Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l'uso con sezionato espianti cerebrali corticali

Riepilogo

Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell'embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi di terreno di coltura o nel liquido cerebrospinale.

Abstract

Il QCS è un fluido complesso con una proteoma varia dinamicamente durante tutto lo sviluppo e in età adulta. Durante lo sviluppo embrionale, il QCS nascente differenzia dal liquido amniotico alla chiusura del tubo neurale anteriore. Volume di CSF aumenta poi nei giorni successivi, come le cellule progenitrici neuroepiteliale che rivestono i ventricoli e del plesso coroide generate CSF. I contatti embrionali CSF apicale, superficie ventricolare delle cellule staminali neurali del cervello in via di sviluppo e il midollo spinale. CSF fornisce la pressione del fluido cruciale per l'espansione del cervello sviluppo e distribuisce crescita importante promuovere fattori di cellule progenitrici neurali temporalmente in un modo specifico. Per studiare la funzione del CSF, è importante isolare campioni puri di embrionale CSF senza contaminazione da sangue o tessuto telencephalic sviluppo. Qui, si descrive una tecnica per isolare campioni relativamente puri ventricolare embrionale CSF che possono essere utilizzati perun'ampia gamma di saggi sperimentali compresi spettrometria di massa, elettroforesi proteica, e coltura di cellule e espianto primaria. Dimostriamo come sezionare e cultura espianti corticali su membrane porose in policarbonato per crescere sviluppo del tessuto corticale con ridotti volumi di supporto o nel liquido cerebrospinale. Con questo metodo, gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando CSF ​​da varie età o condizioni per studiare l'attività biologica del proteoma CSF sulle cellule bersaglio.

Introduzione

Il QCS è un fluido complesso che bagna la neuroepitelio sviluppo ^1-6 e offre ⁷ essenziali pressione e promuovere la crescita spunti per lo sviluppo del cervello ^8-12. Per studiare il QCS nel corso dello sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato tecniche per isolare liquor ventricolare di sviluppare embrioni di ratto o il mouse durante le varie fasi di sviluppo ^6,9. Metodi precedenti di isolamento incluso con una lente di micro-ago e isolamento del QCS con un micro-iniettore ^1,2. Il nostro metodo utilizza un micro-capillare pipetta di vetro la cui punta è stato tirato per creare un punto ultrafine per la penetrazione nel tessuto migliore. Il micro-capillare pipetta di vetro è collegato ad un aspiratore modo che la raccolta liquor ventricolare può essere controllato con cambiamenti nella pressione dolci. Per studiare l'influenza delle cellule staminali di segnali CSF, si sezionare cerebrali corticali espianti, disporle su membrane in policarbonato, e galleggiare li cu appropriatemedia lture integrato con campioni di CSF ^9. Con questa tecnica, ridotti volumi di supporti sono sufficienti per la coltura tissutale, consentendo un uso efficiente di CSF ^9.

Protocollo

1. Embryo Isolamento / Preparazione

Questa tecnica può essere utilizzata per topo o ratto. In questo protocollo si dimostra la tecnica di raccolta QCS e cerebrale dissezione espianto corticale con cervello di topo embrionale. Ci osservazioni su eventuali differenze importanti rispetto a ratti topi che esistono all'interno delle tecniche generali. Per il sistema embrionale stadiazione età, E1 è classificato come il giorno della spina di ratti, e E0.5 è classificato come il giorno della spina di topi.

1. Preparare un micro-dissezione piatto con elastomero Sylgard silicone. Sylgard 184 elastomero di silicone viene fornito come parte liquida a due componenti, parte A e parte B. Parte sono mescolati A e B parte in un rapporto di 10:1 in peso o volume. Dopo che i componenti liquidi vengono miscelati, versa l'elastomero Sylgard in una piastra di Petri a coprire l'intera superficie del piatto. Alcune bolle d'aria possono essere presenti che dissipare durante il processo di polimerizzazione. Mettere il coperchio sulla piastra di Petri e lasciare che il elastomer per curare. L'elastomero può essere indurita a temperatura ambiente per 24 ore, oppure a temperature più elevate (per esempio 37 ° C) per una più rapida polimerizzazione. Una volta che i componenti liquidi solidificano, il piatto dissezione è pronto all'uso. Il piatto può essere usato ripetutamente per esperimenti multipli, a condizione che sia ben pulita dopo la procedura.
2. Preparazione del micro-pipetta capillare (ago). Micro-pipette capillari vengono preparati mediante l'applicazione di calore e tirare con un PC-10 verticale estrattore micropipetta Narishige con le seguenti impostazioni: Un tiro passo; Heater # 2 impostato a 58, 100 g di peso tiro. La punta fine della micropipetta è attentamente spense con pregiati N ° 55 pinze. Il risultante diametro medio interno della cannula è 85 micron.
3. Preparare il gruppo aspiratore per l'aspirazione CSF. Inserire micro-stantuffo provvista di micro-pipette capillari nell'ago capillare. In alternativa, collegare un filtro di plastica monouso per la fine del gruppo del tubo aspiratore che è collegato to la micro-pipetta capillare. Spingere l'ago attraverso la guarnizione in posizione sul lato opposto del gruppo aspiratore.
4. Trasferimento di embrioni isolati dalla cucciolata di un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard.
5. Togliere le membrane extra-embrionali e tessuti in modo che l'embrione è chiaramente esposta. Ogni strato di tessuto-prima la parete uterina e quindi la decidua, può essere sezionato con le forbici iridectomia fini (ad esempio strumenti per le scienze Belle # 15000-02). Ad ogni sito di impianto, la prima parete uterina, quindi la decidua può essere incisi parallelamente all'asse lungo dell'utero, e l'incisione può essere aperto ulteriormente utilizzando una pinza sottile. La decidua può essere rimosso dopo un'incisione simile, esponendo le membrane fetali. Si deve essere esercitato in modo che le membrane fetali non sono incise o perforato.
6. Lavare con soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta e un Kimwipe o filtrocarta tagliata in triangoli.

2. Collezione ventricolare CSF

1. Visualizzare embrione al microscopio dissezione: per mouse, l'embrione deve essere che sul suo lato, in modo tale che si ha una vista sagittale dell'embrione. Con embrioni di ratto E16 o più, posizionare l'embrione sulla sua colonna vertebrale dorsale, lungo il suo dimensione planare, da un cranio in direzione caudale, come se l'embrione è sdraiato sulla schiena. In questo modo il CSF può essere raccolto sia da destra e sinistra ventricolo laterale.
2. Costantemente inserire la micro-pipetta capillare nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, tentando di non contattare le cellule neuroepiteliali volta la pipetta è stata inserita. Per E14.5 embrioni di topo o più, il CSF può essere aspirato dal ventricolo destro e quindi l'ago rimosso e inserito nel ventricolo sinistro. A causa della pervietà dei ventricoli e il tubo neurale in embrioni più giovane di E14.5, ilintero volume del CSF può spesso essere aspirato dai ventricoli laterali con l'inserimento di un ago singolo. Tuttavia, questo non è sempre il caso come tempi di sviluppo e la pervietà dei ventricoli collegamento può variare leggermente, e quindi, il micro-pipetta capillare può anche essere inserita nella cisterna magna per raccogliere il massimo volume CSF.
3. Una volta che il micro-pipetta capillare viene inserita nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, attenzione e delicatezza iniziare l'aspirazione del CSF nella pipetta, utilizzando il micro-stantuffo per creare pressione negativa e aspirare il CSF, o fornendo una leggera pressione negativa creata per via orale in modo tale che CSF inizia a fluire dolcemente nel micro-pipetta capillare in modo lento e controllato. Si raccomanda che lo spettatore controlla con propri funzionari locali in materia di politiche istituzionali di questi approcci.
4. Continuare ad applicare pressione negativa e raccogliere il liquor nella micro-capillare pipetta.In entrambi embrioni di topo e ratto di E16.5/E17 o più giovane, è possibile osservare il collasso ventricolo leggermente dalla comparsa di un divot formando sul lato della testa che il micro-pipetta capillare è dentro In anziane embrioni, a causa della maggiore dimensione del cervello, potrebbe non essere possibile osservare la testa collasso.
5. Interrompere l'applicazione di pressione e rimuovere delicatamente la micro-capillare pipetta dal ventricolo laterale.
6. Delicatamente espellere il campione CSF in una provetta Eppendorf che è stata raffreddata su ghiaccio.
7. Continua la raccolta del QCS da una intera cucciolata di animali e in comune i campioni nel tubo stesso.
8. Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C per 10 minuti per eliminare cellule contaminanti.
9. Analizzare i campioni per eventuali segni di contaminazione cellule neuroepiteliali o globuli rossi. I segni di contaminazione sono di solito indicati dal fluido che appare torbida o rosso / rosa, o la presenza di un pellet con una macchia di sangue tinta. Dopo centrifugazione, il CSF possono essere esaminate al microscopio per le prove di cellule o detriti cellulari. Se ci sono segni di contaminazione del fluido deve essere eliminato. Come controllo aggiuntivo, il contenuto di pellet possono essere colorati per cellule. Un campione pulito CSF ​​può essere usato per la coltura cellulare, cultura corticale, spettrometria, western blot, ELISA, saggi e altri. Il QCS chiara dovrebbe essere trasferito in una nuova provetta sterile Eppendorf. Il campione può essere utilizzato per l'analisi, in pool con altri campioni o SNAP congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il congelamento e lo scongelamento di piccoli campioni di fluido può provocare una diminuzione piccolo volume e cambiamenti nella concentrazione di proteina. Ciò può essere evitato liofilizzazione dei campioni.

3. Espianto Dissection corticale

1. Trasferire la E14.5 embrione isolato dalla cucciolata su un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard.
2. Rimuovere embrione da membrane extra-embrionali e tessuti, come descritto al punto 1.5.
3. lavaggio con soluzione sterile salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta.
4. Sezionare attraverso la regione cervicale separa la testa dal resto dell'embrione (Figura 1A).
5. Usando un bel bisturi (bisturi oftalmico), tagliare lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Afferrare entrambi i lati di questa incisione con una pinza sottile e togliere la pelle. Successivamente, usare le forbici iridectomia per fare un'incisione che corre la lunghezza della linea mediana del cranio in via di sviluppo. Successivamente, fare due incisioni aggiuntivi, circa 1/3 della distanza fra le estremità anteriore e posteriore del cranio sviluppo. Utilizzare una pinza sottile di cogliere i "lembi" del cranio che derivano da questa parte della dissezione, e rimuovere il tessuto in via di sviluppo cranio, esponendo la corteccia (Figura 1B).
6. Utilizzo del bisect bisturi il cervello lungo la linea mediana a metà piano sagittale, che separa gli emisferi destro e sinistro corticali (figure1B, C). La pia e aracnoide sono lasciati aderenti alla corteccia, e la dura madre viene rimosso insieme con il cranio in via di sviluppo.
7. Preparare ogni emisfero corticale separatamente. Posizionare il lato mediale dell'emisfero in modo che si può vedere l'eminenza gangliare e la corteccia in via di sviluppo (figure 1 C, D).
8. Utilizzando il bisturi, fare una incisione coronale attraverso il neuroepitelio corticale caudale al bulbo olfattivo in via di sviluppo. Questa incisione dovrebbe iniziare al confine anteriore delle eminenze ganglionari mediale e laterale, e si estendono attraverso la regione cingolata anteriore del rudimento di sviluppo corticale (Figura 1E).
9. Fai un'altra incisione coronale appena caudalmente al confine posteriore dell'eminenza gangliare laterale (Figura 1F). Questa incisione dovrebbe estendersi anche dal limite laterale della eminenza gangliare alla parete mediale del rudimento di sviluppo corticale.
10. Ritrarre la corticale crea "flap"ta dalle due incisioni fatte a passi 3,7 e 3,8, con una leggera pressione bisturi o da un flusso di HBSS consegnati con una pipetta 200 pl per evitare danni meccanici alla corteccia. Poi fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l'eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figure 1G, H). Poi, sezionare via di sviluppo e l'ippocampo orlo corticale del telencefalo mediale, all'apice della neocorteccia dove la superficie laterale e parete corticale interemisferica.
11. Fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l'eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figura 1H).
12. Rimuovere qualsiasi tessuto sezionato supplementare che è sul piatto Sylgard dal espianto sezionato corticale. Si può usare pipettaggio gentile con tampone HBSS fresco per pipettare via qualsiasi tessuto sezionato in più. La corteccia è sezionato con il lato rivolto verso il basso meningea (Figura 1I).

4. Trasferimento di Espianto corticale

1. Preparare un anello di filo di platino collegato ad una pipetta di vetro. Riscaldare la pipetta di vetro con un filo di platino ripiegato inserito nell'estremità della pipetta di vetro. Ruotando la fine del ciclo filo di platino, la dimensione del ciclo può essere aumentato o diminuito, e il ciclo può essere sagomato per adattarsi alle dimensioni del espianto desiderato. (Questo può essere preparato in anticipo e riutilizzati.)
2. Riscaldare l'estremità del filo di platino per sterilizzare il loop.
3. Isolare l'espianto sezionato corticale e rimuovere il supporto HBSS supplementari pipettando dolce, lasciando una piccola quantità da utilizzare con il gancio di metallo.
4. Inserire un centimetro 1 membrana in policarbonato in un piatto di 4 cm di diametro di imaging.
5. Utilizzando il lato del cappio di filo di platino, capovolgere delicatamente la corteccia in modo che il lato rivolto verso l'alto meningea.
6. Sollevare l'espianto corticale fuori del piatto dissezione, ponendo l'espianto a metà del ciclo e con le forze idrostatiche intrinsecisollevare l'espianto su una superficie piana.
7. Delicatamente il espianto sulla membrana di policarbonato, e sollevare l'anello del filo di platino distanza tale che l'espianto rimane sulla membrana in piano con la superficie ventricolare fare contatto con la membrana.
8. Sollevare delicatamente la membrana e pipettare 50 pl di CSF o altri mezzi di comunicazione sotto la membrana.
9. Coprire il piatto di imaging, collocarlo in un contenitore umidificato secondaria, e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ per 24 ore a sostenere continua proliferazione cellulare e la crescita espianto. Figura 2 rappresenta uno schema della preparazione finale corticale piatto espianto.

Risultati

La raccolta CSF dovrebbe produrre un chiaro, fluido trasparente. Non ci dovrebbero essere tracce di contaminazione da sangue, come dimostrato da un fluido tinta rosso o giallo nell'aspirato e nel tubo Eppendorf. Ci dovrebbe anche essere alcuna prova di tessuto in aspirazione e il tubo Eppendorf. Quando il CSF viene centrifugata, si può anche valutare la CSF microscopicamente per garantire che non vi è alcuna contaminazione. Se ci sono segni di contaminazione, il QCS deve essere eliminata. Da una cucciolata E14.5 i...

Discussione

Il metodo descritto per la raccolta ventricolare CSF ha prodotto campioni relativamente puri embrionale CSF con composizione proteica stabile e consistente attività in un certo numero di saggi cellulari ^9. Con una tecnica buona raccolta e la prole di dieci E14.5 topi, ci si può aspettare di raccogliere 10-15 ml di CSF, e da una cucciolata di ratti E16, si può aspettare di raccogliere circa 50-90 ml di liquido cerebrospinale. Questa tecnica di raccolta minimizza la contaminazione da sangue e dei tessuti, at...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Wiretrop II aghi capillari	Drummond scientifico	# 5-000-2020
Sylgard	Adesivi Ellsworth	N ° 184 SIL ELAST kit
Aspiratore gruppo del tubo	Sigma	# A5177-5EA
Filtro usa e getta	Venturi o farmacia locale	non disponibile	Sigaretta filtro standard
Roundstock coltello oftalmico (15 coltello stab grado)	Mondo Strumenti di precisione, Inc.	# 500250
35 millimetri di vetro a fondo piatto di cultura	MatTek Corp.	# P35G-1.5-14-C
Platino-iridio filo	Tritech ricerca	# PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch membrana	Whatman	# 09-300-57
Hanks soluzione salina bilanciata	Fisher Scientific	# SH30031.FS
Iridectomia Forbici	Strumenti Scienza Belle	# 15000-02