RNA Isolation Kit	Invitrogen	KIT0204