إدراج مرنة العصبية عن طريق مجسات التقوية الصلبة المرفقة مع اصق Biodissolvable

Summary

يتم تمكين إدخال مرونة تحقيقات مسرى مكروي العصبية عن طريق ربط لتحقيقات التقوية جامدة مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG). عملية تجميع فريد من نوعه يضمن موحدة والتعلق للتكرار. بعد الإدراج في الأنسجة، وPEG يذوب ويتم استخراج الميبس. طريقة الاختبار في المختبر بتقييم هذه التقنية في agarose هلام.

Abstract

ومن المتوقع أن قمنا بمد عمر وظيفية صفائف مسرى مكروي للأجهزة العصبية واجهة التي هي مصنوعة من حيويا رقيقة فيلم البوليمر لأن مادة مرنة يمكن تقليل استجابة الأنسجة الضارة التي تسببها micromotion. ومع ذلك، مرونتها يمنعهم من يتم إدراج بدقة في الأنسجة العصبية. يوضح هذا المقال طريقة لنعلق مؤقتا مسرى مكروي التحقيق مرنة لالميبس جامدة باستخدام biodissolvable البولي ايثيلين جلايكول (PEG) لتسهيل دقيقة، الإدراج الجراحية لجنة التحقيق. تصميم فريد من نوعه يسمح الميبس لتوزيع موحد لاصقة PEG على طول التحقيق. الترابط الوجه رقاقة، أداة شائعة تستخدم في مجال الالكترونيات الدقيقة التعبئة والتغليف، وتمكن محاذاة دقيقة وقابلة للتكرار والمرفقات من لجنة التحقيق إلى الميبس. التحقيق والميبس يتم زرعها جراحيا معا، ثم يسمح للPEG حل بحيث يمكن استخراج الميبس ترك التحقيقفي المكان. أخيرا، يتم استخدام طريقة الاختبار في المختبر لتقييم استخراج الميبس في نموذج agarose هلام من أنسجة المخ. وقد أثبت هذا النهج لزرع مفيد لأطول تحقيقات مرنة (> 3 ملم). كما يوفر وسيلة عملية لزرع تحقيقات مرنة الوجهين. حتى الآن، وقد استخدمت هذه التقنية للحصول المختلفة في الجسم الحي تسجيل البيانات من القشرة الفئران.

Introduction

صفائف مسرى مكروي هي أداة أساسية في علم الأعصاب وكذلك التطبيقات السريرية الناشئة مثل الأطراف الصناعية. على وجه الخصوص، اختراق تحقيقات الكهربائي الجزئي تمكين التحفيز وتسجيل نشاط الخلايا العصبية من خلال اتصال وثيق مع الخلايا في الدماغ والحبل الشوكي، والأعصاب الطرفية. ويتمثل التحدي الرئيسي لتحقيقات العصبية المزروع هو الاستقرار وطول العمر من التحفيز وتسجيل وظائف. وقد اقترح النمذجة والدراسات التجريبية للتفاعل بين تحقيقات مسرى مكروي والأنسجة العصبية التي آلية واحدة للتدهور هو تمزيق الصغيرة من الأنسجة العصبية بسبب الحركة النسبية طفيف بين التحقيق والأنسجة ^1-3. حل واحد هو افتعال تحقيقات المرنة التي تتناسب بشكل وثيق خصائص صلابة الأكبر من الأنسجة العصبية من أجل تقليل micromotion النسبية. على هذا النحو، وقد تم اعتماد حيويا البوليمرات رقيقة مثل بوليميد وparylene بمثابة ركائز مواتية لmicroelectrode تحقيقات ^4-8.

A المقايضة تحقيقات مرنة هو أنها يصعب إدراجها في الأنسجة العصبية. وقد اتخذت الباحثين الطرق المختلفة لتسهيل الإدراج تحقيقات مرنة مع الحفاظ على الخصائص الميكانيكية مرغوب فيه. فئة واحدة من التصاميم يعدل هندسة البوليمر التحقيق لزيادة صلابة في أقسام أو محاور معينة مع الحفاظ على الامتثال في أجزاء أخرى. وقد تم إنجاز هذا من خلال دمج الأضلاع أو طبقات من المواد الأخرى ^9،10. نهج آخر يدمج قناة 3-D في تصميم البوليمر التحقيق التي يتم ملؤها بمواد قابلة للتحلل ^11. هذا التحقيق يمكن تشديد مؤقتا، وبعد الإدراج المواد في قناة يذوب والمصارف بها. ومع ذلك، قد طرق مثل هذه أن تعديل الشكل الهندسي للجهاز مزروع النهائية بشكل دائم تنازلات بعض الميزات المرغوب فيه لجنة التحقيق مرنة.

أسلوب واحد أن يفعل نبعد التمديد تغيير هندسة نتائج التحقيق النهائي هو لتغليف الجهاز البوليمر مع المواد القابلة للتحلل لتشديد مؤقتا الجهاز ^12-14. ومع ذلك، المواد القابلة للتحلل نموذجية لديك أوامر معاملات الرجوعية الشباب من حجم أصغر من أن من السيليكون وبالتالي سوف تتطلب سمك أكبر لتحقيق نفس صلابة. طلاء كاف التحقيق يمكن أن يؤدي إلى مزيد من غيض مدورة أو حادة، مما يجعل الإدراج أكثر صعوبة. أيضا، منذ يتعرضون الطلاء ذوبان، هناك خطر منهم بحل فور الاتصال، أو حتى مقربة، مع الأنسجة.

فئة أخرى من طرق يستخدم المواد الركيزة التحقيق الرواية التي تقلل من تصلب في بعد أن زرعها في الأنسجة. وتشمل هذه المواد شكل البوليمرات الذاكرة ¹⁵ وبمركب متناهي في الصغر على التكيف ميكانيكيا ^16. هذه المواد هي قادرة على انخفاض في معامل المرونة بشكل ملحوظ بعد الإدراج، ويمكن أن يؤدي إلى أن تحقيقات MATC عن كثبح الخواص الميكانيكية للأنسجة العصبية. ومع ذلك، فإن مجموعة تحقيقه من صلابة لا تزال محدودة، لذلك فإنها قد لا تكون قادرة على توفير مستوى عال جدا تعادل صلابة لالسيليكون أو التنغستن الأسلاك. وبالتالي في حالة مرنة تحقيقات التي هي طويلة جدا (على سبيل المثال> 3 ملم) أو التي لديها منخفضة للغاية وصلابة، وربما لا تزال هناك حاجة إلى طريقة لربط مؤقتا الميبس أكثر جمودا.

بعد طريقة واعدة أخرى ذكرت هو معطف مكوك تشنج مع الذاتي تجميع أحادي الطبقة الدائمة (SAM) لتخصيص سطح التفاعل بين المكوك والتحقيق مرنة ^17. عندما تجف، والتحقيق تتمسك المكوك المغلفة كهربية. بعد الإدراج، يهاجر المياه على سطح ماء، وفصل لجنة التحقيق من المكوك بحيث يمكن استخراج المكوك. وقد تجلى استخراج المكوك مع انخفاض النزوح التحقيق (85 ميكرون). ومع ذلك، مع التفاعلات كهرباء الوحيد الذي عقد لجنة التحقيق لركان المكوك، هناك بعض المخاطر من التحقيق انزلاق النسبية للمكوك قبل وأثناء الإدراج.

قمنا بتطوير الطريقة التي يتم إرفاق التحقيق مرنة لالميبس بمادة لاصقة biodissolvable المؤقتة التي تتولى التحقيق بشكل آمن أثناء الإدراج. تم إجراء تحقيقات المستخدمة من بوليميد، والذي يحتوي على معامل المرونة بناء على أمر من 2-4 برنامج العمل العالمي. كانت ملفقة والميبس من السيليكون، مع معامل مرونة من ~ 200 برنامج العمل العالمي. عندما تعلق، وصلابة من السيليكون يهيمن، وتسهيل الإدراج. مرة واحدة إدراجها في الأنسجة، والمواد اللاصقة يذوب ويتم استخراج الميبس لاستعادة مسبار لمرونته الأولي. اخترنا غليكول البولي إيثيلين (PEG) كمادة لاصقة biodissolvable. وقد استخدمت في التطبيقات PEG المزروع مثل المجسات العصبية وهندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات ^11،18،19. وقد اقترح بعض الأدلة على أن PEG قد تخفف استجابة neuroinflammatory في الدماغالأنسجة ^18،20. مقارنة مع المواد الأخرى الممكنة، بما في ذلك السكروز، اللبنيك، وحامض الجليكوليك المشترك بولي (PLGA)، والبولي فينيل الكحول (PVA)، PEG لديه الوقت للانحلال في السوائل البيولوجية التي هي في حجم مناسب للعديد من العمليات الجراحية زرع (بناء على أمر من عشرات من الدقائق، اعتمادا على الوزن الجزيئي). بالإضافة إلى ذلك، فمن الصلبة في درجة حرارة الغرفة والسائلة في درجات حرارة تتراوح 50-65 درجة مئوية. هذه الخاصية يجعلها مناسبة بشكل خاص لدينا عملية التجميع الدقة. وعلاوة على ذلك، على غرار SAM صفها في ^17، وحلت PEG هو ماء، وتسهيل استخراج الميبس. يتم تمكين هذا النهج المفيد من خلال تصميم الميبس الرواية وعملية التجميع المنهجي التي تضمن تغطية لاصقة موحدة ومحاذاة دقيقة وقابلة للتكرار. بالإضافة إلى عملية التجميع، نقدم طريقة تنفيذ الميبس القابلة للإزالة أثناء الجراحة، وكذلك إجراء في المختبر لتقييم استخراج الأمراض المنقولة جنسياffener.

بروتوكول الواردة في هذه الوثيقة يفترض أن المستخدم يمتلك مرونة البوليمر مسرى مكروي التحقيق. من جانب البروتوكول المتعلق تلفيق من الميبس وتجميع هذا التحقيق إلى الميبس يفترض الوصول إلى الأدوات المشتركة التي وجدت في منشأة التصنيع الدقيق. البروتوكول المتعلق الإدراج واستخراج من المرجح أن يؤديها في مختبر علم الأعصاب المنحى.

Protocol

1. جمعية دقق لالميبس

هذا القسم من بروتوكول يصف اختلاق الميبس السيليكون، والتجمع من البوليمر التحقيق الأغشية الرقيقة إلى الميبس. الشكل 1 يوضح نموذجية التحقيق البوليمر العصبية جنبا إلى جنب مع الميبس المقترحة. وترد تفاصيل التصميم الميبس في الشكل 2. ميزة الرواية من هذا التصميم هو الضحلة "فتل" قناة تعمل على طوله الذي يستخدم لتوزيع المواد اللاصقة السائلة خلال التجمع. الجزء الأوسع من الميبس هو المفتاح للتعامل مع التجمع، وخلال الإدراج الجراحية. خزان على علامة التبويب يتصل القناة. ملفقة المكون من السيليكون باستخدام عمليات التصنيع الدقيق القياسية.

1. كانت ملفقة والميبس السيليكون مع قناة فتل من (SOI) رقاقة السيليكون على العازل بسماكة الطبقة جهاز مساو لسمك المطلوب من الميبس ( الشكل 3A). وهناك مجموعة معقولة من سمك الميبس هو 20-100 ميكرون. فمن المستحسن أن عرض الميبس تكون 20-30 ميكرومتر أصغر من عرض التحقيق، مما يساعد على منع تجاوز لاصقة من واجهة السندات إلى الأعلى من لجنة التحقيق. أول القنوات فتل جافة محفورا بوش باستخدام عملية القياسية (الشكل 3B). المقبل، يتم تعريف الهندسة الميبس قبل حفر أطول يتوقف على طبقة أكسيد دفن (الشكل 3C). أخيرا، يتم الإفراج عن التقوية عن طريق الحفر الرطب طبقة أكسيد دفن في حمض الهيدروفلوريك 49٪ (الشكل 3D). بعد الشطف بدقة التقوية، نقع في الماء منزوع الأيونات لمدة 15 دقيقة.
2. وضع بيليه من البولي ايثلين جليكول (PEG) من الوزن الجزيئي 10،000 جم / مول في المكمن (الشكل 4). تسخين الميبس إلى 65 درجة مئوية بحيث PEG يذوب والفتائل في القناة عن طريق عمل شعري. ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لترسيخ.
3. ويبين الشكل 5 تعيين التخطيطي للرقاقة بوندر الوجه متابعة. وضع الميبس رأسا على عقب على المسرح قاعدة رقاقة بوندر الوجه، ثم التقط الميبس مع رئيس الأداة. وضع مسبار رأسا على عقب على المسرح القاعدة. باستخدام رقاقة بوندر الوجه، محاذاة الميبس والتحقيق ومن ثم خفض الميبس وضعه على لجنة التحقيق.
4. يجب أن يكون مرحلة قاعدة رقاقة بوندر الوجه عنصر التدفئة لتطبيق الحرارة إلى الركيزة. بعد وضع الميبس، تسخين التجمع مرة أخرى إلى 65 درجة مئوية. تسمح دقيقة واحدة لPEG لإعادة الصهر وتبدأ لملء في واجهة بين التحقيق والميبس. تبرد ليصلب.
5. تحويل التجمع مرارا وتفتيش من أعلى. يسخن حسب الحاجة للسماح للPEG لملء تماما واجهة بين التحقيق والميبس. وهذا يمكن أن يتم تقييم بصريا منذ التحقيق شفافا. كما التجميع هو يجلس على المدفأة أعلى (التحقيق) الجانب الأعلى، وضع 1-3 البريد يدوياالكريات إكسترا الصلبة PEG على علامة التبويب بحيث تذوب على لجنة التحقيق، وتقديم تعزيزات إضافية في هذه المنطقة (الشكل 6). أخيرا، تسمح الجمعية لتبريد بحيث PEG يتصلب. عند هذه النقطة، والجمعية مستعدة لالإدراج الجراحية.

2. الإدراج واستخراج

1. جبل الجمعية مسبار الميبس إلى مياداة مجهرية كما هو موضح في الشكل 7A من خلال الالتزام الجزء الخلفي من الميبس إلى الذراع مياداة مجهرية في المنطقة التبويب. ويمكن أن يتم هذا مع الشريط على الوجهين أو الأسمنت، ولكن الحرص على عدم الاتصال مع لجنة التحقيق لاصقة. تأمين مؤقتا نهاية موصل من لجنة التحقيق إلى مياداة مجهرية مع قطعة صغيرة من المعجون اللاصق بحيث يمكن إزالتها بسهولة مع قوة منخفضة.
2. وضع التجمع التحقيق أكثر من هدف وإدراج التحقيق مع سرعة الإدراج المطلوب. واستخدمت سرعات الإدراج من ،13-،5 ملم / ثانية عند وضع هذا البروتوكول.
3. على الفور إزالة نهاية موصل من لجنة التحقيق من مياداة مجهرية بلطف وضعه على سطح القريبة، مثل الذراع مناور الثاني (الشكل 7B). ويجب أن يتم هذا قبل أن تبدأ PEG حل لتجنب تشريد التحقيق.
4. إتاحة الوقت لPEG حل. وهذا القدر من الوقت تعتمد على PEG الوزن الجزيئي ومنطقة التماس بين لجنة التحقيق والميبس. على سبيل المثال، مع PEG الوزن الجزيئي من 10،000 جم / مول، تحقيقا مسرى مكروي حوالي 6 مم والميبس المطابقة التي هي 306 ميكرون واسع، وقد وجد 15 دقيقة أن تكون كمية كافية من الوقت. الباب 3 من البروتوكول يمثل طريقة لاختبار حل الوقت المطلوب. خلال هذا الوقت، وتطبيق الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام قطارة حول نقطة الإدراج إلى علامة التبويب وحل أي PEG الذي هو فوق الهدف (الشكل 7C).
5. باستخدام micropositioner الآلية، تبدأ استخراج الميبس عن طريق تطبيق تشريد100 ميكرون بسرعة من 5 ملم / ثانية. هذه الحركة السريعة الأولية يساعد على التغلب على أي تقليل الاحتكاك الساكن والتحقيق النزوح. ثم، واستكمال استخراج الميبس بسرعة أبطأ من حوالي 0.1 ملم / ثانية (الشكل 7D).
6. في حالة وجود الجراحة الفعلية، ومواصلة الإجراءات العادية لتطبيق هلام، السيليكون، و / أو الاكريليك الأسنان في موقع الإدراج إلى تأمين وحماية لجنة التحقيق، كما هو موضح في ^21.

3. الاغاروز اختبار جل

يصف هذا الجزء من البروتوكول وإعداد وإجراء فحص استخراج الميبس في 0.6٪ agarose هلام يقارب الخصائص الميكانيكية الأكبر، ودرجة الحموضة، والملوحة من أنسجة المخ ^17،22. منذ هلام شفاف تقريبا من خلال مسافات قصيرة، ويمكن ملاحظة فصل الميبس والتحقيق النزوح.

1. تحضير محلول 0.6٪ الاغاروز في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). مزج في وايلىدرجة الحرارة vated لتذوب تماما مسحوق الاغاروز. صب الحل في مربع الاكريليك الضحلة، وينبغي أن يكون جل 3/4- 1 في عميق. السماح للهلام وضعت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
2. ضمان أن الجل تصلب مشبعة مع برنامج تلفزيوني بحيث لا تجف، وتسخين هلام إلى 37 درجة مئوية.
3. إعداد مياداة مجهرية، مربع من agarose هلام، ونظام كاميرا مجهرية كما هو موضح في الشكل 8.
4. إدراج إشارة إيمانية الزجاج داخل منطقة الجزاء من هلام عن طريق تحريك ذلك بين جل والجانب من مربع (الشكل 8). استخدام معول الأسنان لمواجهة الميزات على إيمانية إشارة إلى مجال الرؤية من المجهر الرقمي.
5. جبل التجمع التحقيق إلى مياداة مجهرية كما هو موضح في الخطوة 2.1.
6. وضع التجمع التحقيق على هلام حوالي 1 ملم وراء إيمانية المرجعية.
7. إدراج التحقيق في هلام، وذلك باستخدام كاميرا لترشدها إلى عمق المطلوب في مجال الرؤية.
8. على الفور نقل نهاية موصل من لجنة التحقيق للراحة على سطح قريب.
9. إجراء أي تعديلات المطلوبة إلى صورة الكاميرا للتركيز على التحقيق (قد تكون الإشارة ملامح إيمانية قليلا من التركيز). أخذ لقطة من موقع التحقيق.
10. تسمح بحل PEG (قد تختلف هذه المرة، في واقع الأمر قد تكون معلمة لفحصها). تطبيق برنامج تلفزيوني بالقرب من علامة التبويب حل PEG الذي هو فوق هلام.
11. بدء التقاط الفيديو إذا رغبت، وتبدأ استخراج الميبس كما هو موضح في الخطوة 2.5. عند اكتمال الاستخراج، أخذ لقطة النهائي للموقع التحقيق.
12. استخدام أدوات معالجة الصور لمقارنة الصور قبل وبعد استخراج الميبس. استخدام ميزات على إيمانية المرجعية التي هي واضحة في مجال الرؤية لتسجيل (محاذاة) الصور. معايرة حجم الصورة استنادا إلى حجم المزايا المعروفة على التحقيق. قياس المسافة من التحقيق النزوح.

النتائج

واستخدمت هذه التقنية الإدراج بالتزامن مع LLNL الأغشية الرقيقة تحقيقات بوليميد، التي مرت ISO 10993 معايير توافق مع الحياة ويقصد لزرع المزمنة. ويتضح نموذجي الأغشية الرقيقة بوليميد التحقيق في الشكل 1 جنبا إلى جنب مع الميبس السيليكون التي هي حوالي 10 مم طويل في المنطق...

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يوفر عملية تسيطر عليها بشكل جيد لنعلق تحقيقات البوليمر الأغشية الرقيقة إلى التقوية منفصلة مع مادة لاصقة biodissolvable. كما قدم هو إجراء العمليات الجراحية الموصى بها لتنفيذ هذه التقوية القابلة للإزالة وتقنية للتحقق من صحة الإجراءات المتبعة في المخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene glycol, 10,000 g/mol	Sigma Aldrich	309028
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Flexible Sub-micron Die Bonder	Finetech	Fineplacer lambda
Micromanipulator	KOPF	1760-61
Digital Microscope	Hirox	KH-7700
Dual Illumination Revolver Zoom Lens	Hirox	MXG-2500REZ
Precision Motorized Actuator	Newport	LTA-HS	w/ CONEX-CC controller