נחישות של חומצות שומן נסבלות וריכוזי רעלן הכולרה שימוש בתאי אפיתל במעי אדם ומקרופאגים עכבר BALB / ג

Summary

אנחנו יצאנו כדי לקבוע ריכוזים נסבלים של שלוש חומצות שומן (חומצות אולאית, לינולאית ולינולנית) ורעלן הכולרה שלא באופן משמעותי ולהשפיע לרעה על הישרדות תא על ידי solubilizing את חומצות שומן והרעל והשימוש בהם במבחני הישרדות תא.

Abstract

התפקיד החיובי של חומצות שומן במניעה ובהקלה של מחלות שאינן בני אדם והאנושיים היה וממשיך להיות מתועדים בהרחבה. תפקידים אלה כוללים השפעות על מחלות זיהומיות ולא זיהומיות כולל מניעה של דלקת, כמו גם חסינות רירית למחלות זיהומיות. כולרה היא מחלה הנגרמת על ידי מעי חריף החיידק Vibrio cholerae. זה מתרחש במדינות מתפתחות, ואם אינם מטופל, עלול לגרום למוות. אמנם חיסונים נגד כולרה קיימים, הם לא תמיד יעילים ושיטות מניעות אחרות יש צורך. אנחנו יצאנו כדי לקבוע ריכוזים נסבלים של שלוש חומצות שומן (חומצות אולאית, לינולאית ולינולנית) ושימוש ברעלן הכולרה מקרופאגים BALB / C עכברים ותאי אפיתל במעי אדם, בהתאמה. אנו solubilized את חומצות שומן הנ"ל ומבחנים המשמשים התפשטות תאים כדי לקבוע את טווחי הריכוז וריכוזים מסוימים של חומצות השומן, כי הם לאלא מזיק לכדאיויות תא אפיתל במעי אדם. אנו solubilized רעלן הכולרה והשתמשנו בו בassay כדי לקבוע את טווחי הריכוז וריכוזים מסוימים של רעלן הכולרה שאינם סטטיסטי להקטין כדאיות תא במקרופאגים BALB / C.

מצאנו את ריכוזי חומצת השומן האופטימליים להיות בין 1-5 ng / μl, וכי לרעלן הכולרה להיות <30 ng לכל טיפול. נתונים אלה עשויים לסייע למחקרים עתידיים שמטרתם למצוא תפקיד הרירי מגן לחומצות שומן במניעה או הקלה של דלקות כולרה.

Introduction

היתרונות הבריאותיים של חומצות שומן, כגון אולאית, לינולאית וחומצות ינולאית היו וממשיכים להיות מתועדים. לדוגמה, חומצה אולאית עוזרת להקל על חדירה של תרופות lipophilic ^ב1,2 הגוף, מפחיתה את מחלות לב כליליות ב -24%, כאשר מחליפה חומצות שומן רוויות ^3, והוא משמש לטיפול במחלות מטבוליות כגון adrenoleukodystrophy ⁴ אשר צמודות X הפרעה גנטית של חילוף החומרים של חומצות שומן. . בעוד מבשר הכרחי לחומצה הארכידונית ביונקים, חומצה לינולאית (שלא כמו חומצה אולאית) אינו מסונתז על ידי הגוף ויש לקבל באמצעות מקורות חיצוניים, כגון על ידי צריכת זרעי פשתן ⁵ מחקרים מראים כמה השפעות בריאותיות מיטיבות של חומצה לינולאית, כגון: תכונות אנטי אייג'ינג לעור; ⁶ תכונות אנטי דלקתיות; ⁷ הפצה מופחתת של תאי סרטן מעי גס וערמונית, ⁸ ואת היכולת להילחם בהשמנה והקידום O. חומצה לינולנית ו בריאות לב וכלי דם ⁹ משחקת תפקיד בהפחתת דלקת חניכיים, ¹⁰ והוויסות thromboxane וסינתזת prostacyclin. ¹¹

¹² Arpita למד את ההשפעה של חומצות שומן וכולסטרול במרת V. ביטוי של cholerae של גורמים ארסיות ותנועתיות. דואדי ¹³ הצביע על כך שתמצית מתנול מאדום פלפל צ'ילי, ותרכובות המופקים באופן טבעי אחרות, עלולה להקטין את ייצור הרעלן כולרה. זה מתקבל על הדעת לשקול את השימוש במוצרי מזון עשירים בחומצות השומן הנ"ל (כגון זרעי פשתן) במניעה ובהקלה של מחלות זיהומיות כגון כולרה באמצעות מתן חסינות רירית. ערכנו את חקירות לsolubilize חומצות שומן ולקבוע, באמצעות מבחני שגשוג תאים, הריכוז המרבי של חומצות שומן שתאי אפיתל במעי אדם יכולים לסבול ללא השפעות מזיקות על ceכדאיות LL. חוקרים שיערנו כי חומצות אולאית, לינולאית ולינולנית לספק השפעה חיובית על כדאיות תא בריכוזים נמוכים יותר, אבל זה בריכוזים גבוהים יותר הם יהיו רעילים לתאים. כמו כן, אנו solubilized רעלן הכולרה וקבענו את הריכוז המרבי של רעלן הכולרה שמקרופאגים עכבר BALB / C יכולים לסבול ללא ירידה משמעותית בכדאיויות תא. אנו משערים אפקט רעיל של רעלן הכולרה על כדאיות תא אפילו ברמה נמוכה מאוד. השיטה של ​​solubilizing רעלן הכולרה ולהשתמש בו כדי לקבוע את הכמות המקסימלית של הרעל שהתאים יכולים לסבול ללא ירידה משמעותית בשרידות מספקת יתרון למחקרים עתידיים. לדוגמה, שילוב של מתודולוגיות לעיל יכול לשמש כדי לקבוע אם חומצות שומן לספק תאים רירית עם חסינות מפני זיהומי כולרה. למיטב ידיעתנו, שיטה רציונלית וזה לא נחקרה.

אנחנו דיscuss כיצד ניתן להשתמש בנתונים הראשוניים שלנו בחקירות מאוחרות יותר כדי לקבוע אם אולאית, חומצות לינולאית ולינולנית לספק תאים רירית עם חסינות מפני זיהום כולרה.

Protocol

1. תרבית רקמה

1. השתמש מקרופאגים מאסכאלאס Mus (BALB / ג) לקביעות רעלן הכולרה. בתחילה כל התרבות של מ ' תאי מאסכאלאס בעקבות הוראותיו של הספק.
2. הפץ תאי BALB / C עכברים בבינוני השתנה Dulbecco של הנשר עם L-גלוטמין סיים עם 10% בסרום שור עוברי, ובסיס מדיה 1% אנטיביוטיקה / antimycotic או RPMI 1640 הושלמה 10% בסרום שור עוברי, 5% L-גלוטמין, ו1 % מגיב לאנטיביוטיקה / antimycotic.
3. לגדל תאים ב75 ס"מ ² צלוחיות קורנינג עם כובעים פרקו על 37 מעלות צלזיוס, באוויר 95% ו 5% CO _2.
4. להביא את תאי אפיתל במעי אדם בתוך 24 שעות מלידה כהוראות יצרן לקביעת קביעות חומצת שומן.
5. הפץ את תאי המעיים epithelia אדם ב75 ס"מ ² צלוחיות קורנינג עם כובעים פרקו בתקשורת HybriCare סיימו עם FBS 10% וEGF 30 ng / ml האנושי על 37 ° C. אל תשתמש באנטיביוטיקהריאגנטים / antimycotic בהתאם להוראות יצרן.
6. פיצול כל התאים (1:3) בכ -70% confluency.
7. להקפיא ולהביא את כל התאים לאורך כל תקופת המחקר תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים הקפאה.
8. הערה: לקביעת ריכוז קנה מידה גדולה יותר של חומצות שומן, השתמש בצמיחה מהירה יותר, קל יותר לתחזוקה, מקרופאגים עכבר בתחילה. לקביעת ריכוז חומצת שומן סולם קנס, להשתמש בתאי אפיתל אנושיים. השתמש בעכבר מקרופאגים עבור כל טיפולי רעלן הכולרה (ראה דיון).

2. חומצת שומן וטיפולי רעלן הכולרה

1. העבר את החומצות אולאית, לינולאית ולינולנית מהחברה שסיפקו ampules זכוכית לצלוחיות זכוכית מעוקרות.
2. העבר כל חומצת שומן לצינור Eppendorf מעוקר נפרד ולפזר אותו לראשונה בשנת 100% אתנול בדילול של 01:06, ולאחר מכן שנת 1640 מדיה שלמה RPMI לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / μl.
3. מערבולת כל פתרון וtransfאה זה לצלוחיות זכוכית לאחסון במקפיא (-20 ° C).
4. פלייט תאים ב-2,500 תאים / גם ב96 צלחות תרבית רקמה כן.
5. הוסף את מדיה המלאה המתאימה כדי להביא את הנפח הכולל גם עד 200 μl לטיפול בתאים עם חומצות שומן בהכנה למבחני MTT.
6. לאחר תקופת שגשוג הפועל 24 שעות, להסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה חדשה.
7. הוסף את הריכוזים המתאימים של כל חומצות שומן שנבדק לבארות (תוצאות ראו מסגרת). הוסף מדיה מלאה כדי להביא את הכרכים גם לסך 200 μl.
8. דגירה צלחות שטופלו במשך 24 שעות לפני תחילת assay MTT.
9. ממיסים את רעלן הכולרה ב PBS בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​ו aliquot הפתרון בcryovials ולאחסן את cryovials ב 2-8 מעלות צלזיוס
10. לטיפולים בתא, לדלל את הרעל 1:100 באו PBS מעוקר (pH 7.4) או DMEM שלמה לריכוז עבודה סופי של ng 1 / μl.
11. לטיפול בתאים עם רעלן הכולרה בהכנה למבחני MTT, תאי צלחת כפי שתואר לעיל.
12. לאחר תקופת שגשוג הפועל 24 שעות, מוסיף את הריכוזים המתאימים של רעלן הכולרה (תוצאות לריכוזים שלנו, ראו מסגרת) כדי להיבדק על הבארות הבאות הנהלים בשימוש ביישומי חומצת שומן (לעיל).
13. דגירה צלחות שטופלו במשך 24 שעות לפני תחילת assay MTT.
14. כ( ג חיובי לאורך נייר) חיובי ובקרה שלילית (ג השלילי), לשניהם חומצת השומן וטיפולי כולרה רעל, תאי דגירה עם מדיום מלא ו -70% אתנול, בהתאמה.
15. לכל הדגימות וטיפולים להשתמש במינימום של שלוש חזרות (n = 3), עם חזרות יותר עבור בקרות חיוביות (n = 6 במחקר זה).

3. Assay MTT

1. הפוך פתרון מניות MTT לריכוז של 2.5 מ"ג / מ"ל.
2. הסר את הפתרון בכל טוב של 96 הצלחת גם להיבדק ולהחליף אותו עם 200 μl של פתרון תקשורת שלם צח.
3. מודעהד μl 10 של פתרון MTT היטב כל אחד.
4. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 3-4.
5. מחק את פתרון התקשורת ולהוסיף 100 μl של 0.04 M HCl בisopropanol היטב כל אחד.
6. דגירה את הצלחת בטמפרטורת חדר במשך חמש דקות.
7. מעבירים את הפתרון מכל אחד גם לצינור צנטריפוגות חדש.
8. צנטריפוגה ב 20,000 XG, בטמפרטורת חדר, 1 דקות, או עד גלולה הוקמה.
9. העברה בין 20-40 μl של כל דגימה לקורא microplate.
10. קרא הספיגה ב 570 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

תוצאות

קביעת הריכוז האופטימלי של חומצות שומן

הריכוז האופטימלי לחומצות שומן מוגדר כריכוז המרבי שבו צמיחת תאים היא דומה או עולה על זו של תאי בקרה, עם שונות נמוכות יחסית בתוצאות. כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של אולאית, טופלו תאי חומצות לינו...

Discussion

הצעה של ריכוז חומצות שומן ורעלן הכולרה

בעוד המנגנון של כמה חומצות שומן לשפר את החסינות רירית המדויק אינו ידוע, אך מספר מחקרים ניסו לבדוק ההשפעות המועילות שלהם. המחקר שלנו נועד לספק למתודולוגיית כדי לקבוע את הריכוז המרבי של חומצות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101