重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

要約

増殖因子を含むフィブリンマトリクスは、完全な脊髄切断の部位に移植された神経幹細胞を維持するために使用した。移植された細胞が完全に病変空洞を満たし、長距離のホスト脊髄に軸索を延長したニューロンを含む複数の神経細胞型に分化した。

要約

神経幹細胞（NSCは）自己再生および神経細胞とグリアに分化することができる。移植されたNSCは、脊髄損傷（SCI）後に失われたニューロンおよびグリアを置き換えることができ、かつ病変の上下脊髄セグメントを再接続するために、機能のリレーを形成することができる。神経幹細胞を移植する以前の研究は、脊髄病変キャビティ内の不完全な移植片の生存によって制限されている。さらに、移植細胞の生存、分化、および処理延長の追跡は、最適化されていなかった。運命は、特定の細胞型に牽引された場合を除き、最終的に、これまでの研究では、培養したラットのNSCは、一般的に、むしろ神経細胞よりも、損傷した脊髄に移植された際にグリアに分化することが報告された。これらの問題に対処するために、我々は、生存率を改善するために過酷なSCIの部位へのNSCの統合および分化を新たな方法を開発した。 NSCは新たにグリーンFLを発現する安定なトランスジェニックフィッシャー344ラットラインから胎生14日目の脊髄（E14）から単離したuorescentタンパク質（GFP）および成長因子を含有するフィブリンマトリックスに埋め込まれた;病変空洞内に移植された細胞を保持し、細胞生存を支持することを目的としたこの製剤。フィブリン/成長因子カクテル中のNSC、それによって炎症のピーク期間を避けて、二週間胸椎レベル3（T3）完全な脊髄離断後に移植した。その結果移植片は完全に病変空洞を充填して著しく長い距離、およびグリアを介してホスト脊髄に軸索を拡張し、両方のニューロンに分化した。 GFPを発現する培養ヒトNSCの移植片は同様の所見が得られた。したがって、方法は、神経幹細胞移植、生存およびインビボ所見の分析を改善するために定義されている。

概要

脊髄損傷（SCI）は、しばしば損害だけでなく、ニューロンと運動ニューロンのセグメント損失を引き起こす脳との間で信号を運ぶ白質路ではなく、中心灰白質、。 SCIの結果、モータおよび病変以下感覚機能の両方の喪失である。残念ながら、成人の中枢神経系（CNS）は、自然発生的に恒久的な機能欠損¹で、その結果、再生成されません。そのため、運動、感覚および自律神経機能で負傷し、成人脊髄および改善の再構成はSCIの研究の重要な目標である。神経幹細胞（NSC）、直接、胚または成体CNSから単離されたかどうか、失われたニューロンおよびグリアを置き換えるために魅力的な候補細胞である。さらに、これらの細胞は損傷部位の^2,3横切っ軸索伝導を回復するために新たな機能のリレーを形成する可能性を有する。

今日まで、解剖学的、electrophysの詳細な解明がなされていないiological、重度の脊髄損傷後に移植するNSCによる神経の中継形成の行動への影響。これにはいくつかの理由があります。大規模な病変空洞に移植する際、最初に移植されたNSCまたは胎児CNS組織が不十分生き残る。これまでの研究では、大規模な空の嚢胞性病変キャビティ^4,5を残して、かなり初期のセル損失を示しています。いくつかの研究では移植された細胞はその後分裂し、病変空洞に^4,5を満たしたが、これは数日から数週間の遅延の後に発生する可能性がある、とその後の病変部位の充填は、完全または一貫性がない可能性がありますでしょう。第二に、細胞の生存、分化/成熟、および移植されたNSCの成長に音声データを提供する効率的な追跡システムが欠けていた。最も初期の研究では、移植^の2,3からの軸索投射をトレースする順行と逆行性標識を利用した。しかしながら、これらの技術は、部分的にのみ、しばしば不鮮明に移植された細胞から生じる軸索投射を標識し、トレーサー法は主観である移植された細胞を超えて色素漏出に起因するアーティファクトにトン。他のグループは、負傷した齧歯類の脊髄^5,6にヒト胎児NSCの移植後の軸索投射にラベルを付けるために、人間の特定のニューロンのマーカーを使用していました。しかし、これらの研究では、 異種移植は一貫してうまく生存しなかった。最近では、GFPレポーター遺伝子のウイルス送達は、培養されたNSCの^7,8を標識した。しかし、GFP発現は、しばしば矛盾していたと^7をダウンレギュレートすることができる。近年、安定してレポーター遺伝子、GFP、又はヒト胎盤アルカリホスファターゼを発現するトランスジェニックドナーマウスまたはラットの使用は、劇的にインビボ ^9,11 における移植神経幹細胞/前駆細胞のトラッキングを改善した。第三に、いくつかの研究は、そのまま、または負傷した成人の脊髄CORの環境に移植されたときのどちらか胚または成体CNSから派生したin vitroで培養したラットのNSCは、独占的にグリア系統に分化することを示すdは^7,12,13、これらの神経幹細胞は、ローカル環境が幹細胞の運命を決定することができることを示す、 インビトロの両方でニューロンおよびグリアに分化することができるという事実にもかかわらず。あるいは、培養されたNSCは、成体CNS由来特には、 インビボ ¹³ におけるグリア系譜に分化する固有のdefaulty性を有していてもよい。

そのため、上述の制限のため、我々のグループは最近、重傷を負った成人の脊髄の胚性NSCの追跡、生存および分化/成熟を改善するために新しいプロトコルを開発しました。簡単に言えば、我々は、生体内移植後の¹⁴ GFPの発現を維持GFPレポーター遺伝子を発現する安定なトランスジェニックフィッシャー344ラットの近親交配するラインから始まりました。次に、我々は日胚から14フィッシャー344脊髄、神経細胞とグリアの両方を生成する可能性を保持している開発の段階を新たに単離したNSCを使用していました。最後に、組み込み増殖を含むフィブリンマトリックス中へ新たに解離されたNSCは、移植細胞の生存、分化および統合をサポートすることを目指し、細胞を保持し、均一に大きな病変キャビティ内にそれらを配布する^15-17因子 。移植片は、完全な離断T3、脊髄損傷後2週間の部位に配置した。これらの移植された細胞は、一貫して完全な離断サイトを満たし、長い距離¹⁸を介してホスト脊髄への軸索の多数を拡張し、豊富な神経細胞に分化した。同様の結果は、免疫不全ラット¹⁸まで培養ヒト神経幹細胞移植片を用いて得た。

プロトコル

全ての動物プロトコルは、VA-サンディエゴ機関動物実験委員会（IACUC）によって承認されています。実験動物のケアと安全のためのNIHガイドラインを厳格に従っている。動物は、試験期間を通して食物と水を自由にアクセスし、適切に痛みや不快感を最小限にするために処理される。

1。フィブリン成分の製造は、成長因子カクテルを含む

1. （材料の表を参照）50 mg / mlの2倍の原液を得るために、0.5ミリリットルのPBSに25 mgのラットフィブリノゲンを溶解する。フィブリノゲンは溶解が困難であり、37℃のインキュベーターまたは水浴中に入れ、1〜2時間毎に5〜10分間振盪されるべきである。
2. 50 U / mlの2×ストック溶液を得10mMの無菌のCaCl ₂ 2mlに100 UNラットトロンビンを溶解する。
3. 100μlのストック溶液を得るために、以下の濃度でPBS中の増殖因子を溶解する：1 mg / mlの：BDNF; 生体内での髄腔内注入などのNT-3（高ストック濃度 ^{19）; 200μg/ mlの：GDNF; IGF; bFGFを; EGF; PDGF;のaFGF; HGF（約1,000 X細胞培養に使用されるよりも高い）。}
4. 50mMのDMSOストック溶液を得るために1.3ミリリットルDMSO中に25mgのMDL28170（カルパイン阻害剤）を溶解し、次いで、1mMのストック溶液を得るためにPBSで50倍希釈する。
5. 1,000μ成長因子カクテル溶液（ 図1）を生成するために各増殖因子成分を100μlとMDL28170（1mMストック溶液）100μLを混合する。
6. -70℃で保存するため10または20μLに成長因子および分量を含む25 mg / mlのフィブリノゲンワーキング溶液を得500μlの成長因子カクテルで500μlのフィブリノゲン2Xストック溶液を混ぜるソリューションは、-70℃で最大12ヶ月間安定している
7. 同様に、ストレージAの類似の10または20μlのボリュームに成長因子および分量を含む25単位/ mlのトロンビン作用溶液を得るために、500μlの成長因子カクテルで500μlのトロンビン2Xストック溶液を混ぜるT -70℃〜最大12ヶ月間。
8. 細胞と混合するまで、移植の日に、氷上でフィブリノゲンとトロンビン含有成長因子カクテルを配置。

2。T3脊髄切断

1. 許容できる方法を使用して、成熟雌のフィッシャー344ラットまたは無胸腺ヌードラットを麻酔。尾や足のピンチに対する応答性が完全に存在しないとき、被験者は深く、麻酔する。注意：我々は、通常、150〜200グラムFischerラットまたは180〜220グラム無胸腺ラット、およびケタミンの麻酔カクテル（2ミリリットル/キログラム）（25 mg / ml）を、キシラジン（1.3 mg / ml）をし、アセプロマジン（0.25 mgの使用/ mlで）。
2. 動物が麻酔下にある間、目の乾きやけがを防ぐために、眼軟膏を適用します。
3. 胸部上部エリアを剃るとベタジンで皮膚を洗浄してください。
4. 、＃15ブレードを使用して皮膚や筋肉を切る手術用リトラクターを使用したT3脊椎骨を露出させて、骨鉗子を使用して、T3 / 4脊髄を露出させ、T3椎骨の椎弓切除を行う。
5. LONを作る＃11ブレードを使用して、約2ミリメートルの長さの硬膜内gitudinal正中切開。
6. 右横脊髄全体をカットする硬膜の下に虹彩切除はさみを入れます。 1.5ミリメートル以上cadually同じ側に別のカットを作る。
7. 中等度の強度の真空に接続鈍い23Gの針で2カットセグメント間の吸引除去脊髄組織。腹側および横方向に完全な離断を確実にするために視覚的な検証を使用してください。これは横方向の片側切断を完了します。
8. 左hemicordに全角の脊髄切断、場所ミラー切開に病変を拡張することができます。 2週間後に移植された際に、損傷部位にしっかりと移植/フィブリンマトリックスを保持するには、最初のカット以外に、そのまま硬膜を残してしようとします。
9. 筋肉を縫合、抗生物質粉末と主食スキンを適用。
10. Bannamine（2.5-5 mg / kg）を、アンピシリン（80〜100 mg / kg）を（材料の表を参照）、すぐに手術後やチェンマイ、乳酸リンゲル（3ミリリットル）を注入暖かいインキュベーターでntainラット体温調節が再確立されるまで。
11. 膀胱を空にして（ 図1B）を空に反射的膀胱の設立まで、約2週間の一日二回リンゲル、アンピシリンソリューションを注入する。

新鮮解離日胚の3。準備14脊髄神経幹細胞

1. ラット資源研究センター、ミズーリ大学から（F344-TG（UBC-EGFP）F455Rrrc）近親交配させるトランスジェニックGFP F344ラットを入手します。
2. 2の後に成熟した雌ラット（8週齢以上）あたり（IP）200μgの/腹腔mLの濃度でPBS中に希釈し40μgのDES-Glyの^10、ホルモンエチルアミドの解除[D-アラ^6] -黄体形成ホルモン（LHRH）を注入胚コレクションの同期のための-3時間の明誘導。
3. 4日間の注射後、成熟したGFPホモ接合またはヘテロ接合雄のラットを一晩シートつき。
4. 日13.5から14.5性交後の胚を収集（ - 藍星懐中電灯とモデルVG1バリアフィルタBLS1）または蛍光顕微鏡冷HBSS緩衝液（PC）は、「NightSea "懐中電灯とフィルタメガネの下でGFPの発現を調べる。
5. 各GFP陽性の胎児から無菌的に脊髄を解剖し、虹彩切除はさみや細かい宝石商の鉗子で覆う髄膜および添付脊髄神経節を削除する。
6. 15ミリリットルcornical試験管内の2ミリリットル冷HBSSバッファに解剖した脊髄を収集し、氷上に保つ。
7. 解剖脊髄を解離するために、基準＃20は、次のとおりです。
   1. 簡単に言うと、（いくつかのコードは1コードは1被写体の移植に十分な細胞を生成することができ、一緒に消化することができる）を解剖脊髄を含むチューブに、0.25％トリプシン-EDTAの2ミリリットルを追加し、10月12日分、37℃で消化する。
   2. 遠心管で2分間2,500 rpmで組織に10％FBSを含むDMEM 10mlのトリプシンを添加することにより反応を停止する。
   3. 2ミリリットル神経基礎培地中のCOの組織を再懸濁2％のB27をntainingし、徐々に小さく火造りパスツールピペットを用いて、脊髄組織を粉砕する。
   4. 遠心40μmのセルストレーナーフィルターで2分間、B27を含有するNeurobasal培地2ml中に再懸濁し、フィルタセルのために2,500 rpmでの細胞。
8. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、均等に2エッペンドルフチュー​​ブに細胞を分割します。
9. 細胞を遠心分離し、完全に上清を除去（1〜2分は、低真空の先端を持つすべての上清を撤回する必要がある）ので、成長因子カクテルがセル再懸濁した後に残った上清によって希釈されることはありません。
10. （約⅓最終容量のための細胞ペレット数）250,000細胞/μLの濃度で、それぞれの成長因子を含むフィブリノゲンまたはトロンビン作用溶液中の細胞の再懸濁各半分、そして氷移植前（ 図1A）の上に置きます。細胞と混合した際、フィブリノゲンが自然にゲル化できることに注意してください病変/移植部位でトロンビンと組み合わせる前に、S;時期尚早のゲル化を回避するために、 インビボでの細胞移植の直前にフィブリノーゲンで細胞を混合する。

4。移植

1. 二週間脊髄離断後の病変T3 / 4脊髄をReexpose。
2. 5μlのフィブリノゲン細胞および5μlのトロンビン細胞が直接病変部位を再度開かずに密封された瘢痕組織および完全な硬膜を通して病変部の9点に注入することができた。
3. 中心部にある3（中間点に1つ、中途での2、そして離れて0.5ミリメートルの間隔）と吻側の両方で3：瘢痕組織および完全な硬膜1〜2週間後の病変の表面の9ホールを作成するために27のGの針を使用して、および尾側インターフェース（病変の中心から約0.5ミリメートル吻側または尾側）にある3。
4. その後、吻側インターフェイスと水溶液の3点に病変部位や四半期ボリュームの3つの中心点にフィブリノゲン細胞溶液の半分の容積を注入尾側インタフェースの3点にuarter量。
5. その後、すぐに同じスポットにthrobmbin細胞を注入する。病変部位内部のフィブリノーゲンおよびトロンビ​​ン細胞細胞の混合物が病変部位に細胞を保持するために、フィブリンゲルを形成し、成長因子のカクテルは、細胞の生存を支援する。細胞をPicoSpritzer（一般バルブ社）に接続された引き上げたガラスピペットを用いて注入される。
6. 上記と同様の手順で移植培養したヒトのNSC ^21、および人間の試薬 ​​から作られたフィブリンおよび増殖因子カクテルを使用しています。

結果

GFP免疫組織学的標識は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（フィブリンマトリックスおよび増殖因子を欠く）中に再懸濁グラフトラットのNSCのみ病変/宿主マージンに付着しない空の病変部位の大部分を残し、T3離断部位に乏しい生存したことを実証移植された細胞（ 図2A）。単独のフィブリンマトリックスとの共同移植されたとき、NSCの生存率は改善したが、移植は完全に大規模な?...

ディスカッション

損傷した脊髄内のNSC移植のための主要な障害の1つは、病変の中心部での低い生存率である。病変部位にギャップまたはキャビティは、潜在的に軽減または脊柱上軸索と傷害下の分離された脊髄セグメント間の機能的神経細胞のリレーの形成を弱める可能性があります。また、グラフトされたNSCの生存率不良が宿主組織との統合に影響を与えるので、ホストニューロンとニューロンのグラフト...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs