عزل السائل المخي الشوكي من أجنة القوارض للاستخدام مع إإكسبلنتس مشرح القشرية الدماغية

Summary

السائل المخي الشوكي البطين (CSF) والاستحمام عصبية ظهارية الدماغية القشرية الخلايا الاصلية خلال نمو المخ في وقت مبكر من الجنين. نحن هنا وصف الأسلوب وضعت لعزل CSF البطين من أجنة القوارض من مختلف الأعمار للتحقيق وظيفتها البيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن لدينا تشريح الدماغ يزدرع القشرية وتقنية ثقافة تسمح للنمو يزدرع مع وحدات التخزين أدنى من ثقافة المتوسط ​​أو CSF.

Abstract

وCSF هو السائل معقدة مع بروتيوم متفاوتة خلال مراحل تطوره وحيوي في مرحلة البلوغ. خلال التطور الجنيني، ويفرق CSF الوليدة من السائل الذي يحيط بالجنين عند إغلاق أنبوب للالعصبية الأمامية. CSF حجم يزيد على مدى الأيام اللاحقة ثم والخلايا المبطنة للعصبية ظهارية السلف البطينين والمشيمية الضفيرة CSF تولد. والجنينية للاتصالات CSF قمي سطح البطين، من الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ والحبل الشوكي النامي. CSF يوفر حاسمة ضغط السائل لتوسيع الدماغ النامية وتوزع النمو إلى عوامل هامة لتيسير الخلايا الاصلية العصبية بطريقة محددة زمنيا. للتحقيق في وظيفة CSF، فمن المهم لعزل عينات نقية من التلوث CSF الجنينية دون من الدم أو الأنسجة النامية الدماغ الانتهائي. هنا، نحن تصف تقنية لعزل عينات نقية نسبيا من البطين الجنينية CSF التي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من المقايسات التجريبية بما في ذلك مطياف الكتلة، الكهربي البروتين، والخلية الأولية والثقافة يزدرع. نحن لشرح كيفية تشريح والثقافة إإكسبلنتس القشرية على الأغشية المسامية البولي من أجل أن تنمو الأنسجة القشرية النامية مع وحدات التخزين من وسائل الإعلام أو انخفاض CSF. مع هذا الأسلوب، يمكن إجراء التجارب باستخدام CSF من مختلف الأعمار أو شروط للتحقيق في النشاط البيولوجي للبروتيوم CSF على الخلايا المستهدفة.

Introduction

وCSF هو السائل الذي يغمر في مجمع الظهارة العصبية النامية ^1-6 و يقدم الضروري ⁷ الضغط وتعزيز النمو العظة للدماغ النامية ^8-12. لدراسة CSF على مدى نمو الدماغ، وضعنا تقنيات لعزل CSF البطين من تطوير الفئران أو الماوس الأجنة أثناء مراحل مختلفة من التنمية ^6،9. وشملت الأساليب السابقة من العزلة باستخدام الزجاج الصغيرة إبر وعزل CSF باستخدام محقن الصغير ^1،2. لدينا أسلوب يستخدم الزجاج الصغيرة الشعرية ماصة التي تم سحبها تلميح لإنشاء نقطة متناهية الصغر لاختراق الأنسجة المحسنة. توصيل الزجاج الصغيرة الشعرية ماصة لالشافطة حتى يمكن التحكم CSF أن جمع البطين مع التغيرات في ضغط لطيف. للتحقيق في تأثيرات الخلايا الجذعية من الإشارات CSF، ونحن تشريح إإكسبلنتس القشرية الدماغية، ووضعها على الأغشية البولي، وتطفو بها على مكعب المناسبةlture المتوسطة تستكمل مع عينات CSF ^9. مع هذه التقنية، وحجم خفض من وسائل الإعلام كافية لثقافة الأنسجة، مما يسمح لكفاءة استخدام CSF ^9.

Protocol

1. عزل الجنين / إعداد

ويمكن استخدام هذه التقنية للماوس أو الفئران. في هذا البروتوكول أن نبرهن التقنية وجمع CSF الدماغي تشريح الدماغ مع يزدرع القشرية الجنينية الماوس. سنقوم التعليق على أي اختلافات هامة بالنسبة للفئران مقابل الفئران التي توجد داخل التقنيات العامة. لنظام عمر التدريج الجنينية، كما يصنف E1 يوم قابس بالنسبة للفئران، وأنها مصنفة E0.5 كما في اليوم من المكونات بالنسبة للفئران.

1. إعداد طبق تشريح الدقيقة مع سيليكون إلاستومر Sylgard. يتم توفير Sylgard إلاستومر سيليكون 184 كمكون الجزء السائل اثنين، الجزء A والجزء الجزء B. يتم خلط A B والجزء في نسبة 10:01 من الوزن أو الحجم. بعد خلط المكونات السائلة، صب المطاط الصناعي sylgard في طبق بتري لتغطية كامل سطح الطبق. قد يكون بعض فقاعات الهواء التي تكون موجودة سوف تتبدد أثناء عملية المعالجة. وضع غطاء على طبق بتري والسماح للelastomإيه لعلاج. ويمكن الشفاء من المطاط الصناعي في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة، أو عند ارتفاع درجات الحرارة (على سبيل المثال 37 ° C) لعلاج أسرع مرة واحدة في ترسيخ مكونات السائل، طبق تشريح جاهزة للاستخدام. ويمكن استخدام الطبق مرارا وتكرارا لتجارب متعددة، على أن يتم تنظيفها جيدا بعد هذا الإجراء.
2. إعداد ماصة الشعرية الدقيقة (إبرة). يتم إعداد الدقيقة الشعرية ماصات الحرارة من خلال تطبيق وسحب باستخدام مجتذب Narishige micropipette PC-10 الرأسية مع الإعدادات التالية: واحد سحب الخطوة؛ سخان رقم 2 تعيين إلى 58 و 100 الوزن سحب ز. وقطعت بعناية غيض غرامة من micropipette قبالة باستخدام ملقط غرامة رقم 55. الناتج القطر الداخلي متوسط ​​الإبرة هو 85 ميكرومتر.
3. إعداد الجمعية الشافطة لتطلع CSF. إدراج الغطاس الصغير مع تقديم الدقيقة الشعرية ماصات في إبرة الشعرية. بدلا من ذلك، نعلق مرشح البلاستيكية إلى نهاية الشافطة الجمعية أنبوب متصل ريا ماصة الدقيقة الشعرية. دفع الإبرة من خلال حشية في الموقف على الطرف المقابل للجمعية الشافطة.
4. نقل الأجنة المعزولة من القمامة إلى طبق الدقيقة تشريح أعدت مع Sylgard.
5. إزالة الأغشية الجنينية وخارج الأنسجة بحيث يتعرض الجنين بشكل واضح. كل طبقة الأنسجة والعشرين جدار الرحم وبعد ذلك. الساقط، يمكن تشريح باستخدام مقص قطع القزحية الجميلة (أي أدوات العلوم الجميلة # 15000-02) في كل موقع غرس، أولا جدار الرحم، ومن ثم يمكن للقطعي الساقط موازيا للمحور طويلة من الرحم، ويمكن بعد ذلك يتم فتح شق مزيد باستخدام ملقط غرامة. يمكن إزالة الساقط بعد شق مماثلة، ويعرض الأغشية الجنينية. ينبغي توخي الحذر حتى لا يتم قطعي الأغشية الجنينية أو ثقب.
6. يغسل مع محلول الملح المعقم هانكس المتوازن (HBSS) وإزالة السوائل الزائدة من الجنين المحيطة باستخدام ماصة فضلا عن kimwipe أو التصفيةقطع الورق إلى مثلثات.

2. البطين CSF كوكتيل

1. تصور الجنين تحت المجهر تشريح: للماوس، وينبغي وضع الجنين على جانبها، على ان واحد لديه رأي سهمي للجنين النامي. مع أجنة الفئران E16 أو أكثر، وضع الجنين على العمود الفقري الظهري لها، جنبا إلى جنب بعدها أطول مستو، من الجمجمة إلى الاتجاه الذيلية، كما لو كان الجنين هو الكذب على ظهرها. يمكن بهذه الطريقة يتم جمع السائل النخاعي من البطين الجانبي اليمين واليسار معا.
2. إدراج باطراد ماصة الدقيقة الشعرية إلى البطين الجانبي، البطين الدماغ المتوسط، أو الصهريج الكبير، في محاولة عدم الاتصال الخلايا الظهارية العصبية بمجرد إدراج ماصة. لأجنة الفئران E14.5 أو أكثر، يمكن أن يستنشق السائل النخاعي من البطين الأيمن ثم إزالة الإبرة وإدراجها في البطين الأيسر. بسبب سالكية من البطينين والأنبوب العصبي في الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E14.5، فيوغالبا ما يكون حجم CSF كامل يستنشق من البطينين الوحشي مع الإدراج إبرة واحدة. ومع ذلك، ليس هذا هو الحال دائما مرات التنموية وسالكية من البطينين الاتصال قد تختلف قليلا، وبالتالي، يمكن أيضا ماصة الدقيقة الشعرية إدراجها في ماجنا صهريج لجمع حجم CSF القصوى.
3. مرة واحدة يتم إدراج ماصة الدقيقة الشعرية إلى البطين الجانبي، البطين الدماغ المتوسط، أو الصهريج الكبير، بعناية وبلطف تبدأ الشفط وCSF في ماصة، وذلك باستخدام إما الدقيقة المكبس لخلق ضغط سالب ونضح على CSF، أو من خلال توفير ضغط لطيف السلبية الناجمة عن الفم بحيث يبدأ في التدفق CSF بلطف ماصة في الدقيقة الشعرية بطريقة بطيئة وتسيطر عليها. من المستحسن أن المشاهد يتحقق مع المسؤولين المحلية الخاصة بهم فيما يتعلق بالسياسات المؤسسية على هذه النهج.
4. الاستمرار في تطبيق الضغط السلبي وجمع CSF في الدقيقة ماصة شعري.في أجنة الفئران والجرذان كل من E16.5/E17 أو أصغر سنا، فمن الممكن أن نلاحظ انهيار البطين قليلا من مظهر و divot تتشكل على جانبي الرأس أن ماصة الدقيقة الشعرية هو أقدم. في الأجنة، نظرا لحجم أكبر من الدماغ، فإنه قد لا يكون من الممكن لمراقبة رئيس الانهيار.
5. وقف وإزالة الضغط بلطف ماصة الدقيقة الشعرية من البطين الجانبي.
6. طرد بلطف عينة CSF في أنبوب إيبندورف التي تم برود على الجليد.
7. تواصل جمع القمامة من CSF كاملة من الحيوانات وتجمع العينات في أنبوب واحد.
8. الطرد المركزي في 10000 XG في C ° 4 لمدة 10 دقيقة لإزالة أي خلايا تلويث.
9. تحليل عينات عن أي دلائل على تلوث الخلايا الظهارية العصبية أو خلايا الدم الحمراء. ويشار عادة علامات التلوث السائل تظهر غائما أو أحمر / وردي، أو وجود بيليه مع الدم بقعة يشوبها. بعد الطرد المركزي، وCSويمكن تحليل F مجهريا لأي دليل على الخلايا أو الحطام الخلوية. في حال وجود دلائل على تلوث يتم تجاهل السائل. كعنصر تحكم إضافية، يمكن أيضا أن مضمون بيليه ملطخة للخلايا. ويمكن استخدام عينة CSF نظيفة لزراعة الخلايا، والثقافة القشرية، مطياف، لطخة ويسترن، ELISA، والمقايسات أخرى. وينبغي نقل CSF واضحة لأنبوب إيبندورف العقيمة جديدة. ويمكن الآن أن تستخدم العينة للتحليل، مع تجميع عينات أخرى، أو المفاجئة المجمدة مع النيتروجين السائل وتخزينه في -80 ° C. قد تجميد والذوبان من عينات صغيرة من السائل يؤدي إلى انخفاض الحجم الصغير والتغيرات في تركيز البروتين. ويمكن تجنب ذلك عن طريق تجميد تجفيف العينات.

3. القشرية يزدرع تشريح

1. نقل الجنين E14.5 معزولة عن القمامة على طبق تشريح الدقيقة المعدة من Sylgard.
2. إزالة الجنين من الأغشية الجنينية خارج الأنسجة وكما هو موضح في الخطوة 1.5.
<لى> تغسل مع هانكس عقيمة محلول الملح المتوازن (HBSS) وإزالة السوائل الزائدة من الجنين المحيطة باستخدام ماصة.
3. تشريح عنق الرحم من خلال المنطقة التي تفصل الرأس عن بقية الجنين (الشكل 1A).
4. باستخدام مشرط الجميلة (سكين العيون)، وقطعوا خط الوسط من فروة الرأس. فهم كل جانب من هذا الشق مع ملقط الغرامة وإزالة الجلد. بعد ذلك، استخدم مقص قطع القزحية إلى إجراء شق والتي تمتد على طول خط الوسط من الجمجمة من النامية. في وقت لاحق، وجعل اثنين من الشقوق إضافية، ما يقرب من 1/3 من المسافة من نهايات الأمامي والخلفي من الجمجمة النامية. استخدام ملقط غرامة لفهم "اللوحات" من الجمجمة التي تنتج عن هذا الجزء من تشريح، وإزالة الأنسجة الجمجمة النامية، تعريض القشرة (1B الشكل).
5. باستخدام مشرط تقسم الدماغ على طول خط الوسط في الطائرة منتصف sagital، يفصل بين نصفي الكرة اليمين واليسار القشرية (الأرقام1B، C). يتم ترك الحنون العنكبوتية والتي تعلق على القشرة، وتتم إزالة الجافية مع الجمجمة النامية.
6. إعداد كل نصف الكرة القشرية بشكل منفصل. وضع الجانب الإنسي نصف الكرة حتى تصل تتمكن من رؤية سماحة العقدية والقشرة النامية (أرقام 1C، D).
7. باستخدام مشرط، وجعل شق الاكليلية من خلال الظهارة العصبية القشرية الذيلية لمبة على حاسة الشم النامية. وهذا ينبغي أن تبدأ في شق الحدود الأمامية للالفضيلة العقدية الوحشي والإنسي، وتوسيع نطاق المنطقة من خلال الحزامية الأمامية من رديم والقشرية النامية (الشكل 1E).
8. جعل شق آخر الاكليلية الذيلية فقط من الحدود الخلفي من سماحة والعقدية الجانبية (الشكل 1F). وهذا ينبغي أن يشمل أيضا شق من الحدود الجانبية للسماحة العقدية على الجدار الإنسي من رديم والقشرية النامية.
9. التراجع عن القشرية "رفرف" CREA تيد من قبل شقوق توصلا في الخطوات 3.7 و 3.8، باستخدام مشرط أو ضغط لطيف من تيار من HBSS تسليمها مع 200 ميكرولتر pipettor لتجنب الأضرار الميكانيكية لقشرة. ثم جعل شق عرضية على طول الحدود التي تفصل بين عقدي سماحة الجانبية من القشرة النامية (أرقام 1G، H). ثم، تشريح بعيدا قرن آمون النامية وتنحنح القشرية من الدماغ الانتهائي الإنسي، في ذروة القشرة المخية الحديثة حيث السطح الجانبي القشرية تجتمع الجدار بين نصفي المخ.
10. جعل شق عرضية على طول الحدود التي تفصل بين عقدي سماحة الجانبية من القشرة النامية (الشكل 1H).
11. إزالة أي نوع من الأنسجة الإضافية تشريح موجود على لوحة Sylgard من يزدرع في تشريح القشرية. يمكن للمرء أن استخدام pipetting لطيف مع العازلة HBSS جديدة لماصة بعيدا أي نوع من الأنسجة الإضافية تشريح. القشرة تشريح الآن مع الجانب سحائي أسفل (الشكل 1I).

SS = "jove_title"> 4. نقل من يزدرع القشرية

1. إعداد حلقة سلك البلاتين متصلة ماصة الزجاج. تسخين الزجاج ماصة مع سلك البلاتين مطوية إدراجها في نهاية ماصة الزجاج. من التواء في نهاية حلقة البلاتين الأسلاك، ويمكن زيادة حجم الحلقة أو ينقص، ويمكن أن تكون على شكل حلقة لتناسب حجم يزدرع المطلوب. (يمكن إعداد هذا مسبقا وإعادة استخدامها.)
2. تسخين نهاية السلك البلاتين لتعقيم الحلقة.
3. عزل يزدرع تشريح القشرية وإزالة وسائل الإعلام من قبل pipetting HBSS اضافية لطيف، وترك كمية صغيرة للاستخدام مع حلقة السلك.
4. وضع غشاء البولي (أ) 1 سم في طبق قطره 4 سم التصوير.
5. باستخدام جانب من البلاتين حلقة الأسلاك، والوجه بلطف القشرة بحيث الجانب السحائي يكون مواجها لها.
6. رفع يزدرع القشرية قبالة طبق تشريح، عن طريق وضع يزدرع في منتصف الحلقة واستخدام قوات الهيدروستاتيكي الجوهرية لرفع يزدرع على متن طائرة مسطحة.
7. وضع بلطف يزدرع على الغشاء البولي، ورفع الأسلاك حلقة البلاتين بعيدا بحيث يبقى يزدرع على الغشاء على متن طائرة مسطحة مع سطح البطين إجراء اتصالات مع الغشاء.
8. رفع بلطف الغشاء وماصة 50 ميكرولتر من CSF أو وسائط أخرى تحت الغشاء.
9. تغطية صحن التصوير، وضعه في حاوية ثانوية مرطب، واحتضان في C ° 37 في 5٪ CO ₂ ل24 ساعة لدعم استمرار تكاثر الخلايا والنمو يزدرع. الشكل 2 يصور التخطيطي للإعداد النهائي القشرية يزدرع الطبق.

النتائج

وينبغي جمع CSF تسفر عن واضحة، شفافة السائل. ينبغي أن يكون هناك أي دليل على التلوث من الدم، كما يتضح من السائل الأحمر أو الأصفر المشوب في الرشفة وإيبندورف في أنبوب. يجب أن يكون هناك أيضا أي دليل على الأنسجة في الرشفة وأنبوب إيبندورف. عندما يتم طرد السائل النخاعي، يمكن لل?...

Discussion

وقد أسفرت الطريقة الموضحة لجمع عينات CSF البطين نقية نسبيا من CSF الجنينية مع تكوين البروتين مستقرة والنشاط المستمر في عدد من المقايسات الخلوية ^9. مع تقنية جمع القمامة وحجم جيدة من عشرة E14.5 الفئران، ويمكن للمرء أن يتوقع لجمع 10-15 ميكرولتر من CSF، ومن القمامة من الفئرا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / المواد	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
Wiretrop II الإبر الشعرية	دروموند العلمية	# 5-000-2020
Sylgard	لاصقات ألسويرث	# 184 SIL المرانة عدة
الشافطة أنبوب الجمعية	سيجما	# A5177-5EA
يمكن التخلص منها تصفية	بخاخ أو الصيدلية المحلية	غير متوفرة	معيار فلتر السجائر
Roundstock سكين البصريات (15 طعنة سكين درجة)	العالم آلات دقيقة، وشركة	# 500250
35MM طبق زجاج الثقافة القاع	شركة ماتيك	# P35G-1.5-14-C
سلك البلاتين إيريديوم	البحث Tritech	# PT-9010-010-3FT
Nuclepore المسار غشاء-إحفر	WHATMAN	# 09-300-57
هانكس المتوازن محلول الملح	فيشر العلمية	# SH30031.FS
قطع القزحية مقص	أدوات العلوم الجميلة	# 15000-02