生体溶解性接着剤で取り付けられている硬質補強材を用いた柔軟神経プローブの挿入

要約

柔軟な神経微小電極プローブの挿入は、ポリエチレングリコール（PEG）を有する剛性補剛材にプローブを取り付けることによって有効になっている。独自の組立工程は、均一で再現性のある添付ファイルを確実にします。組織内に挿入した後、PEGを溶解し、補強材を抽出する。 インビトロ試験法は、アガロースゲル中の技術を評価する。

要約

生体適合性の薄膜ポリマーから作られる神経インタフェースデバイス用の微小電極アレイは、可撓性材料は、微動により引き起こされる有害な組織反応を最小限に抑えることができるので、機能的な寿命を延長していることが期待される。しかしながら、それらの柔軟性は、正確に神経組織内に挿入されるのを防止する。この記事では、一時的にプローブを正確に、外科的挿入を容易にするために、生体溶解性ポリエチレングリコール（PEG）を使用し、剛性補強材に柔軟な微小電極プローブを接続する方法を示しています。ユニークな補強材の設計は、プローブの長さに沿ったPEG接着剤の均一な分布を可能にする。フリップチップ、マイクロエレクト​​ロニクスのパッケージで使用される一般的なツールは、補強材への正確で再現性の高いアライメントとプローブの取り付けを可能にします。プローブおよび補強材を外科その後PEGは補強材がプローブを出る抽出できるように溶解させ、一緒に移植される所定の位置に。最後に、 インビトロ試験法は、脳組織のアガロースゲルモデルにおける補強材抽出を評価するために使用される。移植のこのアプローチは、長い柔軟なプローブ（> 3ミリメートル）のために特に有利であることが判明している。また、両面フレキシブルなプローブを注入する実現可能な方法を提供する。今日まで、この技術は、ラット皮質からの種々 の生体内の記録データを取得するために使用されている。

概要

微小電極アレイは、神経科学の不可欠なツールだけでなく、このような人工装具などの新興臨床応用である。特に、貫通微小電極プローブは、脳、脊髄、および末梢神経細胞との密接な接触を介して神経活動の刺激と記録を可能にする。移植された神経プローブの主要な課題は、刺激および記録機能の安定性と寿命です。微小電極プローブや神経組織の間の相互作用のモデル化と実験的研究では、分解のための1メカニズムは、プローブと組織^1-3の間のわずかな相対運動に起因する神経組織の微小断裂であることを示唆している。一つの解決策は、相対的な微動を最小化するために、より密接に神経組織の嵩剛性特性に一致する柔軟なプローブを製造することである。このように、ポリイミドやパリレン等の生体適合性の薄膜ポリマーは、マイクロエレクト​​ロニクスのための良好な基質として採用されているtrodeプローブ^4-8。

フレキシブルプローブのトレードオフは、それらが神経組織に挿入することが困難であることである。研究者は、望ましい機械的特性を維持しながら、柔軟なプローブの挿入を​​容易にするために様々なアプローチをとっている。デザインの一つのクラスは他の部分のコンプライアンスを維持しつつ、特定のセクション又は軸の剛性を高めるために、ポリマープローブの幾何学的形状を変更する。これは、リブまたは他の材料の層^9,10を組み込むことによって達成された。別のアプローチは、生分解性材料¹¹が充填されたポリマープローブの設計に3-Dチャネルを統合する。このプローブは、一時的に剛化、チャネル溶解し、ドレインアウト挿入後の材料することができる。ただし、恒久的に最終的な埋め込まれた装置のジオメトリを変更するこのような方法は、柔軟なプローブの望ましい機能の一部が損なわれることがあります。

Nを行う一つの方法最終的なプローブ形状を変えるotのは、一時的にデバイス^{12から14を}補強するために、生分解性材料とポリマーデバイスをカプセル化することです。しかしながら、典型的な生分解性材料は、シリコンよりも小さい大きさのヤング率次数を有し、その結果、同一の剛性を達成するために、より大きな厚さ​​を必要とするであろう。適切にプローブを塗布して、挿入をより困難に、より丸みを帯び、または丸い先端になることがあります。溶解可能なコーティングが露出しているため、また、それらを組織に接触、あるいは近接するとすぐに溶解するおそれがある。

方法の別のクラスは、組織内に移植された後、剛性が低減する新規プローブ基板材料を使用する。このような材料は、形状記憶ポリマー¹⁵と機械的に適応ナノ複合材料^16を含む。これらの材料は、挿入後の弾性率が著しく低下することができ、より密接にMATCプローブをもたらすことができる時間神経組織の機械的特性。しかしながら、剛性の達成可能な範囲は依然として限られているので、シリコン又はタングステンワイヤに非常に高い剛性と等価を提供することができない可能性がある。極めて低い剛性を有する非常に長い（ 例えば、> 3 mm）であるか、または可撓性のプローブの場合には、一時的に、より剛性の補強材を取り付ける方法が依然として必要とされ得る。

報告されたまた別の有望な方法は、コーティングするために、シャトルと柔軟なプローブ¹⁷との間の表面の相互作用をカスタマイズするための恒久的な自己組織化単分子膜（SAM）で補強シャトルです。乾燥時には、プローブは静電塗装、シャトルに準拠しています。挿入後、水をシャトルが抽出できるように、シャトルからプローブを分離する、親水性表面上に移行する。減少プローブ変位とのシャトル抽出（85μm）を実証した。ただし、静電相互作用がTにプローブを保持した彼シャトルは、挿入前との間にシャトルに比べてプローブの滑りのいくつかのリスクがあります。

我々は、可撓性プローブ​​がしっかりと挿入中にプローブを保持するテンポラリ生体溶解性接着材料を有する補強材に付着させる方法を開発した。使用したプローブは2-4 GPaの程度の弾性率を有するポリイミドで作られていた。補強材を約200 GPaの弾性率と、シリコンから製造した。取り付けられたとき、シリコンの剛性は、挿入を容易にする、支配する。一度組織に挿入、接着材料は溶解し、補強材は、その初期の柔軟性にプローブを復元するために抽出される。我々は、生体溶解性接着材料として、ポリエチレングリコール（PEG）を選択した。 PEGは、例えば、神経プローブ、組織工学、薬物送達^11,18,19等の移植された用途で使用されている。いくつかの証拠は、PEGは、脳内の神経炎症応答を弱める可能性が示唆されました組織^18,20。スクロース、ポリ乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）、およびポリビニルアルコール（PVA）を含む他の可能な材料に比べ、PEGの順に（多くのインプラント手術のために適切なスケールである生物学的液体中の溶解時間を有する分子量に応じて数十分）。また、50〜65℃の範囲の温度、室温と液体で固体このプロパティは、我々の精密組立プロセスのために特に適している。また、SAMと同様の¹⁷に記載され、溶解したPEGは、補強材の抽出を容易にする、親水性である。この有利なアプローチは、均一な接着剤の適用範囲および正確で再現性のある位置合わせを確実に新たな補強材の設計および系統的な組立工程で有効になっています。組立工程に加えて、我々は、手術中に取り外し可能な補強材を実現する方法、ならびにSTIの抽出を評価するためのインビトロ手順を示しffener。

ここに提示されたプロトコルは、ユーザーが柔軟なポリマー微小電極プローブを有していることを前提としています。補強材は、このプローブの補強材とアセンブリの製造を関連プロトコルの一部は、微細加工施設で見られる一般的なツールへのアクセスを前提としています。挿抜に関するプロトコルは、おそらく神経科学指向の実験室で行われることになる。

プロトコル

1。補強材へのプローブの組立

プロトコルのこのセクションでは、補強材、シリコン補強材の製造、および薄膜ポリマープローブの組み立てを説明しています。 図1に提案された補強材と一緒に、典型的なポリマー神経プローブを示している。補強材の設計の詳細は、図2に示されている。この設計の新規な特徴は、組み立て中に液状接着剤を分配するために使用され、その長さに沿って浅い「ウィッキング」チャネルである。補強材の広い部分は、アセンブリおよび外科的挿入の際に処理するためのタブです。タブのリザーバは、チャネルに接続します。成分は、標準的な微細加工プロセスを用いてシリコンから製造される。

1. ウィッキングチャネルを有するシリコン補強材は、補強材の所望の厚さに等しいデバイス層の厚さ（シリコン·オン·インシュレータ（SOI）ウェハから作製した図3A）。補強材の厚さの合理的な範囲は20〜100μmである。これは、補強材の幅はプローブの上面に接合界面から接着剤のオーバーフローを防ぐことができますプローブ幅より20〜30μmで小さくなることをお勧めします。最初のウィッキングチャンネルをドライエッチング標準ボッシュ法（ 図3B）を使用しています。次に、補強材の形状は、埋め込 ​​み酸化物層（ 図3C）で停止長いエッチングによって規定される。最後に、補剛材49％フッ化水素酸（ 図3D）中の埋め込 ​​み酸化物層を湿式エッチングすることによって解放される。補剛材を徹底的にすすいだ後、15分間それらを脱イオン水に浸す。
2. 貯水池への分子量10,000 g /モル（ 図4）のポリエチレングリコール（PEG）のペレットを配置します。 PEGが溶融し、毛管作用によってチャネルに発散するように65℃に補強材を加熱する。そして、固化し、室温まで冷却。
3. 図5に、セットアップフリップチップボンダーの概略図を示す。ツールヘッドに補強材をピックアップして、フリップチップボンダーのベースステージに逆さまに補強材を配置します。ベースステージに逆さまにプローブを配置します。フリップチップボンダーを用いて、補強材とプローブを合わせた後、補強材を下げ、プローブの上に置きます。
4. フリップチップボンダーのステージは、ベース基板を加熱するための加熱素子を有するべきである。補強材を配置した後、65℃に再び集合体を加熱しPEGの1分が再溶融して、プローブと補強材との間のインタフェースを埋めるために始めることができます。固化させる冷却する。
5. 以上のアセンブリを回して、上から検査します。 PEGが完全にプローブと補強材との間のインターフェースを充填することを可能にするために、必要に応じて再加熱する。プローブは透明であるので、これは視覚的に評価することができる。アセンブリは、トップ（プローブ）アップサイドヒーターの上に座っているように、手動で1-3 Eを配置タブの上に固体PEGのエクストラペレット彼らはこの地域で、追加の補強（ 図6）を提供する、プローブの上に溶融するように。最後に、アセンブリはPEGが凝固するように冷却する。この時点で、アセンブリは、外科的挿入の準備ができている。

2。挿抜

1. タブ領域でのマイクロマニピュレータアームに補強材の背面を接着することにより、図7（a）に示すように、マイクロマニピュレータ、プローブ·補強材アセンブリを取り付けます。これは、両面テープや接着剤で行われますが、接着剤でプローブを連絡しないように注意してくださいすることができる。一時的に低い力で容易に除去できるような接着剤、パテの小片にマイクロマニピュレータへのプローブのコネクタ端部を固定する。
2. ターゲット上にプローブアセンブリを配置し、所望の挿入速度でプローブを挿入します。このプロトコルを開発する際に0.13〜0.5ミリメートル/秒の挿入速度は、使用された。
3. すぐに静かにマイクロマニピュレータからのプローブのコネクタの端を削除して、このような第二マニピュレータアーム（ 図7B）として、近くの台の上に置きます。 PEGは、プローブを移動さ避けるために溶解し始める前に、これが行われなければならない。
4. PEGは溶解するための時間を確保します。この時間量は、PEGの分子量とプローブと補強材との接触面積に依存するであろう。例えば、10,000 g /モル、微小電極プローブを約6mmと306μm幅であるマッチング補強材のPEG分子量が、15分で十分な時間であることが見出されている。プロトコルの第3節では、必要な溶解時間をテストするための方法を提示します。この時間の間に、ターゲット（ 図7C）の上にある任意のPEGを溶解するためにタブを挿入点の周りスポイトを用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を適用する。
5. 電動マイクロポジショナーを用いて、変位を適用することにより、補強材の抽出を開始する5ミリメートル/秒の速度で100μmである。この最初の速い動きは、どの静止摩擦を克服し、プローブ変位を最小限に抑えることができます。その後、約0.1ミリメートル/秒（ 図7D）の低速で補強材の抽出を完了します。
6. 実際の手術例では^、21で示すように、プローブを固定し、保護するために、挿入部位でゲル、シリコーンおよび/ ​​または歯科アクリルを適用し、通常の手順に進みます。

3。アガロースゲルテスト

プロトコルのこのセクションでは、バルクの機械的性質、pH、および脳組織^17,22の塩分濃度を近似する0.6％アガロースゲル中の補強材の抽出を検討するセットアップと手順について説明します。ゲルは、短い距離を介して、ほぼ透明であるため、補強材分離およびプローブ変位を観察することができる。

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.6％アガロース溶液を調製する。エレメントで混合完全アガロース粉末を溶解するための温度vated。浅いアクリルボックスに溶液を注ぐ。ゲルが深い中3/4- 1でなければなりません。時間室温で設定されたゲルを可能にする。
2. それが乾燥しないように硬化ゲルをPBSで飽和していることを確認し、37℃にゲルを加熱し
3. 図8に示すように、マイクロマニピュレータ、アガロースゲルの箱、および顕微鏡カメラシステムをセットアップする。
4. ゲルと箱の側面（ 図8）の間にスライドさせ、ゲルの箱にガラスの参照基準を挿入します。デジタル顕微鏡の視野に、参照基準上の特徴を二乗する歯科ピックを使用してください。
5. ステップ2.1で説明したように、マイクロマニピュレータにプローブアセンブリを取り付けます。
6. 約1ミリメートルの参照基準の背後にあるシリカゲルのプローブアセンブリを配置します。
7. 視野内の所望の深さにそれを導くためにカメラを使用して、ゲル中にプローブを挿入する。
8. すぐに近くの表面に載るようにプローブのコネクタの端を移動します。
9. プローブ（参照基準の特徴は、わずかに焦点が合っていてもよい）に集中するカメラ画像に対して必要な調整を行います。プローブ位置のスナップショットを作成します。
10. PEGは（今回は変更になる場合があり、実際にテストされるべきパラメータであってもよい）を溶解することができます。ゲルの上にある、PEGを溶解するために、タブの近くに、PBSを適用します。
11. 必要に応じて、ビデオキャプチャを開始し、ステップ2.5で説明したように補強材の抽出を開始します。抽出が完了すると、プローブ位置の最終的なスナップショットを作成します。
12. 補強材の抽出前後の画像を比較する画像処理ツールを使用してください。 （位置合わせ）画像を登録する視野に表示され、参照基準上の機能を使用してください。プローブ上の既知のフィーチャのサイズに基づいて画像の縮尺を校正。プローブ変位の距離を測定します。

結果

この挿入技術は、ISO 10993生体適合性基準に合格しており、慢性の移植のために意図されているLLNL薄膜ポリイミドプローブと組み合わせて使用​​した。典型的な薄膜ポリイミドプローブは、狭い領域での長約10mmであるシリコン補強材と共に図1に示されている。 図2に示すように、この補強材は、その長さに沿って実行される1つウィッキングチャネルを?...

ディスカッション

ここで説明する方法は、生体溶解性接着剤を用いて別々の補強材に薄膜ポリマープローブを取り付けるための十分に制御された方法を提供する。また、これらの取り外し可能な補強材と所定のプローブ·補強材構成に対して、in vitroでの手順を検証する技術を実現するための推奨の外科的処置がある発表した。補強材を任意に硬質にすることができるので、方法は、比較的長いプローブ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene glycol, 10,000 g/mol	Sigma Aldrich	309028
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Flexible Sub-micron Die Bonder	Finetech	Fineplacer lambda
Micromanipulator	KOPF	1760-61
Digital Microscope	Hirox	KH-7700
Dual Illumination Revolver Zoom Lens	Hirox	MXG-2500REZ
Precision Motorized Actuator	Newport	LTA-HS	w/ CONEX-CC controller