Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

Zusammenfassung

Kammerunterstützungsgerät Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) taucht die neuroepithelialen und zerebralen Kortex Vorläuferzellen während der frühen Entwicklung des Gehirns im Embryo. Hier beschreiben wir die Methode entwickelt, um ventrikuläre CSF aus Nagetier Embryonen unterschiedlichen Alters zu isolieren, um seine biologische Funktion untersucht. Darüber hinaus zeigen wir unsere zerebralen Kortex Explantat Dissektion und Kultur Technik, die für Explantat Wachstum ermöglicht mit minimalem Volumen von Kulturmedium oder CSF.

Zusammenfassung

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit mit einer sich dynamisch ändernden Proteom während der Entwicklung und im Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung unterscheidet der naszierenden CSF aus dem Fruchtwasser bei Schließen des vorderen Neuralrohr. CSF Volumen steigt dann über den folgenden Tagen als neuroepithelialen Vorläuferzellen entlang der Herzkammern und die Plexus generate CSF. Die embryonalen CSF Kontakte der apikale, ventrikuläre Oberfläche der neuralen Stammzellen des sich entwickelnden Gehirns und des Rückenmarks. CSF bietet entscheidende Flüssigkeitsdruck für den Ausbau des sich entwickelnden Gehirns und vertreibt wichtige wachstumsfördernde Faktoren auf neurale Vorläuferzellen in einem zeitlich-spezifische Weise. Um die Funktion der CSF zu untersuchen, ist es wichtig, reine Proben von embryonalen CSF ohne Kontamination aus Blut oder der Entwicklungswalze telencephalen Gewebe isolieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um relativ reine Proben von ventrikulären embryonalen CSF, die verwendet werden kann für isoliereneine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie Massenspektrometrie, Protein-Elektrophorese und der Zelle und primären Explantatkultur. Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur kortikalen Explantate auf porösen Polycarbonatmembranen um die Entwicklung kortikalen Gewebe mit reduzierten Volumina von Medien oder CSF wachsen. Mit diesem Verfahren kann unter Verwendung von Experimenten CSF aus unterschiedlichen Alters oder Bedingungen, um die biologische Aktivität des CSF Proteom auf Zielzellen zu untersuchen.

Einleitung

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit, die die Entwicklung Neuroepithel ^1-6 badet und liefert wesentliche Druck ⁷ und wachstumsfördernde Signale für das sich entwickelnde Gehirn ^8-12. Die CSF im Laufe der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen, haben wir Techniken Ventrikelliquor aus Entwicklungs Ratte oder Maus-Embryonen isolieren während verschiedenen Stadien der Entwicklung ^6,9. Bisherige Methoden der Isolation aufgenommen mit einem Glas Mikro-Nadel und Isolierung der CSF mit einem Mikro-Injektor ^1,2. Unsere Methode nutzt ein Glas Mikro-Kapillarpipette deren Spitze wurde gezogen, um eine ultrafeine für verbesserte Eindringen in das Gewebe zu schaffen. Das Glas Mikrokapillare Pipette ist an ein Sauggebläse angeschlossen, so dass Ventrikelliquor Sammlung unter leichtem Druckänderungen gesteuert werden kann. Um die Stammzellen Einflüsse von CSF-Signale zu untersuchen, zerlegen wir zerebralen kortikalen Explantaten, legen Sie sie auf Polycarbonat Membranen und schweben sie über geeignete culture Medium mit CSF Proben ⁹ ergänzt. Mit dieser Technik sind geringere Mengen von Medien ausreichend ist, um das Gewebe Kultur, so dass für eine effiziente Verwendung von CSF ^9.

Protokoll

Ein. Embryo Isolation / der Zubereitung

Diese Technik kann für Maus oder Ratte verwendet werden. In diesem Protokoll demonstrieren wir die CSF Sammlung Technik und zerebralen Kortex Explantat Dissektion mit embryonalen Gehirn. Wir werden auf alle wichtige Unterschiede für Ratten im Vergleich zu Mäusen, die im Rahmen der allgemeinen Techniken existieren kommentieren. Für die embryonalen Alter Staging-System, ist E1 als der Tag des Steckers für Ratten klassifiziert und E0.5 wird als Tag des Steckers für Mäuse eingestuft.

1. Bereiten Sie eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard Silikon-Elastomer. Sylgard 184 Silikon-Elastomer wird als zweiteilige flüssige Komponente, Teil A und Teil B. Teil A und Teil B in einem Verhältnis von 10:1 nach Gewicht oder Volumen gemischt werden mitgeliefert. Nachdem die Flüssigkeitskomponenten gemischt werden, gießen die Sylgard Elastomers in einer Petrischale, die gesamte Oberfläche der Schale abzudecken. Einige Luftblasen vorliegen können, die während der Aushärtung zu zerstreuen werden. Legen Sie die Petrischale Deckel auf und lassen Sie die Elastomereer zu heilen. Das Elastomer kann bei Raumtemperatur für 24 Stunden gehärtet werden, oder bei höheren Temperaturen (zB 37 ° C) für eine schnellere Aushärtung. Sobald die flüssigen Bestandteile zu verfestigen, ist die Dissektion Gericht einsatzbereit. Die Schale kann wiederholt für mehrere Experimente verwendet werden, vorausgesetzt, es wird auch nach der Verfahrensweise gereinigt.
2. Herstellung der Mikrokapillare Pipette (Nadel). Micro-Kapillar-Pipetten werden durch Anwendung von Hitze zubereitet und ziehen mit einem Narishige PC-10 vertikale Feinpipettenziehvorrichtung mit den folgenden Einstellungen: Ein Schritt Pull; Heater # 2 auf 58, 100 g Abzugsgewicht. Die feine Spitze der Mikropipette wird sorgfältig off mit feinen Nr. 55 Zangen gerissen. Die resultierende durchschnittliche Innendurchmesser der Nadel 85 um.
3. Bereiten Sie den Sauger Baugruppe für CSF Aspiration. Legen Mikro-Stempel versehen mit Mikro-Kapillaren in die Kapillare Nadel. Alternativ beifügen Kunststoff-Einweg-Filter am Ende der Saugvorrichtung Tubusbaugruppe, die t verbunden isto die Mikrokapillare Pipette. Schieben der Nadel durch die Dichtung in Position am gegenüberliegenden Ende des Aspirators Montage.
4. Übertragen Embryo isoliert von der Streu zu einer Mikrodissektion Schale mit Sylgard hergestellt.
5. Entfernen Sie die extra-embryonalen Membranen und Geweben, so dass der Embryo deutlich ausgesetzt ist. Jedes Gewebe Schicht zuerst die Gebärmutterwand und dann die decidua-kann seziert mit feinen Iridektomie Schere (dh Fine Science Tools # 15000-02) werden. An jedem Implantationsstelle zunächst der Gebärmutterwand, dann die decidua kann parallel zu der langen Achse des Uterus eingeschnitten werden soll, und der Schnitt kann dann weiter geöffnet werden mit feinen Pinzetten. Die Decidua kann nach einem ähnlichen Schnitt entfernt werden, Freilegung der Fruchtblase. Vorsicht ist geboten, so dass die Fruchtblase nicht eingeschnitten oder durchstochen werden.
6. Waschen mit steriler Hanks balanced salt solution (HBSS) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem umliegenden Embryos mit einer Pipette sowie einen Kimwipe oder FilterPapier geschnitten in Dreiecke.

2. Ventrikelliquor Sammlung

1. Visualisieren Embryo unter dem Dissektionsmikroskop: für Maus, der Embryo sollte auf seiner Seite vorgesehenen Ablagefläche ist, so dass man eine sagittale Ansicht des sich entwickelnden Embryos aufweist. Mit Rattenembryonen E16 oder älteren, Positionieren des Embryos auf seiner dorsalen Wirbelsäule entlang seiner längsten planaren Dimension von einer kranial nach kaudal Richtung, als wenn der Embryo auf dem Rücken liegt. Auf diese Weise kann der Liquor von beiden rechten und linken lateralen Ventrikel gesammelt werden.
2. Kontinuierlich einsetzen Mikrokapillare Pipette in den lateralen Ventrikel, mesencephalicus Herzkammer oder cisterna magna, versucht nicht, die Neuroepithelzellen kontaktieren, sobald der Pipette eingesetzt ist. Für E14.5 Maus-Embryonen oder älter, kann der Liquor aus der rechten Herzkammer abgesaugt werden und anschließend die Nadel entnommen und in den linken Ventrikel. Wegen der Durchgängigkeit der Ventrikel und dem Neuralrohr in Embryonen jünger als E14.5, diegesamte CSF Lautstärke kann oft aus der Seitenventrikel mit einem einzigen Nadeleinführung abgesaugt werden. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da Zeiten und Entwicklungsstörungen Durchgängigkeit der Verbindung Ventrikel leicht variieren kann, und daher kann die Mikrokapillare Pipette kann auch in die Zisterne magna eingefügt werden, um die maximale Volumen CSF sammeln.
3. Sobald die Mikrokapillare Pipette in den lateralen Ventrikel, mesencephalicus Herzkammer oder cisterna magna eingesetzt ist, sorgfältig und schonend beginnt Ansaugen der CSF in die Pipette, wobei entweder die Mikro-Kolben einen Unterdruck erzeugen und saugt den CSF, oder durch Bereitstellen eines sanften Unterdruck durch den Mund, so dass CSF sanft in die Mikro-Kapillarpipette in einem langsamen und kontrollierten Art und Weise zu fließen beginnt erstellt. Wir empfehlen, dass der Betrachter mit ihren eigenen lokalen Beamten in Bezug auf institutionelle Politik auf diesen Ansätzen überprüft.
4. Weiterhin negativen Druck auszuüben und sammeln die CSF in der Mikro-Kapillarpipette.In beiden Maus und Ratte Embryonen von E16.5/E17 oder jünger ist es möglich, den Ventrikel Zusammenbruch leicht beobachten durch das Auftreten eines Divot Bilden, auf der Seite des Kopfes, dass die Mikro-Kapillarpipette in. ist In älteren Embryonen, wegen der größeren Größe des Gehirns, kann es nicht möglich sein, den Kopf zu beobachten kollabieren.
5. Stoppen Sie Druck und entfernen Sie vorsichtig die Mikrokapillare Pipette aus der Seitenventrikel.
6. Gently Vertreibung der CSF Probe in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis wurde gekühlt.
7. Sammeln Sie weiter die CSF aus einem ganzen Wurf von Tieren und bündeln die Proben in das gleiche Rohr.
8. Zentrifugieren bei 10000 × g bei 4 ° C für 10 min, um alle kontaminierenden Zellen zu entfernen.
9. Analyse der Proben auf Anzeichen von kontaminierenden Neuroepithelzellen oder roten Blutzellen. Anzeichen von Verunreinigungen werden in der Regel durch das Fluid auftretenden trüb oder rot / rosa, oder die Anwesenheit eines Pellets mit einem Blut gefärbte Fleck angedeutet. Nach Zentrifugation der CSF kann mikroskopisch auf Anzeichen von Zellen oder Zelltrümmer analysiert werden. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind die Flüssigkeit sollte verworfen werden. Als zusätzliche Kontrolle kann das Pellet Inhalt auch für Zellen gefärbt werden. Ein sauberer CSF-Probe kann für eine Zellkultur, kortikale Kultur, Spektrometrie, Western-Blot, ELISA, und andere Assays verwendet werden. Die klare CSF sollte ein neues steriles Eppendorf-Röhrchen überführt werden. Die Probe kann nun zur Analyse verwendet werden, mit anderen gepoolten Proben oder Schnappverbindung mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Das Einfrieren und Auftauen von kleinen Proben von Fluid kann in einem kleinen Volumen Abnahme und Veränderungen in Proteinkonzentration führen. Dies kann durch Gefriertrocknen die Proben vermieden werden.

3. Kortikale Explantation Dissection

1. Übertragen Sie die E14.5 Embryos aus dem Wurf auf eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard vorbereitet isoliert.
2. Entfernen Embryo aus extra-embryonalen Membranen und Geweben wie in Schritt 1.5 beschrieben.
3. Wash mit steriler Hanks balanced salt solution (HBSS) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem umliegenden Embryos mit einer Pipette.
4. Sezieren durch den Halsbereich Abtrennen des Kopfes von dem Rest des Embryos (Abb. 1A).
5. Mit einem feinen Skalpell (Augenheilkunde Messer), reduzieren die Mittellinie der Kopfhaut. Fassen Sie jede Seite diesen Einschnitt mit feinen Pinzetten und entfernen Sie die Haut. Als Nächstes verwenden Iridektomie Schere einen Einschnitt, der die Länge der Mittellinie der Entwicklungsländer Schädels verläuft machen. Anschließend stellen zwei weitere Einschnitte, etwa 1/3 des Abstands von der vorderen und hinteren Enden der Entwicklungswalze Schädel. Verwenden feinen Pinzette, um die "Klappen" des Schädels zu begreifen, die sich aus diesem Teil der Dissektion, und entfernen Sie die Entwicklung von Schädel Gewebe, Aussetzen des Kortex (Abbildung 1B).
6. Mit dem Skalpell bisect das Gehirn entlang der Mittellinie in der Mitte der Sagittalebene, die Trennung der rechten und linken kortikalen Hemisphären (Figures1B, C). Die Pia und Arachnoidea sind links an dem Cortex und die Dura wird zusammen mit der Entwicklung von Schädel entfernt.
7. Bereiten Sie jede kortikale Hemisphäre getrennt. Legen Sie die Hemisphäre medialen Seite nach oben, so dass Sie die Ganglien Eminenz und die Entwicklung von Cortex (1C, D) zu sehen.
8. Mit dem Skalpell einen koronalen Schnitt durch die kortikalen Neuroepithel kaudal der Entwicklung Riechkolben. Dieser Schnitt sollte am vorderen Rand der lateralen und medialen ganglionären Eminenzen beginnen, und erstrecken sich durch den vorderen Bereich des cingulären entwickeln kortikalen Rudiment (1E).
9. Machen Sie eine weitere koronalen Schnitt nur kaudal der hintere Begrenzung der seitlichen ganglionic eminence (1F). Dieser Einschnitt sollte auch von der seitlichen Begrenzung des ganglionären Eminentia erstrecken zur medialen Wand der Entwicklungseinheit kortikalen Rudiment.
10. Ziehen Sie den kortikalen "Klappe" created durch die beiden Einschnitte in den Schritten 3.7 und 3.8 hergestellt, ein Skalpell oder leichten Druck aus einem Strom von HBSS mit 200 ul Pipettors geliefert an eine mechanische Beschädigung der Hirnrinde zu vermeiden. Dann machen Sie einen Quer-Schnitt entlang der Grenze zwischen den seitlichen ganglionic Eminenz aus den Entwicklungsländern Kortex (Figuren 1G, H). Dann sezieren entfernt die Entwicklungsländer Hippocampus und Kortex Saum des medialen Telencephalon, an der Spitze des Neokortex, wo die seitliche kortikale Oberfläche trifft interhemisphärischen Wand.
11. Machen Sie einen Quer-Schnitt entlang der Grenze zwischen den seitlichen ganglionic Eminenz aus den Entwicklungsländern Kortex (Abb. 1H).
12. Entfernen Sie zusätzliche seziert Gewebe, das auf der Sylgard Platte aus dem seziert kortikalen Explantat ist. Man kann vorsichtiges Pipettieren mit frischem HBSS-Puffer verwenden, um pipettieren entfernt alle persönlichen seziert Gewebe. Die seziert Kortex ist jetzt mit meningealen Seite nach unten (Abb. 1I).

4. Übertragen der kortikalen Explantation

1. Bereiten Sie einen Platindraht Schleife mit einer Glaspipette. Erwärmen der Glaspipette mit einem gefalteten Platindraht am Ende der Glaspipette eingefügt. Durch Verdrehen des Endes der Platindraht Schleife kann die Größe der Schleife erhöht oder verringert werden, und die Schleife geformt sein, um die Größe des gewünschten Explantat zu passen. (Dies kann vorbereitet und wiederverwendet werden.)
2. Erwärmen des Endes des Platindraht, um die Schleife zu sterilisieren.
3. Isolieren Sie die seziert kortikalen Explantat und entfernen Sie die zusätzlichen HBSS Medien durch vorsichtiges Pipettieren, so dass eine kleine Menge mit der Drahtschlinge verwenden.
4. Legen Sie eine 1 cm Polycarbonat Membran in einer 4 cm Durchmesser Bildgebung Gericht.
5. Mit der Seite des Platin Drahtschlinge vorsichtig kippen die Rinde, so dass die meningealen Seite nach oben zeigt.
6. Heben die kortikale Explantat vor der Dissektion Schale, indem das Explantat in der Mitte der Schleife und Verwendung der intrinsischen hydrostatischen KräfteHeben Sie das Explantat auf einer ebenen Fläche.
7. Sanft platzieren das Explantat auf dem Polycarbonat-Membran, und heben den Platindraht Schleife entfernt, so dass das Explantat auf der Membran auf eine flache Ebene mit der ventrikuläre Oberfläche in Kontakt mit Membran bleibt.
8. Heben Sie die Membran und pipettieren 50 ul CSF oder andere Medien unter der Membran.
9. Bedecken Sie den Imaging-Teller, legen Sie sie in einem befeuchteten zweiten Behälter, und bei 37 ° C in 5% CO ₂ für 24 Stunden, um weitere Zellproliferation und Explantat Wachstum zu unterstützen. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des endgültigen kortikalen Explantat Gericht Vorbereitung.

Ergebnisse

Die CSF Sammlung sollte ergeben einen klaren, transparenten Flüssigkeit. Es sollte keine Anzeichen von Kontamination aus Blut sein, wie durch einen rot oder gelb gefärbten Flüssigkeit in der Ansaug und in der Eppendorf-Röhrchen nachgewiesen. Es sollte auch keine Hinweise auf Gewebe in dem Aspirat und Eppendorf Rohr sein. Wenn der CSF zentrifugiert wird, kann man auch die für das CSF mikroskopisch um sicherzustellen, dass es keine Kontamination. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind, sollte die CSF verworfen werde...

Diskussion

Das beschriebene Verfahren zur Ventrikelliquor Kollektion relativ reine Proben von embryonalen CSF mit stabilen Protein-Zusammensetzung und konsequente Aktivität in einer Reihe von zellulären Assays ⁹ ergab. Mit einer guten Sammlung Technik und Wurfgröße von zehn E14.5 Mäusen, kann man erwarten, 10-15 ul CSF zu sammeln und aus einem Wurf von E16 Ratten, kann man erwarten, dass etwa 50-90 ul CSF sammeln. Diese Sammlung Technik minimiert Kontamination von Blut und Gewebe, durch sorgfältige Beobachtung, Ze...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Catalog Number	Kommentare
Wiretrop II Kapillarnadeln	Drummond Scientific	# 5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	Nr. 184 SIL ELAST Kit
Aspirator Tubusbaugruppe	Sigma	# A5177-5EA
Einwegfilter	Venturi oder örtlichen Apotheke	nicht verfügbar	Standard Zigarettenfilter
Roundstock opthalmic Messer (15 Grad stab Messer)	World Precision Instruments, Inc.	# 500250
35mm Glasboden Kulturschale	MatTek Corp	# P35G-1.5-14-C
Platin-Iridium-Draht	Tritech Forschung	# PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane	Whatman	# 09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	# SH30031.FS
Iridektomie Scissors	Fine Science Tools	# 15000-02