重组工程同源重组构建<em&gt;果蝇</em

摘要

同源重组技术大大推进果蝇果蝇 6。这里介绍的方法，这些技术结合起来，以迅速产生大量的同源重组载体。

摘要

快速，大规模的内源性基因操纵技术 ​​的持续发展，将扩大利用果蝇作为一种遗传模式生物为人类疾病相关的研究。近年来，人们像同源重组和重组工程技术进步。然而，产生明确的的无效突变或标记内源性蛋白仍然是一个重大的努力，大多数基因。这里，我们描述和展示的技术使用基于重组工程的克隆的方法生成，可用于目标和操作在体内的内源基因位点的载体，具体而言，我们已经建立了三种技术的组合：（1）血液中酒精浓度的转基因/重组工程，（ 2）两端的同源重组（3）网关技术，提供了一个可靠，高效和灵活的方法来处理内源性基因位点的。在这个协议中，我们提供了一步一步的详细信息：（1）设计individua升载体，（2）如何克隆大片段的基因组DNA同源重组到载体，使用间隙维修，及（3）如何更换或标记感兴趣的基因，在这些载体中，使用了第二轮的重组工程。最后，我们也将提供如何调动这些录音带在体内产生的淘汰赛，或通过一个标记基因敲的协议。这些方法可以很容易地采用平行的多个目标，并提供一种装置，用于及时和有效的方式操纵果蝇基因组。

引言

清洁分子操纵单个基因在他们的内源性基因位点提供了一个非常宝贵的工具来研究真核细胞生物学相关的问题无数。 果蝇反向遗传技术产生损失的功能基因已被证明是具有挑战性的，直到和他的同事介绍Golic 体内基因靶向使用果蝇 ^1-3同源重组。他们证明，采用线性的DNA片段从一个集成的转基因构造，可以针对特定的基因位点。这种线性的“捐助”的DNA 在体内产生通过FRT-介导的重组（消费作为环状分子从染色体DNA）大范围核酸酶I-SCEI线性。虽然这种方法已成功地用于生成各种定义的病变，该技术并没有轻松扩展平行的许多基因的操纵，因为每个INDIVI双淘汰赛结构需要不同的定制设计。例如，无缝地操纵使用经典的限制性内切酶/结扎克隆或PCR，以及大小的限制，传统的在体内转化载体的大片段的DNA（> 5 kb的） 在体外的困难往往会干扰同源重组靶向快速创建向量。为了克服这些限制，我们结合重组工程/转基因P [ACMAN系统，它允许子克隆和高达100 kb的DNA的转基因的端部从基因打靶方法建立一个有效的和相对快速的平台，使有利于果蝇基因打靶。

重组介导的基因工程（重组工程）是一个强大的同源重组克隆技术^4,5。对比常规的限制性内切酶/连接酶克隆，重组工程并不限于序列或SIZE的操纵DNA。重组工程采用了特殊的大肠杆菌coli菌株，港口重组机制提供了一个有缺陷的λ噬菌体^4。最近这种技术已被采用，用于在果蝇 ^6,7。重组工程在果蝇依赖于修改有条件扩增细菌人工染色体（BAC）载体称为P [ACMAN] ^6,7。这个载体进行两个的复制起源：oriV的化学诱导后，其产生的高拷贝数的净化需要大量的DNA测序和胚胎注入和ORIS基础条件下，维持低拷贝数。此外，P [ACMAN]载体配有细菌附着（attB位点）的网站。 attB位点作为基板fC31整合酶介导的转基因在果蝇基因组^8,9成预定着陆点，允许注册成立的大型DNA片段。

我们已经产生一个P [ACMAN]载体（以下简称为的P [ACMAN]-KO 1.0），可以用作靶向载体的端部出同源重组^10,11。要纳入两端的基因打靶技术的系统中，我们加入了两个FRT和两个I-SCEI网站。我们还包括网关盒，在这个修改后的载体，以简化程序纳入到的P [ACMAN] KO 1.0同源臂。这提供了一种快速和简单的方法到目标载体引入任意感兴趣的基因组区域。在这个协议中，我们将描述如何设计的靶向载体，使用P [ACMAN]-KO 1.0，如何调动此载体在体内的内源基因座定位。对于此协议的目的，我们将使用的RFP /简卡带更换感兴趣的基因，但这个协议，可以使用各种含有抗生素选择标记盒。我们已经设计并成功应用于一组磁带基因置换和标记^10,11。

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研究方案

1。选型的BAC和地区的目标

1. 要收购的BAC感兴趣的基因（GOI）（这里CG32095作为一个例子），搜索CG32095 www.flybase.org的 。在部分股票和试剂，检查一节题为“基因组克隆”BAC的含CG32095。确保BAC包括至少10 KB的上游和下游5 kb的感兴趣的基因。或者，也可以被发现在P [ACMAN]载体^7的克隆在http://www.pacmanfly.org/libraries.html 。
2. BAC克隆在EPI300细胞DH10B细胞中的P [ACMAN]克隆。基因组克隆需要转化为SW102细胞，这是适合的重组工程。的“脏抽提”（Qiagen公司，而无需使用一列，并用异丙醇沉淀DNA小量制备）开始从5毫升的O / N培养接种细胞含有BAC。新鲜DNA沉淀再悬浮在20微升的蒸馏水₂ O后，稀释1微升到100微升的蒸馏水₂ O和使用1微升电穿孔电穿孔SW102。为了使电穿孔SW102使用以下协议：
3. 1. SW102细胞接种到4毫升LB。文化成长在32°CO / N在250转摇。 重要：SW102细胞应该永远不会被暴露在温度高于32°C，除非重组机制的诱导需要。
   2. 接种1毫升到44毫升LB饱和SW102文化和生长在32℃摇床外径₆₀₀ 0.2-0.3之间（通常约1-1.5小时） 注：其他重组工程协议建议在一个较小的体积不断增长的文化OD ₆₀₀ 0.6-0.7，但是较低的密度生长的细菌在一个更大的体积显着增加变换efficie回馈金^12。此外，这一修改减少了等待时间。
   3. 冷却文化在冰水煤浆5分钟。 重要提示：在下面的步骤中的细胞必须在低温下保存。获得优质的电穿孔细胞，这是至关重要的。
   4. 在1500×g离心10分钟，在4℃下离心培养。弃上清，洗涤沉淀在25ml冷的（4℃）10％甘油^13。首先，在5毫升悬浮细胞攻丝和旋流管冰水煤浆（ 不要吸管向上和向下 ），再加入剩余的10％甘油（20毫升）。
   5. 离心机在4℃下以1500×g离心10分钟，弃去上清，洗涤沉淀第二次用25毫升冰冷的10％甘油。
   6. 离心机在4℃下以1500×g离心10分钟，弃上清，洗涤沉淀用25毫升冰冷的10％甘油的第三次。
   7. 离心在4℃下以1500×g离心10分钟，丢弃线上ernatant。细胞沉淀，可能是非常松散的，在这一点上，和照顾时，应采取弃去上清。将沉淀重悬于1毫升的10％甘油。细胞转移到1.5毫升管中，在4℃下离心30秒，在桌面的离心12000×g离心倒掉大部分离开≈90微升甘油/细胞的上清液。现在已经准备好被电的细胞。 注意：此时，细胞可以储存在-80°C，以备以后使用。然而，这可能会降低能力。
   8. 电穿孔使用1毫米的比色皿的细胞在1,800 V，25μF，200Ω的DNA导入。电击后，加300μl的SOC，让细胞恢复2小时32°C（晃动）。 LB琼脂板细胞上加25微克/毫升氯霉素（或其它适当的抗生素，根据变换后的BAC或PAC），并在32℃下孵育24-30小时。
4. 基因打靶同源臂设计的选择ING 10 kb的基因组DNA的上游和下游印尼政府5 KB。选择年底的10 KB和500个基点，5 KB同源臂扩增（见第2节）（ 图1）。这500 bp的片段作为同源臂用于重组的基因组区域，围绕印尼政府为P [ACMAN] KO 1.0。这些片段被称为上游5'同源臂，右臂（RA）的区域相对应的区域，对应于下游的3'同源臂为左手臂（LA）。 重要 ：同源臂不应包含BamHI位酶切位点，通过BamHⅠ限制性消化线性化的质粒（在步骤3.2中）来完成。

2。到的P [ACMAN] KO 1.0同源臂插入

1. 设置了两个独立的PCR反应，放大LA和其他扩增的RA。为LA，使用引物经重组I-SCEI-LA-F和BamHI-LA-R使用的引物的BamHI-RA-F和attB2-I-SCEI-RA-R扩增的RA（ 表1）。使用1微升的BAC DNA步骤1.2或0.5微升煮过夜细菌培养，含有BAC利益作为模板。确保使用的DNA聚合酶校对能力。这适用于所有后续的PCR，PCR检查步骤2.8和3.13的例外。 注意：校对DNA聚合酶的延伸时间可能有所不同取决于制造商的常规Taq DNA聚合酶。 PfuUltra II融合热启动，而聚合的速率为15秒/ kb的，可以使用在这些步骤中。
   LA / RA PCR的

   1微升	薄步骤1.2脏小量制备DNA
   0.25微升每个	20μM引物
   2.5微升	10X PfuUltra II缓冲
   0.75微升	10MM（每个）的dNTP
   0.5微升	PfuUltra II融合热启动DNA聚合酶
   19.75微升	水
   25微升	总成交量

   PCR反应条件

   第一步	95℃2分钟以激活酶
   第二步	95℃20秒变性
   第三步	60°C 20秒退火
   第四步	72℃20秒延长
   第五步	第2步，重复29个循环
   第六步：	4°C保持

2. 运行样品在1％琼脂糖凝胶提取产品使用Zymoclean的DNA回收试剂盒。从Zymoclean柱用10微升无菌水洗脱DNA。
3. 执行重叠延伸拼接（PCR法SOE）与2.2（ 图2）从每个扩增产物用10-30纳克的总DNA的两个片段。这通常是大约1/20 ^日的每个纯化的PCR产物：
   LA / RA PCR-梭

   0.5微升每个	LA及RA纯化PCR产物约10-30纳克
   0.25微升每个	20μM引物
   2.5微升	10X PfuUltra II缓冲
   0.75微升	10MM（每个）的dNTP
   0.5微升	PfuUltra II融合热启动DNA聚合酶
   19.25微升	水
   25微升	总成交量

   PCR反应条件

   第一步	95℃2分钟以激活酶
   第二步	95℃20秒变性
   第三步	55°C 20秒退火（温度下允许武器退火）
   第四步	72℃20秒延长
   第五步	第2步，重复1周期
   第六步：	95℃20秒变性
   第七步	60°C 20秒退火
   第八步	72℃20秒延长
   第九步	第2步，重复27个循环
   步骤10	4°C保持

4. PCR样品在琼脂糖​​凝胶上运行，并通过凝胶提取，回收1.0kb的带。这是attB1-LA的BamHⅠ-RA-attB2磁带盒。
5. 使用网关BP ClonaseII的酶试剂盒，由制造商提供的协议后设立BP反应。盒2.4将作为供体DNA和的P [ACMAN] KO 1.0作为目标向量。
6. 稀释50微升的TransforMax EPI300电穿孔细胞加入30微升的10％甘油或过冷的DH ₂ O变换成电穿孔的细胞后，由生产商提供的协议的BP反应的1μl的。在加水稀释盐的浓度相当高的血压反应，以防止在电穿孔过程中的放电（电弧放电）。电穿孔使用1毫米的比色皿的细胞在1,800 V，25μF，200Ω的DNA导入。
7. 添加300μl的SOC，让细胞恢复1小时37°C（晃动）。板细胞在LB-琼脂+ 50微克/毫升放大器（的P [ACMAN]-KO 1.0包含的放大器抗性基因的）。板在37°C孵育18-24小时。
8. PCR检查单个菌落使用T3（T3序列是由传统的菌落PCR下游网关盒在P [ACMAN]-KO 1.0（ 图图1）和attB1-I-SCEI-LA-F引物。阳性克隆，将显示一个乐队，运行在1.2 kb。
9. 用50μg/ ml的氨苄青霉素的LB中生长的过夜培养的阳性克隆。
10. 健全的P [ACMAN]-KO 1.0矢量含有LA及RA在10毫升50微克/毫升氨苄青霉素文化的使用拷贝控制解决方案，制造商的协议（震中）的LB。
11. 制造商的协议后，执行Qiagen公司的小量制备。

3。到的P [ACMAN] KO 1.0重组感兴趣的基因组区域

1天

1. 接种SW102细胞含有BAC利益LB加4毫升25微克/毫升氯霉素（CHL）或适当的选择抗生素。文化成长在32°CO / N在250转摇。 重要：除了步骤3.5诱导期间，不应该被暴露SW102细胞的温度高于32°C，高温激活的重组马即Chinery这些细胞。

第2天

2. 精华0.4微克的P [ACMAN]-KO-1.0包含在第2≈20个单位在25μl反应体系的BamHI LA及RA武器。在37°C孵育至少3个小时。 重要：好消化是关键，以确保所有的DNA消化。这将减少误报克隆后。
3. 接种1.0毫升饱和SW102/BAC文化成44毫升LB-CHL（25微克/毫升），并在32℃摇床增长0.2-0.3（通常约1-1.5小时）外径₆₀₀之间。非HS控制包括一个附加的相同的样品。样品将被视为就像实验中的每一个方面例外的HS。这种非热休克培养作为阴性对照。外观的许多殖民地非HS控制板（3.13）通常表示改造未消化的P [ACMAN] KO 1.0 LA/ RA质粒。
4. 虽然文化的不断增长，运行的BamHI限制的P [ACMAN] KO凝胶。凝胶提取和10微升的水洗脱DNA升温至55°C。 注意：不要在任何缓冲区洗脱DNA。缓冲区中存在的盐可能导致放电过程中电。
5. 热休克的文化正是在42℃水浴15分钟。这将激活的重组工程机械SW102细胞。不要加热控制文化震荡。
6. 热休克后立即转移热休克和非恒生控制文化冷冻50毫升规范的管让文化在冰水浆5分钟的寒意。 重要信息：在接下来的步骤中细胞必须保持在低温。取得良好的品质的电穿孔细胞，这是至关重要的。
7. 离心10分钟，在1500 XG文化。弃上清，洗涤沉淀在25ml冷的（4℃）10％甘油^13。首先，重悬细胞在5毫升冰水煤浆（请勿吸管向上和向下），再加入剩余的10％的甘油（20毫升），攻丝和旋流管。
8. 离心机在4℃下以1500×g离心10分钟，弃去上清，沉淀用25毫升冰冷的10％甘油第二次洗涤。
9. 离心机在4℃下以1500×g离心10分钟，弃去上清，用25毫升冰冷的10％甘油第三次洗涤沉淀。
10. 离心机在4℃下以1500×g离心10分钟，弃去上清液。细胞沉淀，可能是非常松散的，在这一点上，和照顾时，应采取弃去上清。将沉淀重悬于1毫升的10％甘油。细胞转移到1.5毫升管中，在4℃下离心30秒，在桌面的离心12000×g离心丢弃的上清液离开≈90微升水/细胞。 注：此时，细胞可以储存在-80℃下以供以后使用。然而，这可能会降低能力。
11. 加入2μl的BamHI消化P [ACMAN]（目标为50纳克）的细胞，轻轻混匀，用枪头。细胞转移到1毫米的电比色皿和1,800 V，25μF，200Ω电穿孔。
12. 添加300μl的SOC，让细胞恢复2小时32°C（晃动）。 LB琼脂板细胞加50微克/毫升氨苄青霉素，在32°C孵育24-30小时。

第3天

13. 屏幕适当的间隙修复菌落PCR技术。使用T3和RA检查引物RA和T7和LA检查底漆为LA（ 表1）。设计的PCR入住RA和引物PCR入住LA对目标区域100-200个基点（ 表1）。 PCR反应的阳性克隆，采用PCR-T3或PCR入住LA与T7入住RA将显示一个乐队，运行在800-1000 bp的（ 图3）。注：自注册成立以来的一个关键是要测试这两种武器胳膊而不是其他有时观察。
14. PCR验证的殖民地成长在32°C在4毫升LB 50微克/毫升氨苄青霉素过夜。使冻结的库存，这些细胞供以后使用。

4。更换的基因组区域与目标盒式

第4天

1. 放大的RFP /简淘汰赛盒PCR使用pENTR-RFP/KAN（原汁原味的ASCI和NheI线性）作为模板和的RFP 5'HA /菅直-F-RFP 3'HA /菅直-R引物（ 表1）。 RFP /简盒可以要求从参考文献11。
2. 凝胶纯化的PCR产物在20μl无菌水洗脱。 RFP根纸盒加上同源臂应奔波3 KB。
3. 饱和SW102 / P [ACMAN]-KO文化（3.13）接种1毫升到44毫升LB-AMP（50微克/毫升），成长于32℃摇床0.2-0.3之间外径_600。非HS控制包括一个附加的相同的样品。此样品将被处理像实验中的每一个方面例外的HS。
4. SW102 /的P [ACMAN] KO文化达到所需的密度后，按照步骤从3.5到3.10。
5. 90微升的电穿孔SW102 /的P [ACMAN] KO细胞靶向卡带插入电穿孔约100纳克。细胞转移到1毫米的电比色皿和1,800 V，25μF，200Ω电穿孔。添加300μl的SOC，让细胞恢复2小时32°C（晃动不是必需的）。 注：强烈建议使用新鲜凝胶纯化盒。
6. 板细胞在的LB琼脂+放大器（50微克/毫升）+菅直人（50微克/毫升）和孵育24-30小时，在32°C。

第5天

7. 从5个不同的殖民地文化增长5毫升，在32°CO / N

第6天

8. 执行一个“脏小量制备”和运行一半所得到的DNA在1％琼脂糖凝胶，以寻找公关esence的低分子量的质粒。不应该有任何质粒波纹管运行12 KB。 （ 图4）
9. 制作1:500阳性克隆的DNA，并使用1微升电穿孔成50微升的TransforMax EPI300。 重要提示 ：请一定要淡化成一个细胞的DNA，以防止多个质粒电。板细胞在的LB琼脂+放大器（50微克/毫升）+菅直人（50微克/毫升），并孵育18-24小时，在37°C

7天

10. 单个菌落接种于10毫升的LB +成长O / N。

第8天

11. 从步骤4.10饱和文化种子100毫升LB培养基。添加适当的抗生素加100微升1000 X复制控制解决方案和在37°C孵育5-6小时。
12. 执行maxiprep，并确认经测序正确的站点中的磁带插入。
13. 除了测序，执行限制植物学_AT_植物学ê消化从克隆的DNA不包含任何低分子量质粒的构建及其父母的DNA测试。选定的限制性内切酶将每个基因的不同，但我们的目标是找到一组酶，使研究者表征的recombineered矢量。通过举例的方式，CG32095靶向载体串联用PacI，AscI位，BamHI和的AatII消化。所有预测的波段，没有任何不正确的频带的外观确认，打靶载体已被正确地recombineered（ 图5）。

5。 体内注入苍蝇和动员盒式

1. 注入盒使用fC31整合成一个预先定义的降落地点给出。外部供应商，如虹的转基因品种（ http://www.rainbowgene.com ），可用于注射服务。 重要：必须是新鲜的DNA p注射前repared。更高的转化效率在现场观察时，制备DNA，注入同一天。
2. 要调动磁带从登陆网站，使用布卢明顿库存号25680或25679。这些股票包含Flippase和I-SCEI的热休克启动子下游，染色体上的两个和三个，分别。此外，它们含有一种hs-隐藏的的转基因上的平衡器染色体和Y染色体上的。收集男性所选择的股票，，处女女性携带的KO盒在登陆网站和交叉。集〜30的十字架和允许女性产卵2-3天。 注：建议选择股票，就是在不同的染色体从目标轨迹。
3. 翻转到一组新的30小瓶的父母，热休克幼虫在37℃下1小时，每天两次，连续三天。热冲击激活的酶的生产; flippase和I-SCEI和细胞死亡的基因藏 ，杀害平衡器染色体的男性和苍蝇携带。允许父母在新翻转小瓶产卵2-3天，然后重复这些小瓶的热冲击后翻转家长再次到新的小瓶。重复这几个翻转，直到父母不下蛋了。
4. 收集处女雌从的后代的热休克苍蝇，穿越到 y ^{- W -}男性。瞄准150-200十字架;三个处女和每跨三男。
5. 屏幕下的F2代的荧光示波器，使眼内的RFP检测。屏幕RFP积极的眼睛是白色和黄色（Y ^{- W - ）}基因突变体。这个筛选过程中积极选择为RFP盒的存在和选择的情况下P [ACMAN]载体（微型白色）和登陆网站，这是标记黄色基因野生型。 注：这是更短的时间内-CON梁漱溟到屏幕RFP的眼睛，比YW苍蝇的第一个屏幕。动员活动是非常有效的，在热冲击，导致少许多苍蝇的眼睛，包含RFP相比Y ^- W ^-苍蝇。
6. 设置每个 y ^{- W -} RFP ⁺飞单对交配，因为每个调动事件可能会有所不同。 RFP的映射到正确的染色体。正确的染色体定位通常> 95％的病例中观察到。
7. 建立股票和检查正确的定位事件Southern blot分析使用的标准技术。设计探针上游2 kb的（左手臂）和下游（右臂）正在有针对性的基因，和2 KB（或短如有必要）横跨删除ORF。的前两个探头，将产生一个频带，也就是不存在于野生型，而不会屈服的ORF的频带中的纯合基因敲除的纯合和杂合的敲除。一个快速PCR f的ORF也是可能的，但是这依赖于没有的频带的情况下。

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结果

LA及RA同源臂的扩增产生500 bp的产品和国有企业的PCR反应应该产生一个1.0 kb的产品（第2.1-2.4; 图2）。 2.5节进行BP反应通常是非常有效率和细菌转化产品产量平均5-100菌落。几乎所有的殖民地PCR测试与检查显示出预期的PCR产物。

在第一轮的重组工程（第3节）期望得到消化的P改造后的20-40殖民地ACMAN]-KO-1.0 SW102细胞含有LA及RA武器。这些克隆中的40％至60％，将携带所需...

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讨论

在很大程度上是基于遗传操作的工具，可用于在生物医学研究中的遗传模式生物的力量。小模型C.线虫和果蝇的特别允许在多细胞发育或功能完整的途径和基因家族牵连的廉价和快速的分子遗传分析。近年来出现了显着进步，工具开发，操纵基因在果蝇 ^14,15。例如，重组工程，它被广泛应用于在小鼠遗传学操纵Bac的DNA构建体，最近为果蝇适应，通过使用的P [ACMAN]...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SW102 Recombination competent bacteria	NCI-Frederick	Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)	http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli	Epicentre	EC300110	Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aligent Technology Inc.	600670
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit	Invitrogen	11789-020
P[acman]KO1.010	Buszczak and Hiesinger Labs	Upon request
pENTR RFP-Kan11	Buszczak and Hiesinger Labs	Upon request
Flystocks	Bloomington stock center	Stock numbers: 25680, 25679	y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine	Biorad GenePulser Xcell with PC module	165-2662
Cuvettes	Fisher Brand	#FB101