החדרת גמישה עצביות בדיקות באמצעות אלמנטים קשיחות קשיחים מצורפים עם Biodissolvable דבק

Summary

החדרה של בדיקות microelectrode עצביות גמישות מופעלת על ידי הצמדת בדיקות לstiffeners הנוקשה עם פוליאתילן גליקול (PEG). תהליך הרכבה ייחודי מבטיח אחיד וקובץ מצורף הדיר. לאחר כניסה לרקמה, PEG מתמוסס ומקשח מופק. שיטת בדיקה במבחנה מעריכה את הטכניקה בagarose ג'ל.

Abstract

מערכי microelectrode עבור התקני ממשק עצביים שעשויים מפולימר סרט דק ביולוגית צפויים הרחיבו את החיים תפקודיים בגלל החומר גמיש עשוי למזער את תגובת רקמה שלילית הנגרמת על ידי micromotion. עם זאת, הגמישות שלהם מונעת מהם להיות מוכנס באופן מדויק לרקמה עצבית. מאמר זה מדגים שיטה לצרף באופן זמני בדיקה microelectrode גמישה למקשח נוקשה באמצעות פוליאתילן גליקול biodissolvable (PEG) כדי להקל על כניסה מדויקת, כירורגית של החללית. עיצוב מקשח ייחודי מאפשר פיזור אחיד של דבק PEG לאורכו של החללית. מליטה Flip-שבב, כלי נפוץ בשימוש באריזת מיקרואלקטרוניקה, מאפשר יישור לשחזור מדויק וקובץ מצורף של החללית למקשח. הבדיקה ומקשח בניתוח מושתל ביחד, אז PEG מותר לפזר כך שמקשח ניתן לחלץ עוזב את החלליתבמקום. לבסוף, שיטת בדיקה במבחנה משמשת להערכת חילוץ מקשח במודל agarose ג'ל של רקמת המוח. גישה זו להשתלה הוכיחה יתרון במיוחד עבור בדיקות גמישות יותר (> 3 מ"מ). הוא גם מספק שיטה אפשרית להשתיל בדיקות גמישות כפולה צדדיות. נכון להיום, את הטכניקה נעשתה שימוש כדי להשיג in vivo נתונים הקלטה שונים מקליפת מוח החולדה.

Introduction

מערכי microelectrode הם כלי חיוני במדעי המוח, כמו גם יישומים קליניים מתפתחים כגון תותבות. בפרט, בדיקות מיקרו אלקטרודה לחדור לאפשר גירוי והקלטה של ​​פעילות עצבית באמצעות מגע הדוק עם תאים במוח, חוט השדרה ועצבים היקפיים. אתגר גדול עבור בדיקות עצביות מושתלים הוא יציבות ואריכות ימים של פונקציות הגירוי וצריבה. לימודי דוגמנות וניסיוני של האינטראקציה בין בדיקות microelectrode ורקמה עצבית הראו כי מנגנון אחד לשפלה הוא מיקרו קריעה של רקמה עצבית עקב תנועה היחסית קלה בין החללית והרקמות ^1-3. פתרון אחד הוא לפברק בדיקות גמישות שתתאמנה באופן הדוק יותר את מאפייני קשיחות חלק הארי של רקמה עצבית על מנת למזער micromotion יחסית. ככזה, פולימרים סרט דקים ביולוגית כגון polyimide וparylene אומצו כמו מצעים נוחים לmicroelecתרמס בדיקות ^4-8.

איזון של בדיקות גמישות הוא שהם קשה להכניס לתוך הרקמה העצבית. חוקרים לקחו גישות שונות כדי להקל על כניסה של בדיקות גמישות תוך שמירה על התכונות מכאניות רצויות. כיתה אחת של עיצובים משנה את הגיאומטריה הבדיקה הפולימר להגדיל נוקשות בסעיפים או צירים מסוימים תוך שמירה על תאימות בחלקים אחרים. זה הושג על ידי שילוב של צלעות או שכבות של חומרים אחרים ^9,10. גישה נוספת משתלבת ערוץ 3-D לעיצוב הבדיקה הפולימר כי הוא מלא בחומרים מתכלים ^11. בדיקה זו יכולה להיות התקשחה באופן זמני, ולאחר הכניסה המהותיות במתמוסס הערוץ ומתנקז החוצה. עם זאת, שיטות כגון אלה שאופן קבוע לשנות את הגיאומטריה של המכשיר המושתל הסופי עלולות לפגוע בחלק מהתכונות הרצויה של החללית גמישה.

שיטה אחת שעושה not לשנות את הגיאומטריה הבדיקה הסופית הוא לתמצת את מכשיר הפולימר עם חומרים מתכלים כדי להקשיח את המכשיר ^12-14 באופן זמני. עם זאת, יש חומרים מתכלים טיפוסיים הזמנות moduli של יאנג בסדר גודל קטן יותר מזה של סיליקון וכתוצאה מכך הייתי דורשים עובי גדול יותר כדי להשיג את אותה קשיחות. כראוי ציפוי הבדיקה יכולה לגרום לקצה מעוגל יותר או קהה, מה שהופך את ההחדרה קשה יותר. כמו כן, מאחר ציפויים נמסים נחשפים, קיים סיכון שלהם מתמוסס מייד עם מגע, או אפילו קרבה, עם הרקמה.

מחלקה נוספת של שיטות משתמשת בחומרי מצע בדיקה חדשנית המפחיתים בנוקשות לאחר שמושתלים לתוך רקמות. חומרים כאלה כוללים פולימרים צורת זיכרון ¹⁵ וnanocomposite מכאני אדפטיבית ^16. חומרים אלה מסוגלים להקטין במודולוס אלסטיות משמעותית לאחר כניסה, ויכולים לגרום לבדיקות שmatc באופן הדוק יותרשעות התכונות מכאניות של רקמה עצבית. עם זאת, בטווח השגה של קשיחות הוא עדיין מוגבל, ולכן ייתכן שהם לא יוכלו לספק שווי ערך קשיחות גבוה מאוד לחוטי סיליקון או טונגסטן. כך במקרה של בדיקות גמישות, כי הם מאוד ארוכים (לדוגמא> 3 מ"מ) או שיש להם נמוך מאוד נוקשות, ייתכן שעדיין תהיה צורך בשיטה של באופן זמני מצרף מקשח נוקשה יותר.

עוד שיטה מבטיחה שדווחה היא למעייל הסעות התקשות עם monolayer הרכבה עצמית קבוע (SAM) כדי להתאים אישית את האינטראקציה הפנים בין המעבורת והבדיקה גמישה ^17. כאשר יבש, החללית שומרת על המעבורת המצופה אלקטרוסטטי. לאחר כניסה, מים נודדים על גבי המשטח הידרופילי, להפריד את החללית מהמעבורת, כך שניתן לחלץ את המעבורת. חילוץ הסעות עם תזוזת חללית מופחתת הודגם (85 מיקרומטר). עם זאת, עם אינטראקציות אלקטרוסטטיות יחידות שעוצרות את הבדיקה כדי לאהוא מעבורת, יש סיכון מסוים של גלישת חללית ביחס למעבורת לפני ובמהלך כניסה.

פיתחנו שיטה שבה הבדיקה גמישה מחוברת למקשח עם חומר הדבקה biodissolvable זמני שמחזיק באופן מאובטח את החללית במהלך כניסה. הבדיקות בשימוש היו עשויים polyimide, שבו יש מודולוס אלסטיות בסדר הגודל של 2-4 GPA. מקשח היה מפוברק מסיליקון, עם מודולוס אלסטיות של ~ 200 GPA. כאשר מצורפים, את הנוקשות של סיליקון שולטת, בהנחיית כניסה. ברגע שמוכנס לתוך הרקמה, החומר הדבקה מתמוסס ומקשח מופק להחזיר את החללית לגמישות הראשונית שלה. בחרנו בפוליאתילן גליקול (PEG) כחומר הדבקה biodissolvable. PEG כבר בשימוש ביישומים מושתלים כגון בדיקות עצביות, הנדסת רקמות, ^ו11,18,19 משלוח סמים. עדות מסוימת הציעה כי PEG עשוי להחליש תגובת neuroinflammatory במוחרקמה ^18,20. לעומת חומרים אפשריים נוספים, ובכלל זה סוכרוז, קטית-Co-גליקולית חומצת פולי (PLGA), ואלכוהול פוליוויניל (PVA), יש PEG זמן פירוק בנוזלים ביולוגיים שהוא בקנה מידה של מתאים עבור רבים ניתוחי שתל (בסדר הגודל של עשרות דקות, תלוי במשקל מולקולרי). בנוסף, הוא מוצק בטמפרטורת חדר ונוזלי בטמפרטורות הנעות 50-65 ° C. רכוש זה עושה זה מתאים בעיקר לתהליך ההרכבה דיוקנו. יתר על כן, בדומה לSAM מתואר ^ב17, PEG המומס הוא הידרופילי, בהנחיית חילוץ של מקשח. גישה טובה זו מופעלת על ידי עיצוב רומן מקשח ותהליך הרכבה שיטתי המבטיחים כיסוי דביק מדי ויישור מדויק ודיר. בנוסף לתהליך ההרכבה, אנו מציגים את אופן יישום מקשח הנשלף במהלך ניתוח, כמו גם הליך במבחנה כדי להעריך חילוץ של Stiffener.

הפרוטוקול המובא במסמך זה מבוסס על ההנחה שהמשתמש מחזיק בדיקה microelectrode הפולימר גמישה. חלק מהפרוטוקול הנוגע הייצור של מקשח וההרכבה של חללית זו כדי מקשח מניח גישה לכלים נפוצים שנמצאו במתקן microfabrication. הפרוטוקול המתייחס להכנסה והוצאה עשוי להיות מבוצע במעבדה אוריינטציה מדעי המוח.

Protocol

1. הרכבה של Probe למקשח

חלק זה של הפרוטוקול מתאר ייצור של מקשח סיליקון, ואת ההרכבה של חללית פולימר סרט דק למקשח. איור 1 מדגים בדיקה עצבית פולימר טיפוסית יחד עם מקשח המוצע. הפרטים של העיצוב מקשח מוצגים באיור 2. התכונה החדשנית של העיצוב הזה היא רדוד "הפתילה" ערוץ פועל לאורכו המשמש להפצת דבק נוזלי במהלך עצרת. החלק הרחב יותר של מקשח הוא לשונית לטיפול בזמן הרכבה והחדרה כירורגית. מאגר בכרטיסייה מתחבר לערוץ. הרכיב מפוברק בין סיליקון באמצעות תהליכי microfabrication סטנדרטיים.

1. מקשח סיליקון עם ערוץ הפתילה היה מפוברק מרקיק סיליקון על המבודד (SOI) בעובי שכבת מכשיר שווה לעובי הרצוי של מקשח ( איור 3 א). טווח סביר של עובי מקשח הוא 20-100 מיקרומטר. מומלץ שהרוחב של מקשח להיות 20-30 מיקרומטר קטן יותר מאשר רוחב החללית, אשר מסייע למניעת הצפה של הדבק מממשק האג"ח לחלק העליון של החללית. ראשית ערוצי הפתילה הם באמצעות תהליך בוש הסטנדרטי (איור 3 ב) חרוט יבשים. בשלב בא, את הגיאומטריה מקשח מוגדרת על ידי לחרוט עוד שעוצר על שכבת תחמוצת הקבור (איור 3 ג). לבסוף, stiffeners פורסם על ידי תחריט הרטובה שכבת תחמוצת נקברה ב49% חומצה הידרופלואורית (איור 3D). לאחר שטיפה יסודית stiffeners, להשרות אותם במי deionized במשך 15 דקות.
2. הנח גלולה של פוליאתילן גליקול (PEG) של משקל המולקולרי 10,000 g / mol לתוך המאגר (איור 4). מחממים את מקשח ל65 מעלות צלזיוס, כך שPEG נמס ופתילות לערוץ על ידי פעולת נימים. לאחר מכן לקרר לטמפרטורת חדר כדי לחזק.
3. איור 5 מראה סכמטי של ונדר השבב להעיף להגדיר. הנח את מקשח במהופך על הבמה בסיס ונדר השבב להעיף, ולאחר מכן להרים את מקשח עם ראש הכלי. מניחים את החללית במהופך על הבמה הבסיס. השימוש בונדר השבב להעיף, ליישר מקשח והבדיקה ולאחר מכן להוריד את מקשח ולמקם אותו על גבי החללית.
4. שלב הבסיס של ונדר השבב להעיף צריך גוף חימום להחיל חום למצע. לאחר שהניח את מקשח, מחמם את ההרכבה שוב 65 ° C. אפשר לרגע אחד לPEG ליתיך מחדש ולהתחיל למלא את הממשק בין החללית ומקשח. מגניב כדי לחזק.
5. הפוך את המכלול שוב ולבדוק מלמעלה. לחמם לפי צורך כדי לאפשר PEG כדי למלא את הממשק בין החללית ומקשח לחלוטין. זה יכול להיות מוערך מבחינה ויזואלית מאז הבדיקה היא שקופה. כאסיפה יושבת על תנור החימום העליון (בדיקה-) צד כלפי מעלה, במקום 1-3 דואר באופן ידניכדורי Xtra של PEG המוצק על גבי הכרטיסייה, כך שהם נמסים על החללית, ומספקים חיזוק נוסף באזור זה (איור 6). לבסוף, לאפשר ההרכבה להתקרר כך שPEG מתמצק. בשלב זה, את המכלול מוכן להחדרה כירורגית.

2. החדרה והפקה

1. הר ההרכבה חללית-מקשח לmicromanipulator כפי שמודגמת באיור 7 א על ידי עמידה האחורית של מקשח לזרוע micromanipulator באזור הכרטיסייה. ניתן לעשות זאת עם קלטת או מלט דו צדדית, אך היזהר שלא ליצור קשר עם החללית עם דבק. באופן זמני לאבטח את קצה המחבר של החללית לmicromanipulator עם חתיכה קטנה של מרק דבק כזה שניתן להסיר בקלות עם כוח נמוך.
2. מקם את ההרכבה החללית על פני היעד ולהכניס את החללית עם מהירות כניסה הרצויה. מהירויות החדרת .13-.5 מ"מ / השני שימשו בעת פיתוח פרוטוקול זה.
3. מייד להסיר את קצה המחבר של החללית מmicromanipulator בעדינות ולתת לו לנוח על משטח סמוך, כגון יד שנייה מניפולטור (איור 7). זה חייב להיעשות לפני PEG מתחיל להתמוסס כדי להימנע מעקירתם הבדיקה.
4. לאפשר זמן לPEG לפזר. זה משך הזמן יהיה תלוי במשקל מולקולרי PEG ואזור המגע בין החללית ומקשח. לדוגמא, עם משקל מולקולרי PEG של 10,000 g / mol, בדיקה microelectrode כ -6 מ"מ ומקשח התאמה שהוא 306 מיקרומטר רחב, 15 דקות כבר מצאו להיות כמות מספקת של זמן. סעיף 3 של הפרוטוקול מציג שיטה לבדוק את זמן פירוק הנדרש. במהלך תקופה זו, חל בופר פוספט (PBS) באמצעות טפטפת סביב נקודת הכרטיסייה וההכנסה לפזר כל PEG שהוא מעל ליעד (איור 7C).
5. שימוש micropositioner ממונע, תתחיל חילוץ של מקשח ידי יישום עקירתם שלבמהירות של 5 מ"מ / שנייה 100 מיקרומטר. תנועה מהירה ראשונית זה עוזרת להתגבר על כל חיכוך הסטטי ולמזער תזוזת חללית. לאחר מכן, להשלים את החילוץ מקשח במהירות איטית יותר של כ 0.1 מ"מ / שני (איור 7D).
6. במקרה של ניתוח עצמו, להמשיך בהליכים רגילים כדי להחיל ג'ל, סיליקון, ו / או אקריליק שיניים באתר ההכנסה כדי לאבטח ולהגן על החללית, כפי שמודגם ^ב21.

3. מבחן ג'ל agarose

חלק זה של הפרוטוקול מתאר הליך להגדיר ולבחון את המיצוי של מקשח בג'ל agarose 0.6% המדמה את המאפיינים בתפזורת מכאניים, ה-pH, ומליחות של רקמת מוח ^17,22. מאז ג'ל הוא כמעט שקוף דרך מרחקים קצרים, ניתן לצפות הפרדה מקשח ועקירת בדיקה.

1. הכן פתרון של agarose 0.6% בופר פוספט (PBS). מערבבים בeleטמפרטורת vated לפזר אבקת agarose לחלוטין. יוצקים את התמיסה לתוך תיבת אקריליק רדודה; ג'ל צריך להיות 3/4- 1 בעמוק. לאפשר לג'ל להגדיר בטמפרטורת חדר למשך שעה.
2. להבטיח כי הג'ל הקשוח רווי עם PBS, כך שזה לא יתייבש, ולחמם את הג'ל ל37 ° C.
3. הגדר את micromanipulator, מערכת מצלמה מיקרוסקופית התיבה של agarose ג'ל, וכפי שמוצג באיור 8.
4. הכנס fiducial התייחסות זכוכית לתוך הקופסה של הג'ל על ידי החלקתה בין ג'ל והצד של הקופסה (איור 8). השתמש בבחירת שיניים לרבע את התכונות על fiducial ההתייחסות לשדה הראייה של המיקרוסקופ הדיגיטלי.
5. הר ההרכבה החללית לmicromanipulator כמתואר בשלב 2.1.
6. מקם את ההרכבה החללית על פני ג'ל על 1 מ"מ מאחורי fiducial ההתייחסות.
7. הכנס את החללית לתוך הג'ל, שימוש במצלמה כדי להנחות אותו לעומק רצוי בשדה הראייה.
8. מייד להעביר את קצה המחבר של החללית לנוח על משטח סמוך.
9. בצע את כל התאמות הנדרשות לתמונת המצלמה להתמקד בבדיקה (תכונות fiducial ההתייחסות עשויות להיות קצת מחוץ לפוקוס). קח את תמונת מצב של המיקום החללית.
10. לאפשר PEG לפזר (הפעם עשוי להשתנות, ולמעשה עשוי להיות פרמטר שנבדק). החל PBS ליד הכרטיסייה לפזר PEG שהוא מעל לג'ל.
11. התחל לכידת וידאו אם רוצה, ולהתחיל הפקת מקשח כמתואר בשלב 2.5. כאשר החילוץ הושלם, לקחת תמונה סופית של מיקום חללית.
12. השתמש בכלי עיבוד תמונה כדי להשוות את התמונות לפני ואחרי החילוץ מקשח. השתמש בתכונות בfiducial ההתייחסות הנראות בשדה הראייה לרישום (ליישר) התמונות. לכייל את קנה המידה של התמונה על סמך הגודל של תכונות ידועות על הבדיקה. מדוד את המרחק של תזוזת חללית.

תוצאות

טכניקת החדרה זו משמשת בשילוב עם בדיקות LLNL סרט דק polyimide, אשר חלפו ISO 10993 סטנדרטים biocompatibility ומיועדים להשתלה כרונית. בדיקה polyimide סרט דק אופיינית מודגמת באיור 1 יחד עם מקשח סיליקון שהוא מ"מ כ 10 ארוך באזור הצר. יש מקשח ערוץ זה הפתילה אחד מהם פועל לאורכה, כפי שמוצג

Discussion

השיטה המתוארת כאן מספקת תהליך מבוקר היטב לצרף בדיקות פולימר סרט דק לstiffeners הנפרד עם דבק biodissolvable. כמו כן מוצג הנו ההליך הניתוחי המומלץ ליישם stiffeners הנשלף אלה וטכניקה כדי לאמת את ההליך במבחנה לתצורת חללית-מקשח נתון. מאז מקשח יכול להתבצע באופן שרירותי נוקשה, השיטה יכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene glycol, 10,000 g/mol	Sigma Aldrich	309028
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Flexible Sub-micron Die Bonder	Finetech	Fineplacer lambda
Micromanipulator	KOPF	1760-61
Digital Microscope	Hirox	KH-7700
Dual Illumination Revolver Zoom Lens	Hirox	MXG-2500REZ
Precision Motorized Actuator	Newport	LTA-HS	w/ CONEX-CC controller