Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos

Resumen

Nos pusimos en marcha para determinar las concentraciones tolerables de tres ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y linolénico) y la toxina de cólera que no significativa y adversamente afectan la supervivencia celular mediante la solubilización de los ácidos grasos y la toxina y su uso en ensayos de supervivencia celular.

Resumen

El papel positivo de los ácidos grasos en la prevención y alivio de enfermedades no humanos y humanos han sido y siguen siendo ampliamente documentada. Estos papeles incluyen influencias sobre las enfermedades infecciosas y no infecciosas, incluyendo la prevención de la inflamación, así como inmunidad de la mucosa a las enfermedades infecciosas. El cólera es una enfermedad intestinal aguda causada por la bacteria Vibrio cholerae. Se produce en los países en desarrollo y si no se trata, puede causar la muerte. Si bien existen vacunas para el cólera, que no siempre son eficaces y son necesarios otros métodos preventivos. Nos pusimos en marcha para determinar las concentraciones tolerables de tres ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y linolénico) y la toxina del cólera a través del ratón BALB / C macrófagos y células epiteliales intestinales humanas, respectivamente. Se solubilizan los ácidos grasos anteriores y ensayos de proliferación de células utilizadas para determinar los intervalos de concentración y las concentraciones específicas de los ácidos grasos que no sont perjudiciales para la viabilidad de las células del epitelio intestinal humano. Se solubiliza la toxina del cólera y lo usamos en un ensayo para determinar los intervalos de concentración y las concentraciones específicas de la toxina del cólera que no disminuya la viabilidad celular estadísticamente en BALB / C macrófagos.

Encontramos las concentraciones de ácidos grasos óptimas para ser entre 1-5 ng / l, y que la toxina del cólera que ser <30 ng por tratamiento. Estos datos pueden ayudar a futuros estudios que tienen como objetivo encontrar un papel mucosa protectora para los ácidos grasos en la prevención o alivio de las infecciones por cólera.

Introducción

Los beneficios para la salud de los ácidos grasos, como el ácido oleico, linoleico y linolénico han sido y continúan siendo documentado. Por ejemplo, el ácido oleico ayuda a facilitar la penetración de los fármacos lipófilos en el ^1,2 cuerpo, reduce la enfermedad cardiaca coronaria en un 24% cuando se sustituyen para los ácidos grasos saturados ^3, y se utiliza para tratar enfermedades metabólicas tales como la adrenoleucodistrofia ⁴ que es una X-vinculados desorden genético del metabolismo de los ácidos grasos. . Mientras que un precursor necesario para el ácido araquidónico en los mamíferos, el ácido linoleico (a diferencia del ácido oleico) no es sintetizada por el cuerpo y debe ser obtenido a través de fuentes externas, tales como por el consumo de semilla de lino ⁵ Los estudios muestran varios efectos beneficiosos para la salud de ácido linoleico, tales como: propiedades anti-envejecimiento para la piel; ⁶ propiedades anti-inflamatorias, ⁷ reducción de la proliferación de células de carcinoma de colon y de próstata; ⁸ y la capacidad de luchar contra la obesidad y la promoción o. f salud cardiovascular ⁹ ácido linolénico juega un papel en la reducción de la inflamación periodontal, tromboxano ¹⁰ y la modulación y la biosíntesis de prostaciclina. ¹¹

Arpita ¹² estudió la influencia de los ácidos grasos biliares y el colesterol en V. expresión cholerae 's de factores de virulencia y la motilidad. Yamasaki ¹³ indica que el extracto de metanol de chiles rojos, y otros compuestos extraídos naturalmente, lo que potencialmente puede reducir la producción de la toxina del cólera. Es concebible que considerar el uso de los productos alimenticios que son ricos en los ácidos grasos anteriores (tales como semillas de lino) en la prevención y el alivio de una enfermedad infecciosa, como el cólera a través de proporcionar inmunidad de la mucosa. Hemos llevado a cabo investigaciones para solubilizar los ácidos grasos y para determinar, mediante ensayos de proliferación celular, la concentración máxima de ácidos grasos que las células epiteliales intestinales humanos pueden tolerar sin efectos perjudiciales sobre la ceviabilidad ll. La hipótesis de que los ácidos oleico, linoleico y linolénico proporcionan un efecto beneficioso sobre la viabilidad celular a concentraciones más bajas, pero que a concentraciones más altas que a ser tóxico para las células. También se solubiliza la toxina del cólera y se determinó la concentración máxima de la toxina del cólera que BALB / C macrófagos de ratón pueden tolerar sin una disminución significativa en la viabilidad celular. Planteamos la hipótesis de un efecto tóxico de la toxina del cólera en la viabilidad celular, incluso a muy bajo nivel. El método de solubilización de una toxina del cólera y su uso para determinar la cantidad máxima de la toxina que las células pueden tolerar sin una disminución significativa en la supervivencia proporciona una ventaja para futuros estudios. Por ejemplo, una combinación de las metodologías anteriores se puede utilizar para determinar si los ácidos grasos proporcionan células con inmunidad de la mucosa contra las infecciones de cólera. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta metodología racional y no ha sido explorado.

Nos discuss cómo nuestros datos preliminares pueden ser utilizados en investigaciones posteriores para determinar si los ácidos oleico, linoleico y linolénico proporcionan células con inmunidad de la mucosa contra la infección por el cólera.

Protocolo

1. Cultivo de Tejidos

1. Usa los macrófagos Mus musculus (ratones BALB / c) para las determinaciones de la toxina del cólera. Inicialmente, la cultura toda M. células musculus siguiendo las instrucciones del proveedor.
2. Propagar BALB / c las células de ratones en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con L-glutamina completado con 10% de suero fetal bovino, y 1% 1.640 medios de comunicación de base de antibiótico / antimicótico o el medio RPMI completado con 10% de suero bovino fetal, 5% de L-glutamina, y 1 % de reactivo de antibiótico / antimicótico.
3. Se cultivan las células en 75 cm ² frascos con tapas de ventilación corning a 37 ° C, 95% de aire y 5% de CO _2.
4. Llevar hasta las células epiteliales intestinales humanas dentro de las 24 horas de la entrega según las instrucciones del fabricante para la determinación de las determinaciones de ácidos grasos.
5. Propagar las células epiteliales intestinales humanas en 75 cm ² frascos de corning con tapas de ventilación en HybriCare medios completado con 10% de SFB y 30 ng / ml EGF humano a 37 º C. No use antibióticosReactivos / antimicóticos como por las instrucciones del fabricante.
6. Dividir todas las células (01:03) en aproximadamente 70% de confluencia.
7. Congelar y abrir todas las células de todo el estudio el uso de protocolos estándar de congelación.
8. Nota: Para la determinación de la concentración de mayor escala de los ácidos grasos, utilice el crecimiento más rápido, más fácil de mantener, los macrófagos de ratón inicialmente. Para la determinación de la concentración de ácidos grasos escala fina, utilice las células epiteliales humanas. Utilice los macrófagos de ratón para todos los tratamientos de toxina del cólera (véase el debate).

2. Ácidos grasos y Tratamientos toxina del cólera

1. Transferir los ácidos oleico, linoleico y linolénico desde proporcionado por la compañía ampollas de vidrio a viales de vidrio esterilizados.
2. Transferir cada ácido graso a un tubo Eppendorf esterilizado por separado y se disuelven primero en etanol al 100% a una dilución de 1:06, y luego en medio RPMI 1640 incompleto para una concentración final de 10 g / l.
3. Vortex cada solución y transfer a viales de vidrio para el almacenamiento en el congelador (-20 ° C).
4. Células de la placa en células 2500 / pocillo en 96 placas de cultivo de tejidos.
5. Agregue los medios completos necesarias para que el volumen total de 200 l para el tratamiento de las células con ácidos grasos en la preparación de ensayos de MTT.
6. Después de un período de proliferación de 24 horas, eliminar los medios de comunicación y reemplazarlo con medio fresco.
7. Añadir las concentraciones adecuadas de cada ácido graso a ensayar a los pozos (ver resultados). Añadir medio completo para llevar el volumen total y de 200 l.
8. Incubar las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo MTT.
9. Disolver la toxina del cólera en PBS a una concentración de 1 mg / ml de alícuota de la solución y en crioviales y almacenar los crioviales a 2-8 ° C.
10. Para los tratamientos de células, diluir la toxina 1:100 en PBS esterilizado (pH 7,4) o incompleta DMEM para una concentración de trabajo final de 1 ng / l.
11. Para el tratamiento de las células con la toxina del cólera enpreparación para ensayos de MTT, las células de la placa como se describe anteriormente.
12. Después de un período de proliferación de las 24 horas, agregue las concentraciones adecuadas de la toxina del cólera (por nuestras concentraciones, ver resultados) a ensayar a los pozos siguiendo los procedimientos que se utilizan en aplicaciones de ácidos grasos (arriba).
13. Incubar las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo MTT.
14. Como (c positivo en todo el documento) positivo y el control negativo (negativo c), tanto para el ácido graso y tratamientos de la toxina del cólera, las células se incuban con medio completo y etanol al 70%, respectivamente.
15. Para todas las muestras y los tratamientos utilizan un mínimo de tres repeticiones (n = 3), con más repeticiones para los controles positivos (n = 6 en este estudio).

3. Ensayo de MTT

1. Hacer una solución madre de MTT a una concentración de 2,5 mg / ml.
2. Retirar la solución en cada pocillo de la placa de 96 pocillos a ser probado y reemplazarla con 200 l de solución de los medios de comunicación completo fresco.
3. Anunciod 10 l de la solución de MTT a cada pocillo.
4. Incubar la placa a 37 ° C durante 3-4 horas.
5. Descartar la solución de los medios de comunicación y añadir 100 ml de HCl 0,04 M en isopropanol a cada pocillo.
6. Incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.
7. Transferir la solución de cada pocillo a un nuevo tubo de centrífuga.
8. Centrifugar a 20.000 xg, a temperatura ambiente, durante 1 min, o hasta que se formó un precipitado.
9. La transferencia entre 20-40 l de cada muestra a un lector de microplacas.
10. Leer la absorbancia a 570 nm utilizando un espectrofotómetro.

Resultados

Determinación de la concentración óptima de ácidos grasos

La concentración óptima para los ácidos grasos se define como la concentración máxima a la que el crecimiento celular es comparable o superior a la de las células de control, con relativamente baja variabilidad en los resultados. Para determinar la concentración óptima de oleico, células de ácidos linoleico y linolénico se trataron inicialmente con concentraciones variables de cada ácido graso en incrementos grandes y má...

Discusión

Sugerencia de la concentración de los ácidos grasos y la toxina del cólera

Aunque el mecanismo exacto de cómo los ácidos grasos mejoran la inmunidad de la mucosa es desconocida, varios estudios han tratado de investigar sus efectos beneficiosos. Nuestro estudio tiene como objetivo proporcionar metodología para determinar la concentración máxima de ácidos grasos que las células pueden tolerar, así como la máxima concentración de la toxina del cólera que las células pueden tolerar ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagent
Mus musculus macrophages	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-glutamine	ATCC	30-2115
Fetal bovine serum	Bio-west	S0250
Antibiotic/antimycotic	Hyclone	SV3007901
Human intestinal epithelial cells	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare media	ATCC	46-X
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L-2376
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101