外来体的纯化和microRNA剖析来源于血液和文化传媒

摘要

存在稳定的microRNA（miRNA的）外来间通讯作为一种新型的模式产生了巨大的兴趣，为他们的潜在效用作为生物标志物和治疗干预的路由。在这里，我们展示了切体净化血液和文化传媒定量PCR确定的miRNA被运。

摘要

稳定的miRNA是目前在所有的体液和一些循环miRNA是封存在小囊，称为外来免受降解。外来体可以在RNA和蛋白质转移到目标小区与质膜融合。它们的生物学功能包括免疫反应，抗原呈递细胞内的通信。受体细胞通过血液，可以调节基因表达的miRNA交付开辟了新的途径为目标的干预。除了提供交付药物或RNA的治疗药物的战略，exosomal内容可以作为生物标志物，可以帮助诊断，确定治疗方案和预后。

在这里，我们将介绍的程序定量分析miRNA和外来的信使RNA（mRNA）的分泌在血液和细胞培养基。纯化的外来的特点将是使用免疫印迹分析EXOS的OMAL标记和PCR检测mRNA的兴趣。透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记将被使用的，来验证exosomal的形态和完整性。从这些外来体将纯化总RNA，以确保我们可以从相同的样本研究的mRNA和miRNA。验证RNA的完整性，生物分析仪后，我们会进行一个中等通量定量实时PCR（qPCR）的使用Taqman探针低密度阵列卡（TLDA）和基因表达研究感兴趣的成绩单，识别exosomal miRNA的。

这些协议可以用于量化的患者中，啮齿动物模型和药物干预前，后的细胞培养基改变exosomal的miRNA。不同的Exosomal内容来源及细胞分泌外来体的生理条件。这些变化，可以了解单元和系统如何应对压力或生理扰动。我们的有代表性的数据展示Variations的miRNA纯化小鼠血液，人体血液和人体细胞的培养基中存在的外来。

在这里，我们将介绍的程序定量分析miRNA和外来的信使RNA（mRNA）的分泌在血液和细胞培养基。纯化的外来的特点将是感兴趣的mRNA的的exosomal标记和PCR使用免疫印迹分析。透射电子显微镜（TEM）和免疫金标记将被使用的，来验证exosomal的形态和完整性。从这些外来体将纯化总RNA，以确保我们可以从相同的样本研究的mRNA和miRNA。验证RNA的完整性，生物分析仪后，我们会进行一个中等通量定量实时PCR（qPCR）的使用Taqman探针低密度阵列卡（TLDA）和基因表达研究感兴趣的成绩单，识别exosomal miRNA的。

这些协议可以用来量化的改变，在exo​​somal miRNA的我Ñ​​患者，啮齿类动物模型，药物干预前后细胞培养基。不同的Exosomal内容来源及细胞分泌外来体的生理条件。这些变化，可以了解单元和系统如何应对压力或生理扰动。我们的有代表性的数据显示变化的miRNA存在于外来鼠标血，人体血液和人体细胞培养介质纯化

引言

短期非编码的miRNA调节基因表达靶mRNA结合。种子序列〜7个碱基对的互补性使miRNA的结合到靶mRNA，导致翻译抑制或减少的mRNA的稳定性，这两者都可以导致靶蛋白¹的表达减少。在过去十年的研究明确证明的基础性作用的miRNA介导细胞功能。同时也出现了相当大的努力，朝向解剖的miRNA介导的分子变化相关的各种疾病^2,3。此外，最近鉴定稳定的miRNA在体液^4-6铺平了道路，利用他们作为新型生物标志物，适合于临床诊断。

外来体，小囊泡携带基因，蛋白质，脂类介质，和miRNA通过全身血液circulat的受体细胞是通过体液中miRNA的运输模式之一离子^7-14。这将导致在受体细胞的基因表达的调制和蜂窝通信代表了一种新的机制。例如，细胞可以调节分泌和/或参与炎症如白细胞介素-1β（IL1β），肿瘤坏死因子-α（TNFα）的含有生物分子的吸收外来的免疫调节过程，转化生长因子-β5（TGFβ5），并调节这些基因的miRNA ^13。由于miRNA表达异常在人体多种疾病的共同特点是，这些分子的发现和验证新的治疗目标²提供了激动人心的新机遇。

循环miRNA是存在的所有体液中，它被称为外来的组成是不同的，根据他们被释放源细胞。因此，他们提供了一个途径来研究细胞的生理状况和细胞改变信号甚至TS压力，包括疾病。研究切体成分的改变，可以提供洞察信号转导，并探讨其潜在效用作为生物标志物或治疗干预航线。

在这里，我们将展示发布的协议的基础上，从多个来源的外来的净化。这些将用于RNA分离qPCR的识别和测量水平的miRNA存在于外来外来。

研究方案

所有实验中使用人类和啮齿动物的血液样本，符合所有有关准则，法规和监管机构执行。人类受试者参加知情同意后批准的德雷克塞尔大学Drexel的机构动物护理和使用委员会批准使用动物进行研究医学伦理审查委员会的一切手续。

1。外切体净化血液（约5.5小时）

TIPS

• 我们重悬外来一管血300μlRNA提取裂解液从mirVana miRNA分离试剂盒（〜10毫升人体血液和小鼠血〜2毫升）。
• 为了纯化从细胞培养基的外来体，介质旋转，在500×g离心10分钟以除去细胞，并以12,000×g离心分离后，通过0.22微米的过滤器过滤。外切体净化细胞培养基不需要稀释在PBS，PBS洗或的第二超速离心步骤。
• 如果纯化的外来体将用于蛋白质组学研究，超速离心步骤后，加入蔗糖梯度离心步骤将减少量的蛋白聚集体和污染物^15。
• 外来体可以观察到的形态有所不同，这取决于同时在源和用于TEM的处理步骤。我们并没有观察到样品处理^9,15差异归因于先前已外来杯形形态。我们的TEM照片，包括免疫标记类似于以前的报告从不同的来源，其中包括血液，胆汁和皮质文化衍生的外来^9,16,17。

1. 反转涂覆EDTA管中，血液5倍和地点直立10〜60分钟，在室温下。
2. 在4℃下2000×g离心15分钟离心
3. 收集的顶层，血浆，在15毫升管中并保持在冰上。
4. 稀释液用等体积的PBS。以2000×g离心30分钟，在4℃下
5. 转入离心管，加的总体积为24ml的PBS洗涤，并在4℃下以12000×g离心45分钟
6. 转移到超速离心机管，并以110,000 xg离心2小时，在4°C
7. 重悬沉淀在PBS中，在4℃下以100,000 xg离心1小时
8. 在适当的缓冲液中悬浮颗粒（RNA裂解缓冲液）。
9. 重悬在PBS或RIPA缓冲电子显微镜和免疫印迹分析。

2。 RNA纯化用改进的mirVana miRNA分离试剂盒（约1小时）

TIPS

• 佩戴个人防护装备（PPE），分离RNA核糖核酸ZAP擦拭表面和移液器，并使用无菌过滤嘴和管准备的区域。
从供应商的协议虽然给出了一个选项净化唯一的miRNA，我们总是提取总RNA，包括基因和miRNA，这样我们就可以研究无论是从同一样品。
• 添加一个列上的DNase处理步骤，除去可能存在的DNA痕迹。根据外来的来源，DNA已经从一些消息来源，包括鼠标和人体的肥大细胞线^8，但已发现染色体的DNA序列外来媒体纯化心肌细胞的¹⁸纯化外来缺席。
• 我们减少洗涤液的体积1至350微升（下面的步骤2.4），因为供应商提供足够的清洗液1 700μL此外。如果不降低音量没有足够的解决方案，使用整个套件内容留下。其余的步骤，根据制造商的建议进行。

1. 加入1/10 VOmiRNA的的匀浆添加剂（30微升）和孵育10分钟冰lume明。
2. 提取物的体积为基磺酸 - 苯酚：氯仿等于初始的溶胞产物的体积。在新的管中，离心回收上层相。
3. 添加1.25卷100％的乙醇（375微升）。涡街流量计。适用于过滤盒和以10,000×g离心15秒。
4. 加入推荐量的miRNA洗涤液1（350微升）的一半，并以10,000×g离心15秒。
5. 对每个样品中加入10微升DNA酶1〜70微升缓冲液RDD（Qiagen公司）。加入80微升列，并在室温下孵育15分钟。
6. 添加洗涤液1（350微升），并以10,000×g离心15秒。
7. 添加清洗液2/3（500微升），并在10,000×g离心15秒。重复。
8. 洗脱用40微升95℃下无核酸酶的H ₂ O的
9. 确定RNA浓度的RNA稀释至100毫微克/微升。

3。布卢外来体miRNA表达谱d使用Taqman探针低密度阵列（TLDA）的卡（约6.5小时）

TIPS

• 通过佩戴个人防护装备，分离RNA核糖核酸ZAP擦拭表面和移液器，并使用无菌过滤嘴和管准备的区域。
• 预扩增步骤是建议（前置放大器）1-350纳克RNA（350-1,000纳克样品不需要前置放大器的一步合成cDNA后）。重要的是要确定是否前置放大器为您的样品是必要的，因为你必须把所有的样品在同等条件下。前置放大器的步骤增加了成本和Ct值有一个较低的可接受的切断（32，而不是40）。
• 它是有用的，而不是根据卡的数量，可以运行在一个单一的天的板，以制备的cDNA的反应在条形管。这将减少在同一天，将不被处理的cDNA样品冻融。
• 外来体从不同来源收集有不同租金额的RNA。此协议允许最多3微升RNA为模板的cDNA合成反应的。根据不同来源，可以被孤立的exosomal RNA的量可能有限。而一个典型的组织会产生足够的RNA的cDNA，将100毫微克的RNA在3微升的体积，从人血或人类细胞培养基的外来通常含有较少的RNA和cDNA的必须由较少的起始原料。小鼠血液中的外来体含有较高水平的RNA，可以通过以下方式获得至少100毫微克3微升。

1. 要使用的Megaplex池纯化RNA制备cDNA逆转录引物（甲组及乙组B包含miRNA的引物微阵列卡A和B），冰解冻反应组分。
2. 标签两个RNase-free的1.5毫升管RT反应池的引物或乙组的引物，并添加组件图表顺序。添加至少一个额外的元件体积为2个或更多的反应，或使主结构建议采用t他的供应商。

RT反应成分	成分浓度	1个样本的体积（的总V /样品= 4.5微升）
无核酸酶水		0.20微升
的Megaplex RT缓冲液（10X）	1X	0.80微升
dNTPs浓度（100毫米）	4.4毫米	0.20微升
氯化镁 （25毫米）	5毫米	0.90微升
RNase抑制剂（20U/μl）	2 U	0.10微升
A或B的Megaplex RT引物（10X）	1X	0.80微升
MultiScribe逆转录酶	75ü	1.50微升

3. 反转管6次，占简要rifuge。然后，移液管4.5微升RT反应混合到微安8管条或96孔微安的光学反应板。
4. 添加100 ng的RNA和音量调整到3微升DEPC处理过的水或加3μl总RNA，搅拌枪头，密封管或板。短暂离心，并在冰上孵育5分钟。
5. 将反应到PCR仪，并在下列条件下运行（建议由美国应用生物系统公司的Megaplex池协议）：

舞台	温度	时间
周期（40X）	16°C	2分钟
	42°C	1分钟
	50°C	1秒
持有	85°C	5分钟
持有	4°C	∞

6. 储存在-20℃下（至少一个星期好）的cDNA或继续预放大器的步骤可以被存储为1个星期。
7. 甲组和乙组的冰解冻前置放大器的引物，并转化为混合。漩涡Taqman探针前置放大器主也并保持在冰上。
8. 按照图表添加至少一个额外的元件体积为2个或更多的反应，或由供应商建议的高手组合。

前置放大器反应成分	1个样本的音量
无核酸酶水	7.5微升
Taqman探针前置主混音（2X）	12.5微升
A或B的Megaplex前置放大器引物（10X）	2.5微升

9. 吸取2.5μLRT机生产线克拉到8管带或96孔微安的光学反应板和分配22.5微升前置放大器各孔中的反应混合液到微安。
10. 密封板，在冰上孵育5分钟，然后装入样品放入PCR仪。在下列条件下运行。

舞台	温度	时间
持有	95°C	10分钟
持有	55°C	2分钟
持有	72°C	2分钟
周期（12X）	95°C	15秒
	60°C	4分钟
持有	99.9°C	10分钟
持有	4°C	∞

11. 前置放大器反应结束后，短暂离心管或板，然后向每孔或管中加入75μl的0.1X TE pH为8.0。
12. 密封和混合简单旋转。稀释后的产品存放在-20℃下为1个星期，或继续加载板。
13. 组合下列RNase-free的1.5毫升管中，在冰上。

元件	1卡的体积
TaqMan通用PCR预混无AmpErase UNG（2X）	450微升
摊薄前置放大器产品	9微升
无核酸酶水	441微升

14. 反转管混合并短暂离心​​。免除100微升PCR反应混合成的TaqMan microRNA的阵列卡的每个端口。
15. 离心卡2×1,000×g离心1分钟。密封卡，并运行它使用Applied Biosystems公司手册和384 Taqman探针低密度阵列设置中的引物提供的模板。我们使用使用Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统。

4。 mRNA的分析采用TaqMan（约1.5小时）

1. 要准备的qPCR反应，反应组分混合，在图表中的顺序。所有的样品进行分析与感兴趣的作为标准的基因和18S rRNA基因的基因的引物探针。

Taqman探针反应成分	1个样本的音量
无核酸酶水	7微升（调整个别样品的基础上）
Taqman探针快速预混（2X）	10微升
Taqman探针引物探针（20倍）	1微升
从100纳克RNA基因	2亩L（调整基于个别样本）

2. 运行（使用Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统）制造商的建议，使用快速的96块96孔板。

结果

从血液或细胞培养介质隔离外来后，外来的纯度可以测试通过电子显微镜（EM）和免疫印迹（ 图1A和1B）。我们证实了我们的外切体的制剂， 图1A示出从各种来源与EM和使用多个抗体的免疫印迹。确认外来体具有直径约30 -100 nm处是完整的，并包含CD81的免疫金标记的EM图像。常用的exosomal标记是Hsp70和tetraspannin的家庭糖蛋白CD63，CD81和CD9 ^14。确认纯化的外?...

讨论

在这个协议中，我们展示了通过差速离心纯化的外来从血和文化媒体的miRNA和mRNA的定量。外来体取决于其原产地有不同的组成部分，并参与了一些生物功能，包括免疫反应，抗原呈递细胞内的沟通，转移RNA和蛋白质^{9,11,12,19,20。}大小和形状是外切体纯度的一个决定性因素，一些论文EM外来的数据表明，这些囊泡的范围可以在大小和形态的基础上从哪个源分泌，以及用于固定的方法和成像^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)	BD Diagnostics	366643	For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)	BD Diagnostics	367841	For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube	BD Diagnostics	762165	For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit	Ambion	AM1561
Acid-Phenol: CHCl3	Ambion	9721G
DNase 1	Qiagen	79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG	Applied Biosystems	4326614	For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0	Applied Biosystems	4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0	Applied Biosystems	4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0	Applied Biosystems	4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0	Applied Biosystems	4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0	Applied Biosystems	4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0	Applied Biosystems	4444913
Taqman MicroRNA RT kit	Applied Biosystems	4366596
Taqman fast universal PCR master mix	Applied Biosystems	4366072	For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe)	Applied Biosystems	Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe)	Applied Biosystems	Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR	Thermo Scientific	K1642	For mRNA
HSP70 antibody	Abcam	ab94368	For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold	Sigma	G7402	For electron microscopy
Rabbit-anti CD81	Sigma	SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.