Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Özet

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Özet

Kararlı miRNA'lar tüm vücut sıvılarında bulunan ve bazı dolaşan miRNA'lar exosomes adı verilen küçük kesecikler içinde haciz tarafından bozulması korunur. Exosomes hedef hücre RNA ve protein aktarımı ile sonuçlanan plazma zarı ile birleştirebilirler. Onların biyolojik fonksiyonları immün yanıt, antijen sunumu, ve hücre içi iletişim içerir. Kan yoluyla alıcı hücrelerde gen ifadesini düzenler miRNA'lar teslimi hedef müdahale için yeni yollar açtı. Ilaç veya RNA terapötik ajanların teslimat için bir strateji sunan ek olarak, exosomal içeriği tedavi seçenekleri ve prognoz belirlenmesinde, tanıda yardımcı olabilir biyolojik olarak hizmet verebilir.

Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA'lar ve haberci RNA'lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes exos için western blot analizi ile karakterize olacakilgi mRNA için OMAL işaretleri ve PCR. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir.

Bu protokoller, farmakolojik müdahale öncesi ve sonrasında, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı içinde exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri v gösteriyormiRNA'lar içinde ariations fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut.

Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA'lar ve haberci RNA'lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes ilgi mRNA için exosomal işaretleri ve PCR için western blot analizi ile karakterize edilecektir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir.

Bu protokoller exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir ifarmakolojik müdahale öncesi ve sonrası n hasta, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri miRNA'lar farklılıklar fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut göstermek

Giriş

Kısa noncoding miRNA'lar hedef mRNA bağlanarak gen modüle. ~ 7 baz çifti tamamlayıcılığı tohum sırası çevirinin engellenmesi ya da hedef proteinin ¹ azalmış ekspresyonu neden olabilir, her ikisi de mRNA, kararlılığını azalma ile sonuçlanan hedef mRNA bağlamak için MiRNA sağlar. Son on yılda Araştırma tümden hücresel fonksiyonları aracılık miRNA'lar için temel bir rol kanıtlamıştır. Ayrıca çeşitli hastalıklar ^2,3 altında yatan miRNA aracılı moleküler değişiklikler diseksiyon yönelik önemli çaba olmuştur. Ayrıca, vücut sıvıları ^4-6 istikrarlı miRNA'lar son belirlenmesi klinik tanı için uygun yeni biyolojik olarak kendi kullanımı için yolu açtı.

Vücut sıvıları içinde miRNA ulaşım bir mod sistemik kan dolaşımdaki ile alıcı hücrelere exosomes, mRNA taşıyan küçük kesecikler, protein, lipid arabulucular ve miRNA'lar üzerinden gerçekleştiriliriyon ^7-14. Alıcı hücrelerde gen ifadesinin modülasyonunda ve bu sonuçlar hücresel iletişim için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Örneğin, hücre büyüme faktörü-β5 (TGFβ5) dönüşüm, salgılayan ve / veya interlökin-1β (IL1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF) gibi inflamasyon dahil biyomoleküllerin içeren emici exosomes tarafından immün-düzenleyici işlemleri modüle ve olabilir Bu genlerin ¹³ düzenleyen miRNA'lar. Anormal miRNA ifade insan hastalıklarının çeşitli ortak bir özelliktir gibi, bu moleküller yeni tedavi hedefleri ² keşif ve doğrulama için heyecan verici yeni fırsatlar sunmaktadır.

Dolaşım miRNA'ların tüm vücut sıvılarında mevcut olan ve exosomes kompozisyonu, serbest bırakıldıktan hangi kaynak hücrelere göre farklı olduğu bilinmektedir. Böylece, hücrelerin fizyolojik durumunu incelemek için bir yol sunar ve nasıl hücrelerde bile sinyal değişiklik gösterecektirhastalıklar da dahil olmak üzere strese yanıt olarak ts. Exosome kompozisyon değişiklikler okuyan sinyal iletimi ilişkin bilgi sağlar ve biyolojik ya da terapötik müdahale yolları olarak potansiyellerini programını araştırabilirsiniz.

Burada yayınlanan protokollere dayalı birden fazla kaynaktan exosomes en arıtma gösterecektir. Bu exosomes exosomes mevcut miRNAs seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için QPCR ardından RNA izolasyonu için kullanılır.

Protokol

Insan ve kemirgenler kan örnekleri kullanan tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak idam edildi. İnsan konular Tıp Kurumsal Değerlendirme Kurulu Drexel University College ve hayvanlar kullanıldı çalışmaları için tüm prosedürleri Drexel en Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Kullanım Kurulu edildi onayladığı bilgilendirilmiş onam verdikten sonra alındı.

1. Blood Exosome saflaştırma (~ 5.5 saat)

İPUÇLARI

• Biz Mirvana miRNA izolasyon kiti 300 ul RNA lizis tamponu kan bir tüp (~ 10 ml insan kanı ve ~ 2 ml fare kan) den exosomes tekrar süspansiyon.
• Hücre kültürü ortamından exosomes arındırmak için, ortam hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca 500 xg'de bükülmüş ve 12,000 x g'de santrifüj işleminden sonra 0.22 um bir filtre ile filtre edilir. Hücre kültürü ortamından saflaştırılması exosomePBS, PBS yıkama veya ikinci ultrasantrifugasyon adımda bir seyreltme gerektirmez.
• Saflaştırılmış exosomes ultrasantrifugasyon aşamasından sonra bir sükroz gradyent santrifügasyonu adım ekleyerek, proteomik çalışmaları için kullanılacak ise protein agregatlarının ve kirletici ¹⁵ miktarını azaltacaktır.
• Exosomes gözlenen morfolojisi, kaynak ve TEM için işlem adımları iki bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha önce numune işleme ^9,15 farklılıkları isnat edilmiştir exosomes için fincan şeklinde morfolojisi gözlenmedi. Immunogold etiketleme dahil olmak üzere TEM görüntüleri exosomes ^9,16,17 edilen safra ve kortikal kültür kan, dahil olmak üzere farklı kaynaklardan önceki raporlar benzer.

1. 10-60 dakika oda sıcaklığında dik 5x ve yer kan içeren EDTA kaplı tüp ters.
2. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje
3. 15 ml tüpler üst tabaka, plazma, toplayın ve buz üzerinde tutmak.
4. PBS eşit bir hacmi ile akışkan seyreltin. 4 az 2,000 x g'de 30 dakika santrifüje ° C
5. 4 ° C de, santrifüj tüpleri 24 ml toplam hacmi için 1X PBS ekleyin ve 12,000 x g hızında 45 dakika santrifüj transfer
6. 4 ° C'de tüpler ultrasantrifüjdeki ve 110.000 xg 2 saat santrifüj transfer
7. PBS içinde yeniden süspanse pelet ve 4 ° C'de 100,000 xg'de 1 saat santrifüj
8. Uygun bir tampon içinde süspanse pelet (RNA lizis tamponu).
9. Elektron mikroskopisi ve Western blot analizi için sırasıyla PBS veya RIPA tampon içerisinde yeniden süspanse edin.

2. Bir Modifiye Mirvana miRNA İzolasyon Kiti (~ 1 saat) kullanarak RNA Arıtma

İPUÇLARI

• , Kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın.
satıcıdan protokol sadece miRNA arıtma seçeneği verir de, her zaman ikimiz de aynı örnekten çalışma böylece mRNA olmak üzere toplam RNA izole ve miRNA.
• Bir on-sütunu DNase işleme aşamasına eklenmesi mevcut olabilir DNA izlerini ortadan kaldırır. Exosomes kaynağına bağlı olarak, DNA fare ve insan mast hücresi çizgileri ⁸ aynı kromozomal DNA dizilerinin kültür kardiyomiyositlerde ^18. ortamdan saflaştırılmıştır exosomes tespit edilmiştir dahil olmak üzere bazı kaynaklardan saflaştırılmış exosomes katılmamış olduğu bildirilmiştir.
• Satıcı sadece yeterli bir 700 ul eklenmesi için çözüm 1 yıkayın sağlar çünkü yıkama solüsyonu 1-350 ul (aşağıda Adım 2.4) hacmi azalır. Hacmi azalır değilse tüm kit içeriğini kullanarak için sol yeterli çözüm değildir. Kalan adımları üretici tavsiyelerine göre yapıldı.

1. 1/10 vo ekleme10 dakika boyunca buz üzerinde MiRNA homojeni katkı maddesi (30 ul) ve inkübe lume.
2. Asit-fenol hacmi ile ektraktlayınız: başlangıç ​​lizat hacmi eşit kloroform yer alır. Santrifüj ve yeni bir tüp içinde üst faz kurtarmak.
3. 1.25 hacimleri% 100 etanol (375 ul) ekleyin. Vortex. Kartuş filtre ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj için geçerlidir.
4. Tavsiye hacmi miRNA Yıkama Çözeltisi 1 (350 ul) yarısı ekleyin ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj.
5. Her bir numune için 10 ml DNase 1-70 ul tampon RDD (Qiagen) ekleyin. Sütun 80 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
6. Çözüm 1 yıkayın (350 ul) ve 10,000 x g'de 15 saniye santrifüj ekleyin.
7. Yıkama Çözeltisi ekleme 2/3 (500 ul) ve 10,000 x g'de 15 saniye santrifüj. TEKRAR.
8. 40 ul 95 ile Zehir ° C nükleaz içermeyen H ₂ O
9. RNA konsantrasyonu belirlemek ve 100 ng / ul RNA seyreltin.

3. Bloo gelen Exosomes bir miRNA Profild Taqman Düşük Yoğunluklu Array (TLDA) Kartlar (~ 6.5 saat) kullanarak

İPUÇLARI

• , KKD giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın.
• Ön amplifikasyon (pre-amp) adım 1-350 ng RNA (350-1,000 ng örnekleri cDNA sentezi sonra pre-amp adım gerektirmeyen) için önerilir. Bu eşit koşullar altında tüm örnekler tedavi gerekir çünkü pre-amp da örnek için gerekli olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Pre-amp adım maliyet ekler ve Ct değerleri daha düşük kabul edilebilir bir kesim kapalı (32 yerine 40) var.
• Bu, tek bir gün içinde çalıştırılabilir kart sayısı ile ilgili olarak bir levhası yerine şerit tüpler içinde cDNA reaksiyon hazırlamak için yararlıdır. Bu, aynı gün işleme olmayacak edilen cDNA örnekleri arasında donma-çözülme en aza indirecektir.
• Farklı kaynaklardan toplanan Exosomes yönün varRNA miktarda kira. Bu protokol, cDNA sentezi için reaksiyon için 3 ul RNA şablonu azami izin verir. Kaynağına bağlı olarak, izole edilebilir exosomal RNA miktarı belki de sınırlıdır. Tipik bir doku cDNA, 3 ul hacim içinde 100 ng RNA, insan kanı ya da hücre kültür ortamından exosomes yapılmış olacağı kadar RNA verim olur ise genellikle daha az RNA içeren ve cDNA daha az başlangıç ​​malzemesinden yapılmış olmalıdır. Fare kan exosomes RNA yüksek seviyelerde içeren ve 3 ul içinde, en az 100 ng elde edilebilir.

1. Megaplex Havuzları kullanarak RNA saflaştırılmış cDNA hazırlamak için transkriptaz primer (A Grubu ve B Grubu mikroakışkan kartlarında miRNA'lar için astar içeren Dizi A ve B) tersine, buz üzerinde reaksiyon bileşenleri çözülme.
2. Etiket RT A Grubu astar veya B Grubu astar ile reaksiyona ve grafik için bileşenleri eklemek için iki RNaz ücretsiz 1.5 ml tüpler. 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme veya t tarafından önerilen bir ana karışımı yapmako satıcı.

RT reaksiyon Bileşen	Bileşen Konsantrasyon	1 adet numune için hacmi (toplam V / örnek = 4.5 ul)
Nükleaz içermeyen su		0.20 ul
Megaplex RT tamponu (10x)	1X	0.80 ul
dNTP (100 mM)	4.4 mM	0.20 ul
MgCl2 (25 mm)	5 mM	0.90 ul
RNaz İnhibitör (20U/μl)	2 U	0.10 ul
Megaplex RT Astarlar A veya B (10X)	1X	0.80 ul
Ters Transkriptaz MultiScribe	75 U	1.50 ul

3. Tüpler invert 6 kez ve yüzdekısaca rifuge. Daha sonra, pipet 4,5 MicroAmp içine ul RT reaksiyon karışımı 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plakası.
4. RNA 100 ng ekleyin ve DEPC arıtılmış su ile 3 ul ses seviyesini ayarlamak ya da 3 ul toplam RNA ekleyin, pipet ucu ile karıştırın ve tüpler veya plaka mühür. Kısaca Spin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
5. PCR makineye reaksiyon yükleyin ve (gibi Applied Biosystems Megaplex Havuzları protokolü tarafından önerilir) aşağıdaki koşullar altında çalıştırın:

Sahne	Sıcaklık	Zaman
Çevrim (40x)	16 ° C	2 dakika
	42 ° C	1 dakika
	50 ° C	1 sn
Tutmak	85 ° C	5 dakika
Tutmak	4 ° C	∞

6. -20 ° C'de (en az bir hafta için iyi) cDNA depolamak ya da bir hafta boyunca muhafaza edilebilir ön-ampi adıma devam eder.
7. Buz üzerinde A Grubu ve B Grubu için Preamp astar çözülme ve karıştırmak için ters. Girdap Taqman Pre-Amp ana karıştırın ve buz üzerinde tutmak.
8. 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme şeması takip veya satıcı tarafından önerilen ana karışımı yapmak.

Pre-Amp Reaksiyon Bileşen	1 örnek için ses
Nükleaz içermeyen su	7.5 ul
Taqman Preamp Master Mix (2X)	12.5 ul
Megaplex Preamp Astarlar A veya B (10X)	2.5 ul

9. Pipet 2.5 ul RT süredenct MicroAmp içine 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plaka ve her kuyuya 22.5 ul Preamp reaksiyon karışımı dağıtmak.
10. Buz 5 dk inkübe plaka, mühür ve daha sonra PCR makineye örnek yükleyin. Aşağıdaki koşullar altında çalıştırın.

Sahne	Sıcaklık	Zaman
Tutmak	95 ° C	10 dakika
Tutmak	55 ° C	2 dakika
Tutmak	72 ° C	2 dakika
Çevrim (12x)	95 ° C	15 sn
	60 ° C	4 dk
Tutmak	99.9 ° C	10 dakika
Tutmak	4 ° C	∞

11. Preamp reaksiyon tamamlandıktan sonra, kısa bir süre tüpler veya plaka santrifüj ve sonra her iyi ya da tüp 75 ul 0.1x TE pH 8.0 ekleyin.
12. Seal ve karıştırın ve kısaca döndürün. -20 ° C'de bir hafta seyreltilmiş ürün saklayın veya plaka yüklemek için devam.
13. Buz üzerinde bir RNaz içermeyen 1.5 ml'lik bir tüp içinde, aşağıdaki birleştirin.

Bileşen	1 kart için ses
Taqman Evrensel PCR Master Mix, yok AmpErase UNG (2X)	450 ul
Seyreltilmiş preamp ürün	9 ul
Nükleaz içermeyen su	441 ul

14. Karıştırın ve kısaca santrifüj için tüp ters. Taqman MicroRNA Dizi kart her portuna 100 ul PCR karışımı koyun.
15. 1 dakika boyunca kartı 2 x 1.000 x g'da santrifüj. Kart mühür ve Uygulamalı Biyosistem manuel ve 384 Taqman Düşük Yoğunluklu Array ayarlarında astar birlikte verilen şablonu kullanarak çalıştırın. Biz Uygulamalı Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR sistemi kullanın.

4. Taqman (~ 1.5 saat) ile analiz mRNA

1. QPCR reaksiyon hazırlamak için, grafik sırayla reaksiyon bileşenleri karıştırın. Tüm numuneler normalleştirici gen olarak faiz hem de 18S rRNA geni için astar probları ile analiz edilecektir.

Taqman Reaksiyon Bileşen	1 örnek için ses
Nükleaz içermeyen su	7 ul (bireysel örnek göre ayarlayın)
Taqman Hızlı Master Mix (2X)	10 ul
Taqman Primer sondalar (20x)	1 ul
100 ng RNA, cDNA	2 ve mu, L (tek tek örnek göre ayarlayın)

2. Üreticisi (Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR Sistemi Uygulamalı) tarafından tavsiye edilen hızlı 96-blok kullanarak 96 plaka çalıştırın.

Sonuçlar

Kan ya da hücre kültür ortamından izole exosomes sonra exosomes saflığı elektron mikroskopisi (EM) ve Western Blot (Şekil 1A ve 1B) ile test edilebilir. Biz EM ve birden fazla antikor kullanarak western blot ile çeşitli kaynaklardan bizim exosome hazırlıkları doğruladı. Şekil 1A exosomes ~ çapında 30 -100 nm ile sağlam ve immunogold etiketleme ile CD81 içeren teyit EM görüntüleri gösterir. Yaygın olarak kullanılan exosomal işaretleri Hsp70 ve ...

Tartışmalar

Bu protokol, kan ve kültür ortamından diferansiyel santrifüj saflaştırılmış exosomes gelen miRNA'lar ve mRNA miktarının gösterir. Exosomes kökenlerine bağlı çeşitli bileşenleri ve immün yanıt, antijen sunumu, hücre içi iletişim ve RNA ve protein ^{9,11,12,19,20} devri de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, bir dizi olarak katılıyor. Büyüklüğü ve şekli exosome saflık belirleyici iken EM exosomes veri gösteren bir dizi çalışma, bu veziküller da tespit için kullan?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)	BD Diagnostics	366643	For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)	BD Diagnostics	367841	For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube	BD Diagnostics	762165	For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit	Ambion	AM1561
Acid-Phenol: CHCl3	Ambion	9721G
DNase 1	Qiagen	79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG	Applied Biosystems	4326614	For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0	Applied Biosystems	4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0	Applied Biosystems	4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0	Applied Biosystems	4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0	Applied Biosystems	4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0	Applied Biosystems	4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0	Applied Biosystems	4444913
Taqman MicroRNA RT kit	Applied Biosystems	4366596
Taqman fast universal PCR master mix	Applied Biosystems	4366072	For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe)	Applied Biosystems	Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe)	Applied Biosystems	Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR	Thermo Scientific	K1642	For mRNA
HSP70 antibody	Abcam	ab94368	For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold	Sigma	G7402	For electron microscopy
Rabbit-anti CD81	Sigma	SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.