JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مثلي تقنيات إعادة التركيب تقدم كبير ذبابة الفاكهة علم الوراثة من خلال تمكين إنشاء الطفرات دقيقة جزيئيا. اعتماد الأخيرة من recombineering يسمح احد للتلاعب قطعة كبيرة من الحمض النووي وتحويلها إلى ذبابة الفاكهة 6. الأساليب المقدمة هنا الجمع بين هذه التقنيات لتوليد بسرعة كبيرة مثلي ناقلات إعادة التركيب.

Abstract

سوف التطوير المستمر لتقنيات سريع، والتلاعب على نطاق واسع من مواضع الجينات الذاتية توسيع استخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن باعتباره النموذج الحي الوراثية للبحوث المتصلة الأمراض التي تصيب البشر. وقد شهدت السنوات الأخيرة التقدم التقني مثل إعادة التركيب مثلي وrecombineering. ومع ذلك، وتوليد الطفرات باطل لا لبس فيه أو البروتينات الذاتية علامات يبقى جهدا كبيرا لمعظم الجينات. هنا، نحن تصف وشرح تقنيات واستخدام أساليب الاستنساخ القائم على recombineering لتوليد نواقل التي يمكن استخدامها لاستهداف ومعالجة مواضع الذاتية في الجسم الحي على وجه التحديد، وقد أنشأنا مجموعة من ثلاث تقنيات: (1) نقل الجينات BAC / recombineering، ( 2) تنتهي إجراءات المغادرة مثلي إعادة التركيب و (3) التكنولوجيا بوابة لتوفير وسيلة قوية وفعالة ومرنة لمعالجة مواضع الجيني الذاتية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم التفاصيل خطوة بخطوة حول كيفية (1) تصميم individuaناقلات لتر، (2) كيفية استنساخ شظايا كبيرة من الحمض النووي الجيني في ناقلات إعادة التركيب مثلي باستخدام إصلاح الفجوة، و (3) كيفية استبدال أو علامة الجينات في المصالح داخل هذه النواقل باستخدام الجولة الثانية من recombineering. وأخيرا، فإننا نقدم أيضا بروتوكول لكيفية تعبئة هذه الأشرطة في الجسم الحي لتوليد بالضربة القاضية، أو الجينات المرتبطة دلاليا عبر الضربة القاضية في. ويمكن بسهولة أن اعتمدت هذه الأساليب لأهداف متعددة في نفس الوقت وتوفير وسيلة لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة.

Introduction

تنظيف التلاعب المعرفة جزيئيا من الجينات واحد في مواضع بهم الذاتية تقدم أداة لا تقدر بثمن لدراسة عدد لا يحصى من الأسئلة ذات الصلة لعلم الأحياء حقيقية النواة. ذبابة الفاكهة عكس التقنيات الوراثية لتوليد الأليلات الخسارة من وظيفة قد ثبت أن تكون صعبة حتى قدم [غليك] وزملاؤه في استهداف الجينات في الجسم الحي باستخدام إعادة التركيب مثلي لذبابة الفاكهة 1-3. وأظهروا أن يمكن استهداف مواضع الجيني محددة باستخدام جزء طولي من الحمض النووي من بناء متكامل المعدلة وراثيا. يتم إنشاء هذا خطي DNA "المانحة" في الجسم الحي من خلال إعادة التركيب FRT بوساطة (لاستئصال الحمض النووي من الكروموسوم كما جزيء دائري)، يليه الخطية مع meganuclease I-SCEI. على الرغم من أن هذه المنهجية استخدمت بنجاح لتوليد مجموعة متنوعة من الآفات محددة، ولم تكن هذه التقنية قابلة للتطوير بسهولة للتلاعب العديد من الجينات في نفس الوقت لأن كل indiviبناء خروج المغلوب المزدوج يتطلب تصميم متميز والعرف. على سبيل المثال، صعوبات في التلاعب بسلاسة شظايا كبيرة من الحمض النووي (> 5 KB) في المختبر باستخدام الكلاسيكية تقييد انزيم / ربط استنساخ أو PCR، فضلا عن القيود التقليدية في حجم ناقلات تحول الجسم الحي في كثير من الأحيان تتداخل مع التولد السريع لإعادة التركيب مثلي استهداف ناقلات. للتغلب على هذه القيود، ونحن الجمع بين P [acman] نظام recombineering / نقل الجينات، والذي يسمح الفرعي الاستنساخ ونقل الجينات تصل إلى 100 كيلو بايت من الحمض النووي، مع استهداف نهايات المغادرة الجين منهجية لتأسيس منصة فعالة وسريعة نسبيا والتي يسهل استهداف الجين ذبابة الفاكهة.

إعادة التركيب بوساطة الهندسة الوراثية (recombineering) هي قوية القائم على إعادة التركيب مثلي تكنولوجيا الاستنساخ 4،5. وعلى النقيض من التقليدية تقييد انزيم / يغاز الاستنساخ، recombineering لا يقتصر بواسطة تسلسل أو الاحجام(ه) من الحمض النووي التلاعب بها. يستخدم Recombineering لE. خاص سلالة القولونية التي تؤوي آلات إعادة التركيب التي يقدمها λ معيبة طليعة العاثية 4. وقد اعتمدت هذه التقنية مؤخرا لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 6،7. Recombineering في ذبابة الفاكهة تعتمد على amplifiable مشروط كروموسوم اصطناعي البكتيرية المعدلة (BAC) ناقلات دعا P [acman] 6،7. هذا ناقلات تحمل اثنين من أصل النسخ المتماثل: OriV، التي تنتج رقم ونسخة عالية على الاستقراء الكيميائية لتنقية كميات كبيرة من الحمض النووي المطلوبة لتسلسل وحقن الجنين وأوريس، التي تحافظ على رقم ونسخة منخفضة في ظل ظروف القاعدية. بالإضافة إلى ذلك، ف [acman] وقد تم تجهيز ناقلات مع المرفقات (attB) موقع البكتيرية. موقع attB بمثابة الركيزة لΦC31 integrase بوساطة نقل الجينات التي تسمح بإدماج شظايا الحمض النووي كبير في موقع الهبوط محددة سلفا داخل ذبابة الفاكهة الجينوم 8،9.

لقد ولدت P [acman] ناقلات (المشار إليها باسم P [acman]-KO 1.0) التي يمكن استخدامها كناقل استهداف لغايات المغادرة مثلي إعادة التركيب 10،11. لدمج إنتهاء المغادرة استهداف الجينات التكنولوجيا في النظام، واضاف نحن اثنان FRT وموقعين I-SCEI. لقد تضمنت ايضا كاسيت بوابة ضمن هذه النواقل تعديل لتبسيط عملية دمج الأسلحة تناظر إلى P [acman]-KO 1.0. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإدخال عمليا أي منطقة الجيني من الفائدة في ناقلات الاستهداف. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح كيفية مهندس ناقلات استهداف باستخدام P [acman]-KO 1.0، وكيفية تعبئة هذه النواقل في الجسم الحي لاستهداف موضع الذاتية. لغرض هذا البروتوكول سوف نستخدم RFP / اساسه كاسيت ليحل محل الجينات في المصالح، ولكن مجموعة متنوعة من أشرطة الكاسيت التي تحتوي على علامة اختيار المضادات الحيوية يمكن استخدامها مع هذا البروتوكول. لقد قمنا بتصميم واستخدمت بنجاح مجموعة من أشرطة الكاسيت للاستبدال الجينات ووضع علامات 10،11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. اختيار BAC ومن منطقة إلى استهداف

  1. للحصول على BAC مع الجينات في المصالح (الحكومة العراقية) (هنا يتم استخدام CG32095 كمثال)، والبحث عن CG32095 في www.flybase.org . تحت قسم الأسهم والكواشف، والتحقق من مقطع بعنوان "استنساخ الجينوم" لتسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي التي تحتوي على CG32095. تأكد من أن يتضمن BAC لا يقل عن 10 KB المنبع والمصب 5 KB الجينات في المصالح. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن الحيوانات المستنسخة في P [acman] ناقلات 7 يمكن العثور عليها في http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. استنساخ BAC تأتي في الخلايا DH10B وP [acman] استنساخ تأتي في EPI300 الخلايا. في حاجة إلى استنساخ الجينوم إلى أن تتحول إلى SW102 الخلايا، والتي هي قابلة للrecombineering. "minipreps القذرة" يتم تنفيذ (أ miniprep QIAGEN دون استخدام عمود وعجل الحمض النووي باستخدام الأيزوبروبانول) انطلاقمن 5 مل O / N ثقافة تلقيح مع الخلايا التي تحتوي على البكالوريا. بعد إعادة تعليق بيليه الحمض النووي الطازجة في 20 ميكرولتر من DH 2 O، وتمييع 1 ميكرولتر في 100 ميكرولتر من DH 2 O واستخدام 1 ميكرولتر ل electroporate SW102 electrocompetent. لجعل SW102 electrocompetent استخدام بروتوكول التالية:
    1. تطعيم SW102 الخلايا في 4 مل من LB. تنمو ثقافة في 32 ° CO / N اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة هام: لا ينبغي أبدا أن تتعرض الخلايا SW102 إلى درجة حرارة أعلى من 32 درجة مئوية ما لم هو المطلوب تحريض آلات إعادة التركيب.
    2. تطعيم 1 مل من SW102 المشبعة ثقافة إلى 44 مل LB وتنمو على 32 ° C شاكر إلى OD 600 بين 0.2-0.3 (عادة حوالي 1-1.5 ساعة) ملاحظة: بروتوكولات recombineering غيرها من يوصي نموا في الثقافة في حجم أصغر لل OD 600 0،6-0،7، ومع ذلك تزايد البكتيريا إلى مناطق ذات كثافة أقل في حجم أكبر بشكل ملحوظ التحول efficieNCY 12. وبالإضافة إلى ذلك، هذا التعديل يقلل من وقت الانتظار.
    3. تبريد الثقافة في الطين الماء المثلج لمدة 5 دقائق هامة: خلال الخطوات التالية يجب أن تبقى الخلايا في درجات الحرارة المنخفضة. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على خلايا electrocompetent ذات نوعية جيدة.
    4. أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل بيليه في 25 مل من البرد (4 ° C) 10٪ الجلسرين 13. أولا، وخلايا resuspend في 5 مل من خلال استغلال ويحوم الأنبوب في الطين الماء المثلج (لا ماصة صعودا وهبوطا) ثم قم بإضافة ما تبقى من الجلسرين 10٪ (20 مل).
    5. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه للمرة الثانية مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه للمرة الثالثة مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة وتجاهل سوبernatant. بيليه الخلية قد تكون فضفاضة جدا في هذه المرحلة، وينبغي توخي الحذر عند التخلص من طاف. Resuspend الكرية في 1 مل من البرد 10٪ الجلسرين. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية على 12،000 XG في microcentrifuge الطاولة في 4 درجات مئوية. تجاهل معظم طاف مغادرة ≈ 90 ميكرولتر من الجلسرين / الخلايا. الخلايا هي الآن جاهزة للelectroporated ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن أن يتم تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. ومع ذلك، وهذا قد يقلل من الكفاءة.
    8. Electroporate الحمض النووي في الخلايا باستخدام مم كفيت 1 في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω. بعد electroporation، إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب والسماح للخلايا استرداد لمدة 2 ساعة على 32 درجة مئوية (الهز غير مطلوب). لوحة الخلايا على أجار LB بالإضافة إلى 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (أو المضادات الحيوية الأخرى المناسبة اعتمادا على BAC حولت أو PAC) واحتضان عند 32 درجة مئوية لمدة 24-30 ساعة.
  4. تم تصميم الأسلحة تناظر لاستهداف الجينات التي حددجي 10 كيلو بايت من الحمض النووي الجيني المنبع والمصب 5 KB النسبية إلى الحكومة العراقية. حدد 500 BP في نهاية ال 10 KB و5 KB الأسلحة تناظر لتضخيم (انظر القسم 2) (الشكل 1). هذه الشظايا 500 BP بمثابة أسلحة تستخدم لإعادة تجميع تناظر المنطقة المحيطة الجيني الحكومة العراقية إلى P [acman] KO 1.0. ويشار إلى هذه الشظايا كما الذراع الأيسر (LA) للمنطقة الذي يتوافق مع المنبع 5 'الذراع التماثل والذراع الأيمن (RA) للمنطقة الذي يتوافق مع المصب 3' الذراع التماثل هام: يجب أن لا تحتوي على أسلحة التماثل BamHI مواقع التقييد، كما الخطية من البلازميد (في الخطوة 3.2) ويتم إنجاز عبر خلاصة تقييد BamHI.

2. إدراج الأسلحة التماثل إلى P [acman]-KO 1.0

  1. إنشاء شركتين الفردية تفاعلات PCR، واحدة لتضخيم LA وأخرى لتضخيم RA. لLA، استخدم الاشعال attB1-I-SCEI-LA-F وBamHI-LA-R واستخدام الاشعال BamHI-RA-F وattB2-I-SCEI-RA-Rلتضخيم RA (الجدول 1). استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي BAC من الخطوة 1.2 أو 0.5 ميكرولتر من مغلي ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها تحتوي BAC الاهتمام كقالب. تأكد من استخدام البلمرة DNA مع تصحيح التجارب المطبعية القدرة. وهذا ينطبق على جميع تقارير إنجاز المشروعات اللاحقة، مع استثناء من الاختيار PCR في خطوات 2.8 و 3.13 ملاحظة:. وقت التمديد لالبلمرة DNA تصحيح التجارب المطبعية قد تكون مختلفة عن العادية البلمرة DNA طق اعتمادا على الشركة المصنعة. PfuUltra الثاني فيوجن HotStart، التي يبلمر بمعدل 15 ثانية / كيلو بايت، ويمكن استخدامها في هذه الخطوات.
    LA / RA PCR
    1 ميكرولتر الحمض النووي من القذرة miniprep من الخطوة 1.2 باك
    0.25 ميكرولتر كل 20 ميكرومتر التمهيدي
    2.5 ميكرولتر 10X PfuUltra الثاني الواق
    0.75 ميكرولتر 10MM (كل) dNTP
    0.5 ميكرولتر PfuUltra الثاني فيوجن HotStart البلمرة DNA
    19.75 ميكرولتر ماء
    25 ميكرولتر اجمالى حجم التداول
    شروط PCR
    STEP1 95 ° C 2 دقيقة لتنشيط انزيم
    STEP2 95 ° C 20 ثانية تفسد
    STEP3 60 ° C 20 ثانية الصلب
    STEP4 72 ° C 20 ثانية التمديد
    Step5 انتقل إلى الخطوة 2 وكرر 29 دورات
    Step6 4 ° C امسك
  2. تشغيل العينات على agarose هلام 1٪ واستخراج المنتجات باستخدام Zymoclean عدة الانتعاش الحمض النووي. أزل الحمض النووي من العمود Zymoclean مع 10 ميكرولتر من الماء المعقم.
  3. تنفيذ الربط عن طريق التداخل بين التمديد (PCR SOE) مع اثنين من شظايا باستخدام 10-30 نانوغرام من الحمض النووي من مجموع كل منتج تضخيم تنقيته في 2.2 (الشكل 2). هذا هو عادة حوالي 1/20 من كل ال PCR المنتج المنقى:
    LA / RA-PCR سو
    0.5 ميكرولتر كل LA وRA المنقى PCR المنتج حوالي 10-30 نانوغرام
    0.25 ميكرولتر كل 20 ميكرومتر التمهيدي
    2.5 ميكرولتر 10X PfuUltra الثاني الواق
    0.75 ميكرولتر 10MM (كل) dNTP
    0.5 ميكرولتر PfuUltra الثاني فيوجن HotStart البلمرة DNA
    19.25 ميكرولتر ماء
    25 ميكرولتر اجمالى حجم التداول
    شروط PCR
    STEP1 95 ° C 2 دقيقة لتنشيط انزيم
    STEP2 95 ° C 20 ثانية تفسد
    STEP3 55 ° C 20 ثانية الصلب (السفلى درجة الحرارة. للسماح للأسلحة ليصلب)
    STEP4 72 ° C 20 ثانية التمديد
    Step5 انتقل إلى الخطوة 2 وتكرار دورة 1
    Step6 95 ° C 20 ثانية تفسد
    STEP7 60 ° C 20 ثانية الصلب
    Step8 72 ° C 20 ثانية التمديد
    Step9 انتقل إلى الخطوة 2 وكرر 27 دورات
    Step10 4 ° C امسك
  4. تشغيل العينة PCR على هلام الاغاروز واسترداد KB الفرقة 1.0 بواسطة استخراج الهلام. هذا هو الكاسيت attB1-LA-BamHI-RA-attB2.
  5. استخدام بوابة BP ClonaseII عدة إنزيم لإعداد رد فعل BP بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة.سوف كاسيت ولدت في 2.4 بمثابة الحمض النووي المانحة وP [acman]-KO 1.0 كما متجه الوجهة.
  6. تمييع 50 ميكرولتر من TransforMax EPI300 الخلايا electrocompetent بإضافة 30 ميكرولتر من البرد الجلسرين 10٪ أو باردة DH 2 O. تحويل 1 ميكرولتر من رد فعل BP إلى خلايا electrocompetent بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة. إضافة الماء يخفف من تركيز الملح عالية نسبيا من رد فعل BP لمنع التفريغ الكهربائي (الانحناء) خلال electroporation. Electroporate الحمض النووي في الخلايا باستخدام مم كفيت 1 في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω.
  7. إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب والسماح الخلايا استرداد لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (الهز غير مطلوب). لوحة الخلايا على LB-أجار + 50 ميكروغرام / مل من الأمبير (P [acman]-KO 1.0 يحتوي على الأمبير المقاومة الجينات). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
  8. PCR تحقق المستعمرات الفردية التقليدية مستعمرة PCR باستخدام T3 (تسلسل T3 هو المصب من الكاسيت في بوابة P [acman]-KO 1.0 (الشكللدى عودتهم 1) وattB1-I-SCEI-LA-F الاشعال. سوف استنساخ الإيجابية عرض الفرقة التي يعمل في 1.2 كيلو بايت.
  9. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها من استنساخ إيجابية في LB مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين.
  10. تضخيم P [acman]-KO 1.0 ناقلات تحتوي على LA وRA في LB 10 مل مع 50 ميكروغرام / مل ثقافة الأمبيسلين باستخدام حلول التحكم نسخة بعد بروتوكول الشركة المصنعة (EPICENTRE).
  11. إجراء miniprep QIAGEN بعد بروتوكول الشركة المصنعة.

3. إعادة توحيد الإقليم الجينوم الاهتمام إلى P [acman]-KO 1.0

يوم 1

  1. تطعيم SW102 الخلايا التي تحتوي على BAC من الفائدة إلى 4 مل من LB بالإضافة إلى 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (كلوروفيل) أو المضادات الحيوية الاختيار المناسب. تنمو ثقافة في 32 ° CO / N اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة هام: الى جانب ذلك خلال الاستقراء في الخطوة 3.5، لا ينبغي أن يتعرض SW102 الخلايا إلى درجة حرارة أعلى من 32 درجة مئوية، وارتفاع درجة الحرارة ينشط إعادة التركيب أماهتشينري من هذه الخلايا.

يوم 2

  1. هضم 0.4 ميكروغرام من P [acman]-KO-1.0 التي تحتوي على الأسلحة وLA RA ولدت في الباب 2 مع ≈ 20 وحدة من BamHI في رد فعل ميكرولتر 25. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعة هام: الهضم طويلة أمر بالغ الأهمية لضمان الهضم من كل DNA. هذا سيقلل من عدد من ايجابيات كاذبة الحيوانات المستنسخة في وقت لاحق.
  2. تطعيم 1.0 مل من ثقافة SW102/BAC المشبعة إلى 44 مل LB-كلوروفيل (25 ميكروغرام / مل)، وتنمو على 32 ° C شاكر إلى OD 600 بين 0.2-0.3 (عادة حوالي 1-1.5 ساعة). وتشمل عينة متطابقة إضافية للسيطرة غير HS. سيتم التعامل مع هذه العينة تماما مثل واحد تجريبية في كل جانب واحد مع استثناء من HS. هذه الثقافة غير حرارة صدمت بمثابة سيطرة سلبية. ظهور العديد من المستعمرات على لوحة التحكم غير HS (الخطوة 3.13) يشير عادة مع عسر الهضم تحول P [acman] KO 1.0 LA/ RA البلازميد.
  3. في حين أن الثقافة ينمو، تشغيل BamHI المقيدة P [acman]-KO على هلام. ثم هلام استخراج وأزل الحمض النووي في 10 ميكرولتر من المياه ارتفعت درجة حرارة تصل إلى 55 درجة مئوية. ملاحظة: لا أزل الحمض النووي في أي العازلة. أملاح موجودة في المخزن المؤقت قد يسبب التفريغ الكهربائي خلال electroporation.
  4. حرارة صدمة الثقافة في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بالضبط في حمام مائي. وسوف يؤدي هذا إلى تنشيط الآلية recombineering من SW102 الخلايا. لا تسخن صدمة ثقافة السيطرة.
  5. فورا بعد الصدمة الحرارية، ونقل الحرارة من الصدمة والارتباك والثقافات تحكم غير HS لالمبردة 50 مل أنابيب الكنسي، والسماح للالبرد الثقافات في الطين الماء المثلج لمدة 5 دقائق هامة: خلال الخطوات التالية يجب أن تبقى الخلايا في درجات الحرارة المنخفضة . هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على خلايا electrocompetent ذات نوعية جيدة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في الثقافة 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل بيليه في 25 مل من البرد (4 ° C) 10٪ الجلسرين 13. أولا،resuspend الخلايا في 5 مل من خلال استغلال ويحوم الأنبوب في الطين الماء المثلج (لا ماصة صعودا وهبوطا) ثم قم بإضافة ما تبقى من الجلسرين 10٪ (20 مل).
  7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪ للمرة الثانية.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مع 25 مل الجليد الباردة الجلسرين 10٪ للمرة الثالثة.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف. بيليه الخلية قد تكون فضفاضة جدا في هذه المرحلة، وينبغي توخي الحذر عند التخلص من طاف. Resuspend الكرية في 1 مل من البرد 10٪ الجلسرين. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية على 12،000 XG في microcentrifuge الطاولة في 4 درجات مئوية. تجاهل معظم طاف مغادرة ≈ 90 ميكرولتر من المياه / خلايا ملاحظة: عند هذه النقطة الخلايا يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. ومع ذلك، وهذا قد يقلل من الكفاءة.
  10. إضافة 2 ميكرولتر من BamHI-P يهضم [acman] (الهدف لمدة 50 نانوغرام) إلى الخلايا وتخلط بلطف باستخدام طرف ماصة. نقل الخلايا في 1 ملم كفيت electroporation وelectroporate في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω.
  11. إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب والسماح للخلايا استرداد لمدة 2 ساعة على 32 درجة مئوية (الهز غير مطلوب). لوحة الخلايا على أجار LB بالإضافة إلى 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين واحتضان عند 32 درجة مئوية لمدة 24-30 ساعة.

يوم 3

  1. الشاشة لمناسبة الفجوة الإصلاح باستخدام PCR مستعمرة. استخدام T3 و RA تحقق الاشعال لRA وT7 وLA التمهيدي الاختيار للLA (الجدول 1). تصميم PCR-تحقق-RA وPCR-تحقق-LA الاشعال 100-200 BP تجاه المنطقة المستهدفة (الجدول 1). سوف المستعمرات إيجابية من تفاعلات PCR باستخدام PCR-تحقق-RA مع T3 أو PCR-تحقق-LA مع T7 تظهر الفرقة التي يعمل في 800-1،000 بي بي (الشكل 3) ملاحظة: من المهم جدا لاختبار كل الأسلحة منذ التأسيس واحد ذراعولكن ليس من جهة أخرى لوحظ في بعض الأحيان.
  2. تنمو PCR-التحقق المستعمرات على 32 درجة مئوية في 4 مل من LB +50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين ليلة وضحاها. جعل الأسهم المجمدة من هذه الخلايا لاستخدامها لاحقا.

4. استبدال المنطقة الجينوم مع كاسيت الاستهداف

يوم 4

  1. تضخيم RFP / KAN كاسيت خروج المغلوب بواسطة PCR باستخدام pENTR-RFP/KAN (مهضوم مع زقاق وNheI إلى خطي) كقالب و5'HA-RFP / اساسه-F و3'HA-RFP / اساسه-R الاشعال ( الجدول 1). ويمكن طلب كراسة الشروط / KAN كاسيت من مرجع 11.
  2. هلام تنقية المنتج PCR يبلغ حجمه في 20 ميكرولتر من الماء المعقم. ينبغي للكاسيت RFP-KAN بالإضافة إلى الأسلحة تناظر تشغيل حوالي 3 كيلو بايت.
  3. تطعيم 1 مل من المشبعة SW102 / P [acman] الثقافة-KO (الخطوة 3.13) إلى 44 مل LB-الأمبير (50 ميكروغرام / مل)، وتنمو على 32 ° C شاكر إلى OD 600 بين 0.2-0.3. وتشمل عينة متطابقة إضافية للسيطرة غير HS. سيتم التعامل مع هذه العينة فقطمثل واحد تجريبية في كل جانب واحد مع استثناء من HS.
  4. بعد SW102 / P [acman] ثقافة KO يصل إلى الكثافة المطلوبة، اتبع الخطوات 3،5-3،10.
  5. Electroporate ما يقرب من 100 نانوغرام من استهداف كاسيت إلى 90 ميكرولتر من electrocompetent SW102 / P [acman] خلايا-KO. نقل الخلايا في 1 ملم كفيت electroporation وelectroporate في 1،800 V، 25 المكثف، 200 Ω. إضافة 300 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب وتسمح للخلايا لاسترداد لمدة 2 ساعة على 32 درجة مئوية (الهز غير مطلوب) ملاحظة: ينصح بشدة استخدام هلام الطازج النقي كاسيت.
  6. لوحة الخلايا في أجار LB + الأمبير (50 ميكروغرام / مل) + اساسه (50 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 24-30 ساعة عند 32 درجة مئوية.

يوم 5

  1. تنمو 5 مل من ثقافة في الفترة من 5 مستعمرات مختلفة في 32 ° CO / N.

يوم 6

  1. تنفيذ "القذرة miniprep" وتشغيل نصف من الحمض النووي التي تم الحصول عليها على agarose هلام 1٪ للبحث عن العلاقات العامةesence من الوزن الجزيئي المنخفض البلازميد. لا ينبغي أن يكون هناك أي البلازميد الذي يمتد رفع الصوت عاليا 12 كيلو بايت. (الشكل 4)
  2. جعل التخفيف 1:500 من الحمض النووي من استنساخ الإيجابية واستخدام 1 ميكرولتر ل electroporate في 50 ميكرولتر من TransforMax EPI300 هام: تأكد لتخفيف الحمض النووي لمنع electroporation من البلازميدات متعددة في خلية واحدة. لوحة الخلايا في أجار LB + الأمبير (50 ميكروغرام / مل) + اساسه (50 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 ° C

يوم 7

  1. تطعيم مستعمرة واحدة في 10 مل من LB + وتنمو O / N.

اليوم 8

  1. مل البذور 100 من وسائل الإعلام LB مع ثقافة مشبعة من الخطوة 4.10. إضافة المضادات الحيوية المناسبة بالإضافة إلى 100 ميكرولتر من 1،000 X نسخة حلول التحكم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعة.
  2. إجراء maxiprep والتحقق من إدراج الكاسيت في الموقع الصحيح من خلال التسلسل.
  3. بالإضافة إلى التسلسل، تنفيذ انزيمات تقييداختبار البريد الهضم مع الحمض النووي من استنساخ التي لم تحتو على أي الوزن الجزيئي المنخفض البلازميد والحمض النووي الأبوية. فإن إنزيمات التقييد اختيارها أن تكون مختلفة عن كل الجينات لكن الهدف هو العثور على مجموعة من الإنزيمات التي تسمح للمحقق لتوصيف ناقلات recombineered. على سبيل المثال، تم هضمها متجه استهداف CG32095 متسلسل مع باتشي، زقاق، BamHI وAatII. ظهور جميع نطاقات التنبؤ بها وعدم وجود أي فرق غير صحيحة يؤكد أن استهداف ناقلات تم recombineered بشكل صحيح (الشكل 5).

5. عن طريق الحقن الذباب وتعبئة كاسيت في فيفو

  1. حقن كاسيت باستخدام ΦC31 integrase، إلى موقع الهبوط محددة مسبقا من خيار. الموردين الخارجيين، مثل قوس قزح المعدلة وراثيا ( http://www.rainbowgene.com )، ويمكن استخدامها لخدمات حقن هام: يجب أن يكون الحمض النووي طازجة Prepared قبل الحقن. ويلاحظ ارتفاع كفاءة التحويل عند إعداد الحمض النووي في الموقع وحقن في اليوم نفسه.
  2. لتعبئة الكاسيت من موقع الهبوط، واستخدام بلومنجتون الأوراق المالية رقم 25680 أو 25679. هذه المخزونات تحتوي Flippase وI-SCEI المصب من المروج الصدمة الحرارية، على الكروموسوم الثاني والثالث، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، أنها تحتوي على التحوير HS-HID على كروموسوم موازن وعلى كروموسوم Y-. جمع الذكور من الأسهم المختارة وعبور للإناث العذراء تحمل كاسيت KO في موقع الهبوط. . مجموعة ~ 30 الصلبان والسماح الإناث لوضع البيض لمدة 2-3 أيام ملاحظة: من المستحسن اختيار الأوراق المالية التي هي على كروموسوم يختلف عن موضع المستهدفة.
  3. الآباء الوجه إلى مجموعة جديدة من 30 قارورة، واليرقات الحرارة صدمة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، مرتين في اليوم، لمدة ثلاثة أيام متتالية. الصدمات الحرارية تنشيط إنتاج الإنزيمات؛ flippase وI-SCEI، وموت الخلايا الجينات اختبأ ، مما أسفر عن مقتل قبالة الذكور والذباب تحمل الكروموزومات موازن. السماح للوالدين في قارورة انقلبت حديثا لوضع البيض لمدة 2-3 أيام، ثم كرر صدمات الحرارة لتلك القنينات، بعد التقليب والدي للخروج الى قارورة جديدة مرة أخرى. كرر هذا لعدة تقلب، حتى الآباء لا تضع البيض بعد الآن.
  4. جمع الإناث العذراء من ذرية F1 من الذباب الحرارة بالصدمة، والعبور إلى ذ - ث - ذكور. تهدف ل150-200 الصلبان، وثلاثة العذارى وثلاثة ذكور لكل الصليب.
  5. فحص ذرية F2 تحت نطاق الفلورسنت التي تسمح الكشف عن طلب تقديم العروض في العين. الشاشة لطلب تقديم العروض عيون الإيجابية التي هي متحولة عن الجينات الأبيض والأصفر (Y - ث -). هذه عملية الفرز يختار بشكل إيجابي لوجود الكاسيت طلب تقديم العروض ويختار لغياب P [acman] ناقلات (ميني الأبيض) والهبوط الموقع، الذي يتميز البرية من نوع الجين الأصفر ملاحظة: لقد حان الوقت أقل يخدعبافتراض أن يحجب لطلب تقديم العروض في العين، من أن الشاشة الأولى لذباب ستشغل. الأحداث تعبئة هي فعالة جدا أثناء الصدمات الحرارية، مما أدى في كثير من الذباب أقل تحتوي على طلب تقديم العروض في العين، بالمقارنة مع ذ - ث - الذباب.
  6. إعداد التزاوج زوج واحد مع كل ذ - ث - RFP + الطاير، لأن كل حدث تعبئة قد تكون مختلفة. خريطة طلب تقديم العروض للكروموسوم الصحيح. وعادة ما لوحظ الاستهداف كروموسوم الصحيح في> 95٪ من الحالات.
  7. إنشاء مخزون والتحقق من الأحداث التي تستهدف الصحيح باستخدام التقنيات القياسية للتحليل لطخة الجنوبية. تصميم 2 كيلوبايت التحقيق المنبع (الذراع الأيسر) والمصب (الذراع الأيمن) من استهدافهم الجين، و 2 كيلو بايت (أو أقصر إذا لزم الأمر) تغطي ORF حذف. فإن تحقيقات الأولين تسفر عن الفرقة في بالضربة القاضية متماثل ومتخالف، غير موجودة في wildtype، في حين سوف ORF لا تسفر عن الفرقة في خروج المغلوب متماثلة اللواقح. A السريع PCR وأو ORF هو أيضا ممكن، ولكن هذا يعتمد على عدم وجود الفرقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التضخيم من LA والأسلحة تناظر RA يجب أن ينتج 500 منتجات BP ورد فعل PCR-الشركات المملوكة للدولة يجب أن تسفر عن 1.0 كيلوبايت المنتج (2،1-2،4 أقسام؛ الشكل 2). رد فعل BP أجريت في القسم 2.5 هو عادة تحول فعالة جدا والبكتيرية من غلة المنتج 5-100 المستعمرات في المتوسط. ما يقرب من جميع م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويستند قوة الكائنات نموذج الجينية في مجال البحوث الطبية الحيوية إلى حد كبير على الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني. نماذج صغيرة C. ايليجانس وذبابة الفاكهة على وجه الخصوص تسمح للتحاليل وراثية جزيئية غير مكلفة وسريعة من مسارات كاملة وعائلات الجينات المتورطين في التن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب لم يكن لديك أي مصالح متنافسة في ما يخص التقنيات المذكورة هنا.

Acknowledgements

ونود أن نشكر هوغو Bellen ومركز الأسهم بلومنجتون لالكواشف. نشكر مزيد كوين Venken، هوغو Bellen وجميع أعضاء مختبرات Buszczak وHiesinger لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة إلى ACR (T32GM083831)، PRH (RO1EY018884) وMB (RO1GM086647)، وهو منحة من الوقاية من السرطان معهد بحوث من تكساس إلى MB وPRH (RP100516)، وولش مؤسسة (I-1657) إلى PRH. MB هو EE وغرير غارسون Fogelson الباحث العلمي في أبحاث الطب الحيوي وPRH هو ماكديرموت الباحث يوجين في البحوث الطبية الحيوية في UT مركز ساوث ويسترن الطبي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SW102 Recombination competent bacteriaNCI-FrederickRecombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coliEpicentreEC300110Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA PolymeraseAligent Technology Inc.600670
BamHI-HFNew England BiolabsR3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearchD4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kitInvitrogen11789-020
P[acman]KO1.010Buszczak and Hiesinger LabsUpon request
pENTR RFP-Kan11Buszczak and Hiesinger LabsUpon request
FlystocksBloomington stock centerStock numbers: 25680, 25679y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machineBiorad GenePulser Xcell with PC module165-2662
CuvettesFisher Brand#FB101

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

77 Recombineering PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved