Promoção da sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais com fibrina e Fator de Crescimento Cocktails após Spinal Cord Injury grave

Resumo

Matrizes de fibrina que contêm factores de crescimento foram utilizados para reter as células estaminais neurais enxertados em locais de completa a transecção da medula espinal. Células enxertadas encheu completamente a cavidade lesão e diferenciado em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios que se estenderam axônios em acolhimento medula espinhal através de longas distâncias.

Resumo

Células-tronco neurais (NCCC) pode se auto-renovar e diferenciar em neurônios e células gliais. NSC transplantados pode substituir neurônios perdidos e glia após lesão medular (LM), e podem formar relés funcionais para re-conectar segmentos da medula espinhal acima e abaixo de uma lesão. Estudos anteriores de enxerto de células estaminais neurais têm sido limitados pela sobrevivência do enxerto incompleto no interior da cavidade da lesão da medula espinal. Além disso, o controle de sobrevivência do enxerto de células, diferenciação, e extensão do processo não tinha sido optimizada. Finalmente, em estudos anteriores, NSC de rato em cultura foram tipicamente relatada para se diferenciarem em células da glia, quando enxertado na medula espinal ferida, em vez de neurónios, a menos que o destino foi conduzido para um tipo de célula específico. Para tratar dessas questões, desenvolvemos novos métodos para melhorar a sobrevivência, integração e diferenciação de NSC para os locais de mesmo grave SCI. NSC foram recentemente isoladas de embriões dia 14 de medula espinhal (E14) de um transgênico Fischer 344 linhagem de ratos estável expressando fl verdeproteína uorescent (GFP) e foram incorporados numa matriz de fibrina contendo factores de crescimento; esta formulação destinada a reter as células enxertadas na cavidade lesão e apoiar a sobrevivência da célula. NSC no fator de fibrina / crescimento cocktail foram implantadas duas semanas após torácica nível 3 (T3) completos transecções da medula espinhal, evitando os períodos de pico de inflamação. Enxertos resultantes completamente preenchida a cavidade lesão e diferenciado em ambos os neurônios, que se estenderam axônios para o acolhimento da medula espinhal mais notavelmente longas distâncias, e glia. Enxertos de NSC humanas cultivadas que expressam GFP revelou resultados semelhantes. Assim, os métodos são definidos para melhorar o enxerto de células estaminais neuronais, de sobrevivência e de análise de resultados in vivo.

Introdução

A lesão medular (LM), muitas vezes danos não só tratos da substância branca que levam os sinais de e para o cérebro, mas também a matéria cinzenta central, causando perda segmentar de interneurônios e neurônios motores. A conseqüência da SCI é a perda de ambos função motora e sensorial abaixo da lesão. Infelizmente, o sistema nervoso central adulto (CNS) não regenerar-se espontaneamente, resultando em défices funcionais permanentes ^1. Portanto, a reconstrução do adulto ferido medula espinhal e melhoria no motor, sensorial e função autonômica é uma meta importante da pesquisa SCI. Células-tronco neurais (NCCC), seja diretamente isolado do embrionário ou adulto CNS, são células candidatos atraentes para substituir neurônios perdidos e glia. Além disso, estas células têm o potencial para formar novos centros funcionais para restaurar a condução axonal, através de um local de lesão ^{de 2,3.}

Até o momento, não houve um esclarecimento detalhado da anatomia, electrophysiological e efeitos comportamentais da formação relé neuronal por NSC transplantadas após grave SCI. Há várias razões para isso: primeiro, NSCs ou tecido transplantado fetal CNS sobreviver mal quando enxertados em grandes cavidades lesão. Estudos anteriores mostram perda de células no início substancial, deixando grandes cavidades vazias lesão cística ^4,5. Em alguns estudos, as células enxertadas seria posteriormente dividir e preencher a cavidade lesão ^4,5, mas isso pode ocorrer após um atraso de dias ou semanas, e posterior enchimento local da lesão pode não ser completa ou consistente. Em segundo lugar, um sistema de rastreamento eficiente que fornece dados de som na sobrevivência celular, diferenciação / maturação, e conseqüência do transplantado NSCs faltava. A maioria dos estudos iniciais utilizados anterógrada e marcação retrógrada traçar projeções axonais de transplantes ^2,3. No entanto, essas técnicas apenas parcialmente e, muitas vezes, as projeções axonais unclearly rotulados decorrentes de células enxertadas e métodos de rastreamento são subjetividadet às interferências provocadas por fugas de corante para além das células implantadas. Outros grupos utilizaram marcadores neuronais humanas específicas para rotular projeções axonal após o transplante de NSCs fetais humanos em roedor feridos medula espinhal ^5,6. No entanto, nesses estudos, os xenotransplantes não consistentemente sobreviver bem. Recentemente, a entrega viral do gene GFP repórter foi utilizada para rotular NSC cultivadas ^7,8. No entanto, a expressão da GFP foi muitas vezes inconsistentes e pode ser regulada para baixo ^7. Recentemente, a utilização de ratinhos transgénicos ou ratos doadores de forma estável que expressam o gene repórter, GFP, ou a fosfatase alcalina da placenta humana, melhorou dramaticamente o rastreamento de transplantadas células estaminais neurais / progenitoras in vivo ^9,11. Em terceiro lugar, muitos estudos indicam que, in vitro NSC rato cultivados derivados a partir de qualquer embrionário ou SNC adulto exclusivamente diferenciar em linhagens gliais quando transplantadas para o meio do adulto intacta ou lesada cor espinald ^7,12,13, apesar do facto de essas células estaminais neurais são capazes de se diferenciar em ambos os neurónios e células da glia in vitro, indicando que os ambientes locais podem ditar o destino das células estaminais. Alternativamente, NSC cultivadas, especialmente os derivados de SNC adulto, pode ter propriedades defaulty intrínseca de se diferenciar em linhagens da glia in vivo ^13.

Por causa das limitações discutidas acima, o nosso grupo desenvolveu recentemente um novo protocolo para melhorar embrionário rastreamento NSC, sobrevivência e diferenciação / maturação no adulto medula espinhal gravemente ferido. Resumidamente, começamos com um transgênico linha Fischer 344 consanguinidade rato estável expressando um gene repórter GFP que sustenta expressão GFP após o transplante in vivo ^14. Em seguida, utilizamos NSCs recém-isoladas de dia embrionário 14 Fischer 344 medula espinhal, um estágio de desenvolvimento que mantém o potencial de gerar neurônios e células gliais. Finalmente, incorporadoNSC recém-dissociada em uma matriz de fibrina contendo fatores de crescimento ^15-17 para reter as células e uniformemente distribuí-los dentro de uma grande cavidade da lesão, com o objetivo de apoiar a sobrevivência das células do enxerto, diferenciação e integração. Os enxertos foram colocados em locais de T3 transecção completa, duas semanas após a lesão medular. Estas células enxertadas preenchido de forma consistente locais transecção completa e diferenciada em neurônios abundantes que estenderam um grande número de axônios em acolhimento medula espinhal através de longas distâncias ^18. Resultados semelhantes foram obtidos com enxertos de células-tronco neurais humanas cultivadas para imunodeficientes ratos ^18.

Protocolo

Todos os protocolos de animais são aprovados pela VA-San Diego Institutional Animal Care e do Comitê Use (IACUC). Diretrizes do NIH para cuidados com animais de laboratório e segurança sejam rigorosamente seguidas. Os animais têm livre acesso a comida e água ao longo do estudo e são tratados de forma adequada para minimizar a dor eo desconforto.

1. Preparação de Fibrina componentes contendo Fator de Crescimento Cocktails

1. Dissolver 25 mg de fibrinogênio rato em 0,5 ml de PBS para obter / ml 2x solução estoque de 50 mg (ver tabela de materiais). O fibrinogénio é difícil de dissolver e deve ser colocado numa incubadora a 37 ° C ou banho de água e agitou-se a cada 5-10 min durante 1-2 horas.
2. Dissolver 100 trombina rato ONU em 2 ml de 10 mM estéril _CaCl2 obter 50 U ml de solução / 2x.
3. Dissolve-se os factores de crescimento em PBS a concentrações que se seguem para se obter uma solução de 100 ul de estoque de 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (concentração estoque elevado como infusão intratecal in vivo ^{19); 200 ug / ml: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (cerca de 1000 x mais elevada do que utilizado para cultura de células).}
4. Dissolve-se 25 mg de MDL28170 (inibidor da calpaína) em 1,3 mL de DMSO para se obter uma solução estoque de 50 mM de DMSO e, em seguida, dilua 50 vezes em PBS para obter a solução estoque 1 mM.
5. Misturar 100 ml de cada componente do factor de crescimento e de 100 ul de MDL28170 (solução de reserva 1 mM) para produzir 1,000 ul solução de factor de crescimento de cocktail (Figura 1).
6. Misturar 500 mL de solução stock de fibrinogénio 2x com 500 ul de coquetel de factor de crescimento para se obter uma solução a 25 mg / ml de fibrinogénio contendo os factores de crescimento de trabalho e alíquota em 10 ou 20 ul de armazenamento a -70 ° C. A solução é estável durante até 12 meses a -70 ° C.
7. Do mesmo modo, misturar 500 ul de trombina solução estoque 2x com 500 ul de factor de crescimento de coquetel para obter a solução de trabalho de 25 U / ml de trombina, contendo factores de crescimento e alíquota em volumes de 10 ul ou 20 semelhantes, para armazenamento de umt -70 ° C durante até 12 meses.
8. No dia do enxerto, colocar cocktails fibrinogénio e do factor de crescimento contendo trombina em gelo até misturados com as células.

2. T3 Spinal Cord transecção

1. Anestesiar fêmea adulta Fischer 344 ratos ou ratos pelados atímicos usando métodos aceitáveis. Os assuntos são profundamente anestesiado, quando a capacidade de resposta à cauda e pata pitada estão completamente ausentes. Nota: normalmente usam 150-200 g ratos Fischer ou 180-220 g ratos atímicos, e um cocktail de anestesia (2 ml / kg) de cetamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / mL) e acepromazina (0,25 mg / ml).
2. Aplicar pomada para evitar ressecamento ou lesão de olhos, enquanto os animais estão sob anestesia.
3. Raspar a área torácica superior e limpar a pele com Betadine.
4. Cortar a pele eo músculo usando # 15 blade, expor T3 vértebra usando um afastador cirúrgico e realizar uma laminectomia em T3 vértebra para expor T3 / 4 medula espinhal usando um rongeur.
5. Faça um longitudinal incisão na linha média na dura de aproximadamente 2 mm de comprimento utilizando uma lâmina de # 11.
6. Coloque Iridectomia tesoura debaixo da dura para cortar toda a medula espinhal lateral direito. Faça outro corte no mesmo lado 1,5 milímetros mais cadually.
7. Aspirar o tecido da medula espinal entre os dois segmentos de corte com um romba 23 L agulha conectada a vácuo intensidade moderada. Use a verificação visual para garantir a transecção completa ventral e lateralmente. Isto irá completar a hemissecção lateral.
8. Para estender a lesão a um transecção da medula espinhal de largura total, coloque incisões espelho no hemicord esquerda. Tente deixar a dura intacto, diferente do primeiro corte, para manter a matriz de enxerto / fibrina firme no local da lesão, quando enxertados duas semanas depois.
9. Suturar o músculo, aplique pó antibiótico e grampo da pele.
10. Injetar de Ringer com lactato (3 ml), Bannamine (2,5-5 mg / kg) e Ampicilina (80-100 mg / kg) (ver tabela de Materiais), imediatamente após a cirurgia e mairatos ntain em uma incubadora quente até termorregulação é re-estabelecida.
11. Esvazie a bexiga e injetar a solução de Ringer e Ampicilina duas vezes por dia por cerca de duas semanas, até o estabelecimento de bexiga reflexo esvaziamento (Figura 1B).

3. Preparação de Freshly Dissociated dia embrionário 14 Medula Espinhal Neural Stem Cells

1. Obter consanguinidade transgênicos GFP ratos F344 (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) de rato de Recursos e Centro de Pesquisa da Universidade de Missouri.
2. Injectar 40 ug des-Gli ^10, [D-Ala ^{6]-Leuteinizing} Hormone Releasing Hormone etilamida (LHRH) diluído em PBS a uma concentração de 200 ug / ml, por via intraperitoneal (IP) por rato fêmea madura (8 semanas ou mais), após 2 -3 hr luz indução para a sincronização da colheita de embriões.
3. Companheiro com um maduro GFP overnight rato macho homozigoto ou heterozigoto 4 dias após a injecção.
4. Coletar embriões nos dias pós-coito 13,5-14,5(Pc) em tampão HBSS frio, examinar a expressão GFP sob um "NightSea" lanterna e filtro óculos (BLS1 - BlueStar Lanterna e filtro barreira Modelo VG1) ou um microscópio fluorescente.
5. Dissecar medula espinhal em condições assépticas de cada feto GFP-positivo e remover sobrejacentes meninges e gânglios espinhais anexado com uma tesoura Iridectomia e joalheiros pinça fina.
6. Recolha as medulas espinhais dissecadas em 2 ml de tampão HBSS frio em um tubo de 15 ml cornical e manter em gelo.
7. Siga referência n º 20 dissociar medulas espinhais dissecados:
   1. Resumidamente, adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA para o tubo contendo medulas dissecadas (vários cordões pode ser digerido em conjunto, um cabo pode gerar células suficientes para enxerto de um sujeito) e digestão a 37 ° C durante 10-12 min.
   2. Parar a reacção de tripsina por adição de 10 ml de DMEM contendo FBS a 10% para o tubo centrifugador e o tecido a 2500 rpm durante 2 min.
   3. Ressuspender o tecido em 2 ml de meio neurobasal containing 2% B27, e triturar o tecido da medula espinhal usando progressivamente menores pipetas Pasteur polido-fogo.
   4. Centrifugar as células a 2.500 rpm durante 2 min, ressuspender em 2 ml de meio neurobasal contendo B27, e as células do filtro com um filtro de 40 um filtro de células.
8. Contar as células com um hemocitómetro e as células dividem igualmente em dois tubos Eppendorf.
9. Centrifugar as células e remover completamente o sobrenadante (1-2 min são obrigados a retirar todo o sobrenadante com uma ponta de baixo vácuo) para que os coquetéis de fatores de crescimento não será diluída pela sobrenadante remanescente após célula re-suspensão.
10. Ressuspender cada metade das células, em que o fibrinogénio ou a solução de trabalho de trombina contendo factores de crescimento, respectivamente, a uma concentração de 250.000 células / mL (contagens da pelota celular durante cerca de ⅓ volume final) e colocá-los em gelo antes do transplante (Figura 1A). Note-se que o fibrinogénio pode gel espontaneamente quando misturado com celulars antes de combinar com trombina no local da lesão / enxerto; para evitar a gelificação prematura, misture pilhas em fibrinogênio imediatamente antes de enxerto de células in vivo.

4. Transplantation

1. Reexpose a lesionada T3 / 4 medula espinal de duas semanas após a transecção da medula espinal.
2. 5 fibrinogénio células ul e 5 ul de trombina células pode ser injectado directamente nove pontos do local da lesão, através de tecido da cicatriz e selado dura intacta, sem re-abertura do local da lesão.
3. Use uma agulha de 27 G para criar 9 buracos na superfície do tecido da cicatriz e dura intacta 1-2 semanas após lesão: 3 no centro (uma no ponto médio e duas em laterais, e espaçadas 0,5 milímetros de intervalo) e 3 em ambos rostral e 3 na interface de caudal (cerca de 0,5 mm rostral caudal ou para o centro da lesão).
4. Em seguida, metade do volume de injectar a solução da célula de fibrinogénio em três pontos centrais do local da lesão e um quarto do volume em três pontos da interface rostral e aqvolume de uarter em três pontos da interface do caudal.
5. Em seguida, injetar imediatamente células throbmbin nos mesmos pontos. A mistura de células de fibrinogénio e de trombina de células dentro do local da lesão irá formar um gel de fibrina para manter as células no local da lesão e os cocktails de factor de crescimento que suporta a sobrevivência de células. As células são injectadas usando pipetas de vidro puxado ligados a um Picospritzer (Geral válvula, Inc.).
6. Transplant cultivadas NSC humanos ²¹ no mesmo procedimento descrito acima, e utilizam de fibrina e do factor de crescimento cocktails feitos a partir de reagentes humanos.

Resultados

Rotulagem imuno GFP demonstra que NSC rato enxertado ressuspensas em tampão fosfato salino (PBS) (falta de uma matriz de fibrina e os factores de crescimento) sobreviveram mal no local transecção T3, apenas inerente à margem da lesão / hospedeiro e deixando a maior parte do local da lesão, sem vazios As células enxertadas (Figura 2A). A sobrevivência de NSC melhorada quando co-enxertados com matrizes de fibrina por si só, mas o enxerto não encher completamente uma cavidade grande lesão (dados...

Discussão

Um dos principais obstáculos para o transplante de NSC na lesão medular é pobre sobrevivência no centro da lesão. Quaisquer lacunas ou cavidades no local da lesão pode potencialmente reduzir ou enfraquecer a formação de relés neuronais funcionais entre axônios supraespinhais e separados segmentos da medula espinhal abaixo da lesão. Além disso, a baixa sobrevivência de NSCs enxertadas pode afectar a sua integração com o tecido hospedeiro, e, portanto, reduzir a conectividade dos neurônios enxertadas com n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs