تنقية الرنا الميكروي والتنميط من Exosomes المشتقة من الدم والثقافة وسائل الإعلام

Summary

وقد ولدت وجود microRNAs مستقرة (miRNAs) في exosomes مصلحة هائلة كوسيلة للاتصال بين الخلايا الرواية، لفائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية وكطريق للتدخل العلاجي. نحن هنا لشرح تنقية exosome من الدم والثقافة وسائل الإعلام تليها الكمية PCR لتحديد miRNAs التي يجري نقلها.

Abstract

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.

Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.

These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.

Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.

These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

Introduction

miRNAs غير مكود قصيرة تعدل التعبير الجيني عن طريق الربط إلى الهدف مرنا. البذور تسلسل التكامل بين ~ 7 أزواج قاعدة تمكن ميرنا لربط مرنا الهدف مما أدى إلى تثبيط الترجمة أو في انخفاض في استقرار مرنا، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في التعبير عن بروتين الهدف ^1. حيث أثبت بحث علمي على مدى العقد الماضي بشكل لا لبس فيه دورا أساسيا لmiRNAs في التوسط في الوظائف الخلوية. وكان هناك أيضا جهدا كبيرا توجه نحو تشريح ميرنا التغيرات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض المختلفة بوساطة ^2،3. وعلاوة على ذلك، وتحديد الأخيرة لل miRNAs مستقرة في سوائل الجسم ^4-6 مهدت الطريق لاستخدامهم المؤشرات الحيوية رواية قابلة للتشخيص السريري.

وضع واحدة من وسائل النقل ميرنا في سوائل الجسم هو عبر exosomes، حويصلات صغيرة التي تحمل mRNAs و، البروتينات، الدهون وسطاء، وmiRNAs إلى خلايا المتلقي عبر النظامية circulat الدمأيون ^7-14. هذه النتائج في التشكيل التعبير الجيني في الخلايا المتلقية ويمثل آلية جديدة للاتصالات الخلوية. على سبيل المثال، يمكن أن الخلايا المناعية تعدل العمليات التنظيمية عن طريق إفراز و / أو exosomes امتصاص الجزيئات الحيوية التي تحتوي على المشاركة في التهاب مثل انترلوكين 1β (IL1β)، عامل نخر الورم α (TNFα)، وتحويل عامل النمو β5 (TGFβ5)، و وmiRNAs التي تنظم هذه الجينات ^13. كما الشاذة التعبير ميرنا هو سمة مشتركة في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، وهذه الجزيئات فرصا جديدة مثيرة لاكتشاف والتحقق من أهداف علاجية جديدة ^2.

miRNAs تعميم موجودة في جميع سوائل الجسم وأنه من المعروف أن تكوين exosomes يختلف استنادا إلى الخلايا المصدر الذي تم الإفراج عنهم. وبالتالي فإنها تقدم وسيلة لدراسة الحالة الفسيولوجية للخلايا وكيف الخلايا يغير إشارة حتىTS ردا على الإجهاد بما في ذلك الأمراض. يمكن دراسة تغيرات في تكوين exosome توفير نظرة ثاقبة نقل الإشارة والتحقيق فائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية أو المسارات التدخل العلاجي.

هنا سوف نظهر تنقية exosomes من مصادر متعددة استنادا إلى البروتوكولات التي تم نشرها. وسوف تستخدم هذه exosomes لعزل الحمض النووي الريبي تليها QPCR لتحديد وقياس مستويات لل miRNAs موجودة في exosomes.

Protocol

وأعدم جميع التجارب باستخدام عينات دم من الإنسان والقوارض في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. التحق البشر بعد إعطاء الموافقة المسبقة على النحو الذي أقرته جامعة دريكسيل كلية الطب مجلس المراجعة المؤسساتي وجميع إجراءات الدراسات التي أجريت باستخدام حيوانات وافق عليها المؤسسي رعاية الحيوان دريكسيل واستخدام اللجنة.

1. تنقية Exosome من الدم (~ 5.5 ساعة)

TIPS

• نحن resuspend exosomes من أنبوب واحد من الدم (~ 10 مل دم الإنسان و~ 2 مل دم الماوس) في 300 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي الريبي من mirVana ميرنا عدة العزلة.
• لتنقية exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، ونسج وسائل الإعلام في 500 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الخلايا وتصفيتها أيضا من خلال مرشح 0.22 ميكرون بعد الطرد المركزي في 12،000 ز س. تنقية exosome من وسائل الإعلام ثقافة الخليةلا يتطلب التخفيف في برنامج تلفزيوني، ويغسل PBS أو الخطوة الثانية تنبيذ فائق.
• إذا كان سيتم استخدام exosomes تنقيته للدراسات البروتينات، إضافة السكروز التدرج خطوة الطرد المركزي بعد خطوة تنبيذ فائق سوف تقلل من كمية البروتين المجاميع والملوثات ^15.
• مورفولوجية المرصودة من exosomes يمكن أن تختلف اعتمادا على كل من المصدر والخطوات اللازم للتجهيز لTEM. نحن لم تراع التشكل على شكل كوب لexosomes التي ويعزى سابقا إلى الاختلافات في تجهيز العينات ^9،15. لدينا صور TEM بما في ذلك وضع العلامات immunogold مماثلة لتقارير سابقة من مصادر مختلفة بما في ذلك الدم، الصفراوي والثقافة القشرية المستمدة exosomes ^9،16،17.

1. عكس EDTA أنبوب المغلفة التي تحتوي على الدم 5X ومكان تستقيم في درجة حرارة الغرفة ل10-60 دقيقة.
2. الطرد المركزي في 2،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. لى>
3. جمع الطبقة العليا، والبلازما، في 15 مل أنابيب والحفاظ على الجليد.
4. تمييع السائل مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 2،000 XG في 4 درجات مئوية.
5. نقل إلى أنابيب الطرد المركزي، إضافة 1X PBS لوحدة تخزين ما مجموعه 24 مل، وأجهزة الطرد المركزي 45 دقيقة في XG 12،000 في 4 درجات مئوية.
6. نقل إلى أنابيب منبذة فائقة وأجهزة الطرد المركزي 2 ساعة على 110،000 XG في 4 درجات مئوية.
7. بيليه resuspend في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي 1 ساعة على 100،000 XG في 4 درجات مئوية.
8. بيليه resuspend في المخزن المناسب (العازلة تحلل الحمض النووي الريبي).
9. resuspend في برنامج تلفزيوني أو RIPA العازلة للفحص المجهري الإلكترون وتحليل لطخة غربية على التوالي.

2. RNA تنقية باستخدام mirVana كيت عزل ميرنا التعديل (~ 1 ساعة)

TIPS

• إعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، ومحو الأسطح وماصات مع ريبونوكلياز زاب، واستخدام نصائح تصفية العقيمة والأنابيب.
• الطبقة = "jove_content"> على الرغم من أن بروتوكول من البائع يعطي الخيار لتنقية ميرنا فقط، ونحن دائما عزل الحمض النووي الريبي مجموع بما في ذلك مرنا وميرنا حتى نتمكن من دراسة كلا من نفس العينة.
• مضيفا إن على من عمود خطوة العلاج الدناز يزيل آثار من الحمض النووي التي قد تكون موجودة. اعتمادا على مصدر exosomes، تم الإبلاغ عن الحمض النووي لتغيبه في exosomes تنقيته من بعض المصادر بما فيها الماوس وخطوط الخلايا البدينة الإنسان ⁸ ولكن تم الكشف عن تسلسل الحمض النووي الكروموسومات في exosomes تنقيته من وسائل الإعلام من العضلية مثقف ^18.
• خفضنا حجم محلول الغسيل 1-350 ميكرولتر (الخطوة 2.4 أدناه) لأن البائع يقدم فقط ما يكفي من غسل حل 1 ل700 واحد بالإضافة ميكرولتر. إذا لم يتم خفض حجم ليس هناك حلا كافيا تركت لاستخدام محتويات عدة كامل. أجريت الخطوات المتبقية وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.

1. إضافة 1/10 VOلوم من ميرنا المضافة جناسة (30 ميكرولتر)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
2. استخراج مع حجم حمض الفينول: الكلوروفورم مساويا لحجم المحللة الأولية. أجهزة الطرد المركزي واستعادة المرحلة العليا في أنبوب جديد.
3. إضافة 1.25 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ (375 ميكرولتر). دوامة. تطبيق لتصفية خرطوشة وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
4. إضافة نصف أوصت حجم ميرنا غسل الحل 1 (350 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
5. إضافة 10 ميكرولتر الدناز 1-70 ميكرولتر العازلة نشر الإشعاعات (QIAGEN) لكل عينة. إضافة 80 ميكرولتر إلى العمود واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. أضف غسل الحل 1 (350 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
7. أضف غسل الحل 2/3 (500 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س. تكرار.
8. أزل مع 40 ميكرولتر 95 ° C nuclease خالية-H ₂ O.
9. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ويخفف من الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر.

3. التنميط ميرنا من Exosomes من فيلات الفندقيةد عن طريق Taqman صفيف منخفض الكثافة (TLDA) بطاقات (~ 6.5 ساعة)

TIPS

• إعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية، ومحو الأسطح وماصات مع ريبونوكلياز زاب، واستخدام نصائح تصفية العقيمة والأنابيب.
• ينصح قبل التضخيم (قبل أمبير) خطوة ل1-350 نانوغرام الحمض النووي الريبي (350-1،000 عينات نانوغرام لا تتطلب خطوة ما قبل أمبير بعد التوليف [كدنا]). ومن المهم تحديد ما إذا كان ما قبل أمبير هو ضروري لعينتك لأنه يجب معاملة جميع العينات تحت ظروف متساوية. الخطوة ما قبل أمبير يضيف التكلفة والقيم المقطعية لديهم انخفاض خفض قبالة مقبول (32 بدلا من 40).
• ومن المفيد لإعداد رد فعل [كدنا] في أنابيب الشريط بدلا من لوحة اعتمادا على عدد من البطاقات التي يمكن تشغيلها في يوم واحد. وهذا سيقلل تجميد أذاب عينات من [كدنا] التي لن تتم معالجتها في نفس اليوم.
• Exosomes تم جمعها من مصادر مختلفة لها diffeاستئجار كميات من الحمض النووي الريبي. هذا البروتوكول يسمح بحد أقصى 3 ميكرولتر قالب الحمض النووي الريبي للتفاعل التوليف [كدنا]. اعتمادا على مصدر، وكمية من الحمض النووي الريبي exosomal التي يمكن أن تكون معزولة محدودة ربما. في حين أن الأنسجة نموذجية سيحقق ما يكفي من الحمض النووي الريبي التي من شأنها أن كدنا] أن تكون مصنوعة من 100 نانوغرام في الحمض النووي الريبي 3 حجم ميكرولتر، exosomes من الدم البشري أو وسائل الإعلام ثقافة الخلية البشرية غالبا ما تحتوي على أقل RNA وكدنا] يجب أن تكون مصنوعة من مواد أقل البداية. exosomes الدم الماوس تحتوي على مستويات أعلى من الحمض النووي الريبي ويمكن الحصول عليها لا يقل عن 100 نانوغرام في 3 ميكرولتر.

1. لإعداد [كدنا] من تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجمعات ميجابلكس عكس الاشعال الناسخ (A بركة وبركة تحتوي على الاشعال لmiRNAs على بطاقات ميكروفلويديك B صفيف A و B)، أذاب المكونات رد فعل على الجليد.
2. تسمية اثنين من ريبونوكلياز خالية من 1.5 مل أنابيب لرد فعل RT جانب حمام سباحة للالاشعال أو بركة B الاشعال وإضافة مكونات من أجل التخطيط. إضافة واحد على الأقل حجم اضافية من المكونات لمدة 2 أو أكثر ردود الفعل أو جعل مزيج الرئيسي على النحو الموصى به من قبل رانه بائع.

RT مكون رد فعل	تركيز عنصر	حجم العينة ل1 (مجموع V / عينة = 4.5 ميكرولتر)
المياه nuclease خالية-		0.20 ميكرولتر
ميجابلكس RT العازلة (10X)	1X	0.80 ميكرولتر
dNTPs (100 ملم)	4.4 ملي	0.20 ميكرولتر
MgCl 2 (25 ملم)	5 ملي	0.90 ميكرولتر
ريبونوكلياز المانع (20U/μl)	2 U	0.10 ميكرولتر
ميجابلكس RT الاشعال A أو B (10X)	1X	0.80 ميكرولتر
MultiScribe الناسخ العكسي	75 U	1.50 ميكرولتر

3. عكس أنابيب 6 مرات والمائةrifuge لفترة وجيزة. ثم، ماصة 4.5 ميكرولتر RT مزيج التفاعل إلى MicroAmp شرائط 8-أنبوب أو 96 جيدا MicroAmp لوحة رد فعل بصري.
4. إضافة 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي وضبط مستوى الصوت إلى 3 ميكرولتر مع المياه المعالجة DEPC أو إضافة 3 ميكرولتر الحمض النووي الريبي مجموع، وإثارة مع طرف ماصة، وختم أنابيب أو لوحة. تدور لفترة وجيزة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
5. تحميل رد فعل في الجهاز PCR وتشغيله وفقا للشروط التالية (على النحو الموصى به من قبل النظم البيولوجية ميجابلكس بروتوكول مجمعات التطبيقية):

مرحلة	درجة الحرارة	وقت
دورة (40X)	16 ° C	2 دقيقة
	42 ° C	1 دقيقة
	50 ° C	1 ثانية
عقد	85 ° C	5 دقائق
عقد	4 ° C	∞

6. تخزين [كدنا] في -20 ° C (جيد لمدة أسبوع واحد على الأقل) أو الاستمرار في الخطوة ما قبل أمبير التي يمكن تخزينها لمدة أسبوع واحد.
7. ذوبان الجليد الاشعال PREAMP للسباحة وبركة A B على الجليد وعكس إلى المزيج. دوامة Taqman قبل الأمبير ماستر خلط والحفاظ على الجليد أيضا.
8. متابعة الرسم البياني إضافة واحدة على الأقل حجم اضافية من المكونات لمدة 2 أو أكثر ردود الفعل أو جعل مزيج الرئيسي على النحو الموصى به من قبل البائع.

قبل أمبير مكون رد الفعل	حجم العينة لمدة 1
المياه nuclease خالية-	7.5 ميكرولتر
Taqman ميكس ماستر PREAMP (2X)	12.5 ميكرولتر
الاشعال PREAMP ميجابلكس A أو B (10X)	2.5 ميكرولتر

9. ماصة 2.5 ميكرولتر RT الم ÙCT في MicroAmp شرائط 8-أنبوب أو 96 جيدا MicroAmp لوحة رد فعل بصري والاستغناء 22.5 ميكرولتر مزيج رد فعل PREAMP في كل بئر.
10. ختم لوحة، واحتضان على الجليد 5 دقائق ثم تحميل العينة في الجهاز PCR. تعمل تحت الشروط التالية.

مرحلة	درجة الحرارة	وقت
عقد	95 ° C	10 دقيقة
عقد	55 ° C	2 دقيقة
عقد	72 ° C	2 دقيقة
دورة (12X)	95 ° C	15 ثانية
	60 ° C	4 دقيقة
عقد	99.9 ° C	10 دقيقة
عقد	4 ° C	∞

11. بعد الانتهاء من رد فعل PREAMP، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على أنابيب أو لوحة ثم قم بإضافة 75 ميكرولتر 0.1X TE 8.0 درجة الحموضة إلى كل بئر أو أنبوب.
12. ختم وخلط وتدور لفترة وجيزة. تخزين المنتج المخفف لمدة أسبوع عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو الاستمرار على لتحميل لوحة.
13. الجمع بين ما يلي في ريبونوكلياز خالية من 1.5 مل أنبوب على الجليد.

عنصر	الصوت لبطاقة 1
Taqman العالمي PCR ماجستير ميكس، لا AmpErase UNG (2X)	450 ميكرولتر
المنتج PREAMP المخفف	9 ميكرولتر
المياه nuclease خالية-	441 ميكرولتر

14. عكس أنبوب لخلط وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. الاستغناء عن 100 ميكرولتر PCR مزيج التفاعل إلى كل منفذ من الرنا الميكروي بطاقة صفيف Taqman.
15. أجهزة الطرد المركزي في بطاقة 2 × 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة. ختم البطاقة وتشغيلها باستخدام النموذج المقدم مع الاشعال في النظم البيولوجية التطبيقية اليدوي وكذلك Taqman منخفض الكثافة 384 إعدادات صفيف. نحن نستخدم النظم البيولوجية 7900HT سريعة نظام PCR في الوقت الحقيقي التطبيقية.

4. مرنا التحليل من قبل Taqman (~ 1.5 ساعة)

1. لإعداد رد فعل QPCR، مزج المكونات في رد فعل النظام في التخطيط. وسوف يتم تحليل جميع العينات مع تحقيقات التمهيدي لالجينات في المصالح وكذلك 18S الرنا الريباسي كما الجين الامور الى حالة طبيعية.

Taqman مكون رد الفعل	حجم العينة لمدة 1
المياه nuclease خالية-	7 ميكرولتر (ضبط استنادا إلى عينة الفردية)
Taqman سريعة ماستر ميكس (2X)	10 ميكرولتر
تحقيقات التمهيدي Taqman (20X)	1 ميكرولتر
[كدنا] من الحمض النووي الريبي 100 نانوغرام	2 ومو، L (ضبط على عينة الفردية)

2. تشغيل لوحة جيدا باستخدام 96 بلوك 96 جيدا سريعة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (النظم البيولوجية التطبيقية 7900HT سريعة نظام PCR في الوقت الحقيقي).

النتائج

بعد عزل exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الدم أو خلية، ونقاء exosomes يمكن اختبارها من قبل المجهر الإلكتروني (EM) والغربية وصمة عار (أرقام 1A و 1B). أكدنا الاستعدادات exosome لدينا من مصادر مختلفة مع EM وطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة متعددة. الشكل 1A يظه...

Discussion

في هذا البروتوكول، وتبين لنا من القياس الكمي لل miRNAs وmRNAs وتنقيته من exosomes بواسطة الطرد المركزي المغاير من الدم والثقافة وسائل الإعلام. Exosomes على مكونات متنوعة تعتمد على أصلهم وتشارك في عدد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك الاستجابة المناعية، العرض مستضد، الاتصال بين ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)	BD Diagnostics	366643	For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)	BD Diagnostics	367841	For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube	BD Diagnostics	762165	For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit	Ambion	AM1561
Acid-Phenol: CHCl3	Ambion	9721G
DNase 1	Qiagen	79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG	Applied Biosystems	4326614	For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0	Applied Biosystems	4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0	Applied Biosystems	4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0	Applied Biosystems	4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0	Applied Biosystems	4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0	Applied Biosystems	4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0	Applied Biosystems	4444913
Taqman MicroRNA RT kit	Applied Biosystems	4366596
Taqman fast universal PCR master mix	Applied Biosystems	4366072	For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe)	Applied Biosystems	Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe)	Applied Biosystems	Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR	Thermo Scientific	K1642	For mRNA
HSP70 antibody	Abcam	ab94368	For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold	Sigma	G7402	For electron microscopy
Rabbit-anti CD81	Sigma	SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.