تقرير من الأحماض الدهنية المسموح وتركيزات ذيفان الكوليرا عن طريق خلايا الإنسان الظهارية في الأمعاء وBALB / ج الضامة ماوس

Summary

شرعنا في تحديد التركيزات المسموح من ثلاثة أحماض الدهنية (الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك) وبكتيريا الكوليرا التي لم تؤثر سلبا بشكل ملحوظ وبقاء الخلية بواسطة solubilizing الأحماض الدهنية والسموم واستخدامها في المقايسات بقاء الخلية.

Abstract

لقد كان دور إيجابي من الأحماض الدهنية في الوقاية والتخفيف من الأمراض غير الإنسان والإنسان والاستمرار في أن تكون موثقة على نطاق واسع. وتشمل هذه الأدوار التأثيرات على الأمراض المعدية وغير المعدية بما في ذلك الوقاية من التهاب وكذلك حصانة للأمراض المعدية. الكوليرا هو مرض معوية حادة تسببها بكتيريا ضمة الكوليرا. ويحدث ذلك في الدول النامية، وإذا تركت دون علاج، يمكن أن يؤدي إلى الموت. بينما لقاحات الكوليرا موجودة، فهي ليست دائما فعالة وهناك حاجة إلى أساليب وقائية أخرى. شرعنا في تحديد التركيزات المسموح من ثلاثة أحماض الدهنية (الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك) وبكتيريا الكوليرا باستخدام الماوس BALB / C الضامة والخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية، على التوالي. نحن solubilized الأحماض الدهنية أعلاه وتستخدم المقايسات تكاثر الخلايا لتحديد نطاقات تركيز وتركيزات معينة من الأحماض الدهنية التي توجدر تضر الإنسان المعوية بقاء الخلية الظهارية. نحن solubilized توكسين الكوليرا واستخدامه في فحص لتحديد نطاقات تركيز وتركيزات محددة من بكتيريا الكوليرا التي لا تقلل إحصائيا بقاء الخلية في BALB / C الضامة.

وجدنا تركيزات الأحماض الدهنية الأمثل أن تكون بين 1-5 نانوغرام / ميكرولتر، وذلك لذيفان الكوليرا أن يكون <30 نانوغرام لكل معاملة. هذه البيانات قد تساعد الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى إيجاد دور المخاطية الواقية للالأحماض الدهنية في الوقاية أو التخفيف من الالتهابات الكوليرا.

Introduction

وكانت الفوائد الصحية للأحماض الدهنية، مثل الأوليك، اللينوليك والأحماض اللينولينيك والاستمرار في أن تكون موثقة. على سبيل المثال، يساعد حمض الأوليك تسهيل تغلغل المخدرات محبة للدهون في الجسم ^1،2، ويقلل من الإصابة بأمراض القلب التاجية بنسبة 24٪ عند استبداله للأحماض الدهنية المشبعة ^3، ويستخدم لعلاج الأمراض الأيضية مثل Adrenoleukodystrophy ⁽⁴⁾ الذي هو العاشر مرتبطة اضطراب وراثي في ​​استقلاب الأحماض الدهنية. . بينما هو مقدمة ضرورية لحمض الأراكيدونيك في الثدييات، وحمض اللينوليك (على عكس حمض الأوليك) لا توليفها من قبل الهيئة، ويجب الحصول عليها من خلال مصادر خارجية مثل كتبها استهلاك بذور الكتان عرض ⁵ الدراسات العديد من الآثار الصحية المفيدة للحمض اللينوليك مثل: خصائص مضادة للشيخوخة للبشرة؛ ⁶ خصائص مضادة للالتهابات، ⁷ انخفاض انتشار القولون والمستقيم والبروستاتا خلايا سرطان؛ ⁸ والقدرة على محاربة السمنة وتعزيز سو صحة القلب والأوعية الدموية. ⁹ حمض اللينولينيك يلعب دورا في الحد من التهاب اللثة، الثرموبوكسان ¹⁰ وتحوير والحيوي بروستاسيكلين ¹¹

آربيتا ¹² درس تأثير الأحماض الدهنية الصفراء والكوليسترول في V. التعبير الكوليرا 'S من عوامل الفوعة والحركة. وأشار ياماساكي ¹³ أن استخراج الميثانول من الفلفل الأحمر الحار، والمركبات المستخرجة طبيعيا أخرى، يمكن أن يحتمل أن ينخفض ​​إنتاج سموم الكوليرا. فمن المتصور أن تنظر في استخدام المنتجات الغذائية التي هي غنية في الأحماض الدهنية أعلاه (مثل بذور الكتان) في الوقاية والتخفيف من الأمراض المعدية مثل الكوليرا من خلال توفير حصانة. أجرينا تحقيقات لذوبان الأحماض الدهنية وتحديد، وذلك باستخدام المقايسات تكاثر الخلايا، والحد الأقصى لتركيز الأحماض الدهنية أن الخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية يمكن أن يتسامح بدون آثار ضارة على CEجدوى ليرة لبنانية. افترضنا أن الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك توفير تأثير مفيد على بقاء الخلية بتركيزات أقل، ولكن هذا في تركيزات أعلى أنها سوف تكون سامة للخلايا. نحن أيضا solubilized السم الكوليرا وتحديد الحد الأقصى لتركيز السم الكوليرا الذي BALB / C الضامة الماوس يمكن أن يتسامح دون حدوث انخفاض كبير في بقاء الخلية. نحن نفترض تأثير السامة للبكتيريا الكوليرا على بقاء الخلية حتى على مستوى منخفض جدا. طريقة solubilizing السم الكوليرا واستخدامه لتحديد الحد الأقصى لمقدار السم أن الخلايا يمكن أن يتسامح دون حدوث انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة ويوفر ميزة للدراسات المستقبلية. على سبيل المثال، وهو مزيج من المنهجيات أعلاه يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت الأحماض الدهنية توفر الخلايا مع حصانة ضد الالتهابات الكوليرا. إلى حد علمنا، لم يتم استكشاف هذه المنهجية العقلانية و.

نحن ديscuss كيف يمكن استخدام البيانات الأولية لدينا في التحقيقات في وقت لاحق لتحديد ما إذا الأوليك والأحماض اللينوليك واللينولينيك توفر الخلايا مع حصانة ضد الإصابة بالكوليرا.

Protocol

1. زراعة الأنسجة

1. استخدام الضامة العضلة المصحف (الفئران BALB / ج) وفيما يتعلق بتحديد بكتيريا الكوليرا. الثقافة في البداية كل من م. خلايا العضلة بعد تعليمات البائع.
2. نشر BALB / ج خلايا الفئران في متوسطة Dulbecco في التعديل النسر مع L-الجلوتامين مع الانتهاء من 10٪ مصل بقري جنيني، والانتهاء من 1٪ مضاد حيوي / مضاد فطري أو RPMI وسائل الإعلام قاعدة 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني، 5٪ L-الجلوتامين، و1 ٪ مضاد حيوي / مضاد فطري كاشف.
3. زراعة خلايا في 75 سم ² قوارير كورنينج مع قبعات تنفيس عند 37 درجة مئوية، و 95٪ هواء و 5٪ CO _2.
4. إحضار الخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية في غضون 24 ساعة من الولادة وفقا للتعليمات الشركة المصنعة لتحديد قرارات الأحماض الدهنية.
5. نشر خلايا الظهارة المعوية الإنسان في 75 سم ² قوارير كورنينج مع قبعات تنفيس في وسائل الإعلام HybriCare الانتهاء مع FBS 10٪ و 30 نانوغرام / مل EGF الإنسان في 37 درجة مئوية. لا تستخدم المضادات الحيويةالكواشف / مضاد فطري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
6. تقسيم جميع الخلايا (1:3) في حوالي 70٪ confluency.
7. تجميد وإحضار جميع الخلايا في جميع أنحاء الدراسة باستخدام بروتوكولات تجميد القياسية.
8. ملاحظة: للحصول على تقرير أكبر تركيز نطاق من الأحماض الدهنية، استخدام أسرع نموا، وأسهل للحفاظ على، الضامة الماوس في البداية. لغرامة نطاق الدهنية حمض تحديد التركيز، واستخدام الخلايا الظهارية البشرية. استخدام الماوس الضامة لجميع العلاجات توكسين الكوليرا (انظر المناقشة).

2. الأحماض الدهنية والعلاج ذيفان الكوليرا

1. نقل الأحماض الأوليك، اللينوليك واللينولينيك من شركة تقدم أمبولات زجاجية لقوارير زجاجية معقمة.
2. نقل كل الأحماض الدهنية إلى منفصلة إيبندورف أنبوب تعقيم وتذوب لأول مرة في الإيثانول بنسبة 100٪ في التخفيف من 01:06، وبعد ذلك في المتوسط ​​1640 وسائل الاعلام غير مكتملة لتركيز النهائي من 10 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. دوامة كل حل وTRANSFإيه إلى قارورة زجاجية للتخزين في الفريزر (-20 ° C).
4. لوحة الخلايا في 2،500 خلايا / جيد في 96 جيدا لوحات زراعة الأنسجة.
5. إضافة وسائل الإعلام كاملة المناسبة لجعل إجمالي حجم جيدا إلى 200 ميكرولتر لعلاج الخلايا مع الأحماض الدهنية في إعداد المقايسات لMTT.
6. بعد فترة الانتشار على مدار 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة.
7. إضافة تركيزات مناسبة من كل الأحماض الدهنية لفحصها إلى الآبار (انظر النتائج). إضافة وسائط كاملة ليصبح العدد الإجمالي للمجلدات جيدا إلى 200 ميكرولتر.
8. احتضان لوحات المعالجة لمدة 24 ساعة قبل البدء في فحص MTT.
9. حل ذيفان الكوليرا في برنامج تلفزيوني في تركيز 1 ملغ / مل وقسامة الحل في cryovials وتخزين cryovials في 2-8 درجة مئوية.
10. للعلاج بالخلايا، يخفف من السموم 1:100 في أي برنامج تلفزيوني تعقيمها (7.4 درجة الحموضة) أو غير مكتملة DMEM لتركيز العمل النهائية من 1 نانوغرام / ميكرولتر.
11. لعلاج الخلايا مع توكسين الكوليرا فيإعداد لفحوصات MTT، لوحة الخلايا كما هو موضح أعلاه.
12. بعد فترة الانتشار على مدار 24 ساعة، إضافة تركيزات مناسبة من ذيفان الكوليرا (لتركيزات لدينا، انظر النتائج) لفحصها إلى الآبار وفقا للإجراءات المستخدمة في التطبيقات الأحماض الدهنية (أعلاه).
13. احتضان لوحات المعالجة لمدة 24 ساعة قبل البدء في فحص MTT.
14. ك (ج إيجابية في جميع أنحاء الورق) الإيجابية والسيطرة السلبية (ج السلبي)، لكل من الأحماض الدهنية وعلاجات بكتيريا الكوليرا، والخلايا احتضان مع المتوسطة كاملة والايثانول 70٪، على التوالي.
15. لجميع العينات والعلاجات استخدام الحد الأدنى من ثلاثة مكررات (ن = 3)، مع أكثر مكررات لالضوابط الإيجابية (ن = 6 في هذه الدراسة).

3. MTT الفحص

1. جعل محلول المخزون MTT إلى تركيز من 2.5 ملغ / مل.
2. إزالة الحل في كل بئر من لوحة جيدا 96 لفحصها واستبدالها مع 200 ميكرولتر من الحل الطازجة وسائل الإعلام كاملة.
3. إعلاند 10 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري إلى كل بئر.
4. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة.
5. تجاهل الحل وسائل الإعلام وإضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 0.04 M في الأيزوبروبانول إلى كل بئر.
6. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
7. نقل الحل من كل بئر إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
8. الطرد المركزي في XG 20،000، في درجة حرارة الغرفة، لمدة 1 دقيقة، أو حتى تم تشكيل لبيليه.
9. نقل بين 20-40 ميكرولتر من كل عينة إلى قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
10. قراءة الامتصاصية في 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

النتائج

تحديد تركيز الأمثل من الأحماض الدهنية

يتم تعريف تركيز الأمثل للأحماض الدهنية والحد الأقصى للتركيز على نمو الخلايا التي هي مماثلة لأو يفوق عدد الخلايا السيطرة، مع تقلبات منخفضة نسبيا في النتائج. لتحديد تركيز الأمثل للالأوليك، وعو...

Discussion

اقتراح من تركيز الأحماض الدهنية والسمية الكوليرا

في حين أن الآلية الدقيقة لكيفية الأحماض الدهنية تعزيز مناعة المخاطية غير معروف، وقد حاول العديد من الدراسات للتحقيق آثارها المفيدة. وتهدف دراستنا إلى تقديم منهجية لتحديد الحد الأ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101