تعزيز بقاء وتمايز الخلايا الجذعية العصبية مع الليفين وعامل نمو الكوكتيلات بعد إصابة الحبل الشوكي الشديدة

Summary

واستخدمت المصفوفات الليفين التي تحتوي على عوامل النمو للاحتفاظ الخلايا الجذعية العصبية المطعمة في مواقع كاملة transection الحبل الشوكي. الخلايا المطعمة شغلها تماما في تجويف الآفة ومتباينة إلى عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية التي امتدت إلى محاور المضيف الحبل الشوكي لمسافات طويلة.

Abstract

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يمكن تجديد الذات والتمايز إلى خلايا عصبية والدبقية. يمكن NSCs زرع الخلايا العصبية المفقودة واستبدال الدبقية بعد إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، ويمكن أن تشكل التبديلات وظيفية لإعادة الاتصال شرائح الحبل الشوكي فوق وتحت الآفة. تم دراسات سابقة التطعيم الخلايا الجذعية العصبية محدودة بسبب بقاء الكسب غير المشروع غير مكتملة داخل تجويف آفة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك، لم تتبع الأمثل للبقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز، وتمديد العملية. أخيرا، في الدراسات السابقة، تم الإبلاغ عن NSCs الفئران مثقف عادة على التمايز إلى الدبقية عندما المطعمة إلى الحبل الشوكي المصاب، بدلا من الخلايا العصبية، إلا إذا كان مدفوعا مصير لنوع من الخلايا المحددة. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا أساليب جديدة لتحسين البقاء على قيد الحياة، والتكامل وتمايز NSCs لمواقع اصابات النخاع الشوكي حتى شديدة. NSCs تم عزل حديثا من الجنينية يوم 14 الحبل الشوكي (E14) من مستقر المعدلة وراثيا فيشر 344 خط معربا عن الفئران الخضراء فلوريداكانت جزءا لا يتجزأ uorescent البروتين (GFP) وإلى المصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو؛ هذه الصيغة تهدف إلى الإبقاء على الخلايا المطعمة في تجويف الآفة ودعم بقاء الخلية. تم زرع NSCs في الليفين / عامل النمو كوكتيل بعد أسبوعين الصدري مستوى 3 (T3) كاملة transections الحبل الشوكي، وبالتالي تجنب فترات الذروة من الالتهابات. الطعوم الناتجة تملأ تجويف تماما الآفة ومتباينة في كل من الخلايا العصبية، الذي مدد محاور في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة بشكل ملحوظ، والدبقية. أدى الطعوم من NSCs الإنسان مثقف التعبير عن GFP في نتائج مماثلة. وبالتالي، يتم تعريف الأساليب لتحسين العصبية ترقيع الخلايا الجذعية والبقاء وتحليل النتائج في الجسم الحي.

Introduction

إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) غالبا ما يضر ليس فقط مساحات بيضاء المسألة التي تحمل إشارات من وإلى الدماغ، ولكن أيضا المادة الرمادية المركزية، مما تسبب في فقدان قطعي من interneurons والخلايا العصبية الحركية. نتيجة لاصابات النخاع الشوكي هو خسارة كل من المحرك وظيفة الحسية تحت الآفة. وللأسف، فإن الكبار الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تتجدد من تلقاء أنفسهم، مما أدى إلى عجز وظيفي دائم ^1. وبالتالي، وإعادة بناء النخاع الشوكي المصاب الكبار وتحسين المحركات والحسية وظيفة اللاإرادي هو هدف مهم من البحوث اصابات النخاع الشوكي. الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، سواء كانت معزولة مباشرة من الجنينية أو الكبار CNS، هي خلايا مرشح مقنعة لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة والدبقية. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا لديها القدرة على تشكيل التبديلات وظيفية جديدة لاستعادة التوصيل عبر محور عصبي ^2،3 موقع الآفة.

حتى الآن، لم يكن هناك توضيح مفصل لالتشريحية، electrophysiological والآثار السلوكية لتشكيل تتابع الخلايا العصبية عن طريق زرع NSCs بعد اصابات النخاع الشوكي الشديدة. هناك عدة أسباب لذلك: أولا، NSCs زرع الجنين أو الأنسجة CNS البقاء على قيد الحياة سيئة عندما المطعمة في تجاويف آفة كبيرة. تظهر الدراسات السابقة فقدان الخلية في وقت مبكر كبيرة، وترك كبيرة فارغة تجاويف الآفة الكيسي ^4،5. في بعض الدراسات الخلايا المطعمة ستقسم في وقت لاحق وملء تجويف آفة ^4،5، ولكن هذا قد يحدث بعد تأخير لأيام وأسابيع، واللاحقة موقع الآفة ملء قد لا تكون كاملة أو متسقة. الثاني، وهو نظام تتبع فعال التي توفر بيانات سليمة على البقاء على قيد الحياة الخلوية، والتمايز / النضج، وثمرة من زرع NSCs كان مطلوبا. معظم الدراسات المبكرة استخدمت تقدمي ووضع العلامات إلى الوراء لتتبع توقعات محور عصبي من زرع ^2،3. ومع ذلك، هذه التقنيات جزئيا فقط، وغالبا ما وصفت التوقعات محور عصبي غير واضح الناشئة من الخلايا المطعمة، وأساليب التتبع هي subjecر إلى التحف التي يسببها تسرب الصبغة خارج الخلايا المزروعة. استخدمت الجماعات الأخرى علامات العصبية محددة الإنسان لتسمية التوقعات محور عصبي بعد زرع الجنين NSCs الإنسان في القوارض إصابة الحبل الشوكي ^5،6. ومع ذلك، في هذه الدراسات، وxenografts لم تنج باستمرار أيضا. في الآونة الأخيرة، تم استخدام التسليم الفيروسية من الجين مراسل GFP لتسمية NSCs مثقف ^7،8. ومع ذلك، كان GFP التعبير في كثير من الأحيان غير متناسقة ويمكن أسفل ^ينظم-7. في الآونة الأخيرة، واستخدام الفئران المعدلة وراثيا المانحة أو الفئران معربا عن ثابت الجين المراسل، GFP، أو الفوسفاتيز القلوي المشيمة البشرية، قد تحسنت بشكل كبير تتبع زرع الخلايا الجذعية العصبية / الأسلاف في الجسم الحي ^9،11. الثالثة، العديد من الدراسات تشير إلى أن الفئران في المختبر NSCs مثقف المستمدة إما من الجنينية أو الكبار CNS التفريق حصرا في الأنساب الدبقية عند زرعها في الوسط من مجلس النواب الشوكي الكبار سليمة أو جرحواد ^7،12،13، على الرغم من أن هذه الخلايا الجذعية العصبية قادرة على التمييز في كل من الخلايا العصبية والدبقية في المختبر، مشيرا إلى أن البيئات المحلية قد تملي مصير الخلايا الجذعية. بدلا من ذلك، NSCs مثقف، لا سيما تلك المتأتية من الجهاز العصبي المركزي الكبار، قد يكون الجوهرية الملكية بواسطة defaulty على التمايز إلى الأنساب الدبقية في الجسم الحي ^13.

بسبب القيود التي نوقشت أعلاه، وضعت مجموعتنا مؤخرا بروتوكول جديد لتحسين الجنينية تتبع مجلس الأمن القومي، وبقاء، وتمايز / نضوج الكبار في الحبل الشوكي بجروح بالغة. لفترة وجيزة، بدأنا مع مستقرة المعدلة وراثيا خط فيشر 344 الفئران inbreed تعبر عن الجين مراسل GFP أن يديم GFP التعبير بعد زرع في الجسم الحي ^14. المقبل، استخدمنا NSCs معزولة حديثا من يوم الجنينية 14 فيشر 344 الحبل الشوكي، ومرحلة التنمية التي يحتفظ القدرة على توليد كل من الخلايا العصبية والدبقية. أخيرا، ونحن جزءا لا يتجزأ منNSCs فصلها حديثا في مصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو ^15-17 الإبقاء على الخلايا وتوزيعها بالتساوي داخل تجويف آفة كبيرة، وتهدف لدعم بقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز والتكامل. وضعت الطعوم في مواقع T3 transection كاملة، بعد أسبوعين من اصابة في الحبل الشوكي. هذه الخلايا المطعمة شغل باستمرار مواقع transection كاملة ومتباينة في الخلايا العصبية وفيرة التي امتدت أعداد كبيرة من محاور عصبية في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة ^18. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الطعوم مثقف الخلايا الجذعية العصبية البشرية لنقص المناعة الفئران ^18.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية VA-سان دييغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC). اتباع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لمختبر الرعاية الحيوانية وسلامة تامة. الحيوانات لديها حرية الوصول إلى الغذاء والماء طوال فترة الدراسة ويتم التعامل على نحو كاف لتقليل الألم والانزعاج.

1. إعداد الليفين مكونات تحتوي على عامل نمو كوكتيل

1. حل 25 ملغ الفئران الفيبرينوجين في 0.5 مل PBS الحصول على 50 ملغ / مل 2X محلول المخزون (انظر الجدول مواد). الفيبرينوجين من الصعب حل وينبغي أن توضع في الحاضنة 37 درجة مئوية أو بالحمام المائي واهتزت كل 5-10 دقيقة لمدة 1-2 ساعة.
2. حل 100 الثرومبين الفئران للامم المتحدة في 2 مل من 10 ملي العقيمة و CaCl ₂ للحصول على 50 U / مل 2X محلول المخزون.
3. حل عوامل النمو في برنامج تلفزيوني في تركيزات التالية للحصول على حل 100 ميكرولتر الأسهم: 1 ملغ / مل: عامل التغذية العصبية؛ NT-3 (تركيز الأسهم المرتفعة كما التسريب داخل القراب في الجسم الحي ^{19)؛ 200 ميكروغرام / مل: GDNF؛ IGF؛ bFGF؛ صندوق تعديل العولمة الأوروبي؛ PDGF؛ aFGF؛ HGF (أعلى بحوالي 1،000 العاشر من استخدامها لزراعة الخلايا).}
4. حل 25 ملغ MDL28170 (calpain المانع) في 1.3 مل DMSO للحصول على 50 ملي حل DMSO الأوراق المالية، ومن ثم تمييع 50X في برنامج تلفزيوني للحصول على 1 ملي محلول المخزون.
5. مزيج 100 ميكرولتر من كل مكون عامل النمو و 100 ميكرولتر من MDL28170 (1 ملي حل الأسهم) لإنتاج 1،000 ميكرولتر عامل النمو كوكتيل الحل (الشكل 1).
6. مزيج 500 ميكرولتر حل الأسهم 2X الفيبرينوجين مع 500 ميكرولتر عامل النمو كوكتيل للحصول على حل 25 ملغ / مل العمل الفيبرينوجين تحتوي على عوامل النمو وقسامة في 10 أو 20 ميكرولتر للتخزين في -70 درجة مئوية. الحل هو مستقر لمدة تصل إلى 12 شهرا في -70 درجة مئوية.
7. وبالمثل، مزيج 500 ميكرولتر الثرومبين الحل 2X مع 500 ميكرولتر الأسهم عامل النمو كوكتيل للحصول على 25 U / مل حل الثرومبين عمل تتضمن عوامل النمو وقسامة في أحجام مماثلة 10 أو 20 ميكرولتر لتخزين ور -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
8. في يوم التطعيم، ضع الكوكتيلات الفيبرينوجين وعامل النمو التي تحتوي على الثرومبين على الجليد حتى تمتزج مع الخلايا.

2. T3 العمود الفقري الحبل Transection

1. تخدير البالغات فيشر 344 الفئران او الجرذان عارية athymic باستخدام أساليب مقبولة. يتم تخدير المواضيع بعمق، عند الاستجابة للذيل ومخلب قرصة غائبة تماما. ملاحظة: نحن عادة استخدام الفئران 150-200 غرام 180-220 غرام أو فيشر athymic الفئران، وكوكتيل التخدير (2 مل / كغ) من الكيتامين (25 ملغ / مل)، زيلازين (1.3 ملغ / مل) وآسيبرومازين (0.25 ملغ / مل).
2. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف أو إصابة العينين في حين أن الحيوانات هي تحت التخدير.
3. حلق منطقة الصدر العلوية وتنظيف البشرة مع بتدين.
4. قطع الجلد والعضلات باستخدام شفرة رقم 15، فضح T3 فقرة باستخدام ضام الجراحية، وإجراء الثقب في T3 فقرة لفضح T3 / 4 الحبل الشوكي باستخدام مقراض.
5. جعل خط الطولgitudinal شق خط الوسط في الجافية من حوالي 2 ملم طول باستخدام شفرة رقم 11.
6. وضع مقص قطع القزحية تحت الجافية لخفض الحق الجانبي الحبل الشوكي بأكمله. جعل خفض آخر على نفس الجانب 1.5 ملم أكثر cadually.
7. نضح الأنسجة الحبل الشوكي بين قطع اثنين من شرائح حادة مع 23 G إبرة متصلة معتدلة الشدة فراغ. استخدام التحقق البصرية لضمان transection كاملة البطني وأفقيا. وهذا إكمال تنصيف الجانبية.
8. تمديد الآفة إلى الحبل الشوكي transection كاملة العرض، ووضع مرآة شقوق في hemicord اليسرى. محاولة لمغادرة الجافية سليمة، وغيرها من القطع الأول، الإبقاء على شركة المصفوفة الكسب غير المشروع / الليفين في موقع الآفة عندما المطعمة بعد أسبوعين.
9. خياطة العضلات، وتطبيق مسحوق المضادات الحيوية والأساسية الجلد.
10. حقن أفرز اللبن (3 مل) رينغر، Bannamine (2.5-5 ملغ / كلغ) والأمبيسلين (80-100 ملغ / كلغ) (انظر الجدول مواد) فورا بعد الجراحة ومايالفئران ntain في حاضنة دافئة حتى يتم إعادة تأسيس الحراري.
11. إفراغ المثانة وحقن الحل رينغر والأمبيسلين مرتين في اليوم لمدة أسبوعين تقريبا حتى إقامة المثانة منعكس إفراغ (الشكل 1B).

3. إعداد طازجة تنفصل يوم الجنينية 14 الحبل الشوكي العصبية الخلايا الجذعية

1. الحصول inbreed المعدلة وراثيا الفئران GFP F344 (F344-تيراغرام (UBC-EGFP) F455Rrrc) من الجرذ الموارد ومركز الأبحاث، جامعة ولاية ميسوري.
2. حقن 40 ميكروغرام دي الغليسين ^10، [مد علاء ^{6]-Leuteinizing} هرمون إفراز هرمون Ethylamide (ال اتش ار اتش) المخفف في برنامج تلفزيوني بتركيز 200 ميكروغرام / مل الغشاء البريتونى (IP) في الفئران الإناث الناضجة (8 أسابيع أو أكثر) بعد 2 ساعة -3 ضوء الاستقراء لتزامن جمع الأجنة.
3. تتزاوج مع ناضجة GFP متماثلة اللواقح أو متخالف بين عشية وضحاها الفئران الذكور بعد 4 أيام الحقن.
4. جمع الأجنة في الأيام 13،5-14،5 postcoitus(الكمبيوتر) في المخزن HBSS الباردة، ودراسة GFP التعبير تحت "NightSea" المصباح وتصفية نظارات (BLS1 - بلوستار المصباح ونموذج VG1 مرشح حاجز) أو المجهر الفلورسنت.
5. تشريح النخاع الشوكي من جو معقم و مطهر من كل الجنين GFP إيجابية وإزالة السحايا المغطي وتعلق العقد الشوكي مع مقص قطع القزحية والمجوهرات غرامة ملقط.
6. جمع النخاع الشوكي تشريح في 2 العازلة HBSS الباردة مل في أنبوب 15 مل cornical والحفاظ على الجليد.
7. اتباع المرجعية رقم 20 لفصل النخاع الشوكي تشريح:
   1. لفترة وجيزة، إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين EDTA-إلى أنبوب يحتوي النخاع الشوكي تشريح (عدة الحبال يمكن هضمها معا، يمكن توليد خلايا الحبل 1 بما فيه الكفاية لكسب غير مشروع من موضوع واحد) وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة.
   2. وقف رد الفعل التربسين وذلك بإضافة 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS في أنبوب الطرد المركزي والأنسجة في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
   3. في resuspend الأنسجة في 2 مل المتوسطة Neurobasal المشتركntaining 2٪ B27، ويسحن أنسجة الحبل الشوكي باستخدام أصغر تدريجيا pipets باستور مصقول النار.
   4. الطرد المركزي الخلايا في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة، resuspend في 2 مل من المتوسطة Neurobasal تحتوي على B27، وخلايا التصفية مع 40 ميكرون تصفية خلية مصفاة.
8. عد الخلايا مع عدادة الكريات وتقسيم الخلايا بالتساوي الى قسمين أنابيب إيبندورف.
9. الطرد المركزي الخلايا وإزالة طاف (مطلوبة 1-2 دقيقة إلى سحب جميع طاف مع طرف فراغ منخفض) بحيث لن تضعف الكوكتيلات عامل النمو من خلال ما تبقى طاف بعد اعادة تعليق الخلايا.
10. في resuspend كل شوط من الخلايا في الفيبرينوجين أو حل الثرومبين العمل التي تحتوي على عوامل النمو، على التوالي، في تركيز 250،000 خلية / ميكرولتر (التهم بيليه الخلية لحوالي ⅓ الحجم النهائي) ووضعها على الجليد قبل الزرع (الشكل 1A). نلاحظ أن الفيبرينوجين قد هلام عفويا عند مزجه مع خليةو قبل الجمع مع الثرومبين في موقع الآفة / الكسب غير المشروع؛ لتجنب gellation سابق لأوانه، وخلط الخلايا في الفيبرينوجين على الفور قبل تطعيم خلية في الجسم الحي.

4. زرع

1. Reexpose في lesioned T3 / 4 الحبل الشوكي بعد أسبوعين transection الحبل الشوكي.
2. 5 ميكرولتر الفيبرينوجين خلايا و 5 ميكرولتر الثرومبين خلايا يمكن حقنه مباشرة في تسع نقاط من موقع الآفة من خلال مختومة ندبا والجافية سليمة دون إعادة فتح موقع الآفة.
3. استخدام إبرة G 27 لإنشاء 9 ثقوب على سطح ندبا والجافية سليمة آخر 1-2 أسابيع الآفة: 3 في مركز (واحد في نقطة الوسط واثنان في الخطوط الفرعية، وبصرف النظر متباعدة 0.5 مم) و 3 في كل من منقاري و 3 في واجهة الذيلية (حوالي 0.5 مم منقاري أو الذيلية إلى مركز الآفة).
4. ثم حقن نصف حجم الخلية الحل الفيبرينوجين إلى ثلاث نقاط مركزية للموقع الآفة وبلغ حجم التداول في الربع 3 نقاط واجهة منقاري وعبد القديرحجم uarter إلى 3 نقاط واجهة الذيلية.
5. ثم، وضخ فورا خلايا throbmbin في نفس البقع. سوف خليط من الخلايا والخلايا الفيبرينوجين الثرومبين داخل الموقع الآفة تشكل هلام الليفين لعقد الخلايا في موقع الآفة وسوف الكوكتيلات عامل النمو دعم بقاء الخلايا. يتم حقن الخلايا باستخدام الماصات الزجاج سحبت متصلة PicoSpritzer (العامة صمام، وشركة).
6. زرع NSCs الإنسان المثقف ²¹ في نفس الإجراء الموصوف أعلاه، واستخدام الليفين وعامل النمو زجاجات مصنوعة من الكواشف الإنسان.

النتائج

يوضح وضع العلامات GFP immunohistological أن NSCs الفئران المطعمة معلق في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (تفتقر إلى المصفوفة الليفين وعوامل النمو) نجا ضعيفا في الموقع transection T3، ربط فقط إلى الهامش الآفة / المضيف وترك معظم موقع الآفة فارغة دون الخلايا المطعمة (الشكل 2A). تحسين بقا...

Discussion

واحدة من العقبات الرئيسية لمجلس الأمن القومي في زرع النخاع الشوكي المصاب هو البقاء على قيد الحياة الفقيرة في مركز الآفة. يمكن أي ثغرات أو تجاويف في موقع الآفة يحتمل أن تقلل أو تضعف تشكيل التبديلات العصبية الوظيفية بين محاور عصبية فوق الشوك وفصل شرائح الحبل الشوكي أس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs