فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Summary

وغالبا ما يتم فحص المركبات العلاجية الأولى في المختبر مع المقايسات جدوى. عدد الخلايا أعمى من قبل المراقب الإنسان يمكن أن تكون حساسة للغاية للتغيرات صغيرة في عدد الخلايا ولكن لا تقييم وظيفة. المقايسات الجدوى المحوسبة، كما هو موضح هنا، يمكن تقييم كل من هيكل وظيفة بطريقة موضوعية.

Abstract

عدد الخلايا دليل على المجهر هي وسيلة لتقييم الجدوى الحساسة الخلوية ولكنها تستغرق وقتا طويلا، وبالتالي باهظة الثمن. المقايسات الجدوى محوسبة مكلفة من حيث المعدات ولكن يمكن أن يكون أسرع وأكثر موضوعية من عدد الخلايا اليدوي. ويصف هذا التقرير استخدام ثلاثة من هذه المقايسات جدوى. اثنين من هذه المقايسات والأشعة تحت الحمراء واحد هو الانارة. سواء المقايسات الأشعة تحت الحمراء تعتمد على تصوير أوديسي 16 بت. يستخدم فحص الأشعة تحت الحمراء واحدة وصمة عار DRAQ5 للنوى جنبا إلى جنب مع وصمة عار الياقوت لالعصارة الخلوية وتصور في القناة 700 نانومتر. الفحص بالأشعة تحت الحمراء الأخرى، والغربية في خلية، يستخدم الأجسام المضادة ضد البروتينات هيكل الخلية (α-تويولين أنيبيب أو بروتين يرتبط 2) وتصف لهم في القناة 800 نانومتر. فحص صلاحية الثالث هو فحص الانارة تستخدم عادة لاعبي التنس المحترفين، ولكن نحن نستخدم ربع حجم أوصت لانقاذ على التكاليف. هذه القياسات الخطية وكلها ترتبط مع عدد مLLS مطلي، ولكن تختلف في الحساسية. جميع المقايسات ثلاثة الالتفاف المجهر تستغرق وقتا طويلا وأخذ عينات من البئر كله، وبالتالي تقليل هامش الخطأ. أخيرا، كل من المقايسات يمكن بسهولة أن تكتمل في غضون يوم واحد من نهاية التجربة، والسماح أعداد أكبر من التجارب التي يتعين القيام بها ضمن أطر زمنية قصيرة. ومع ذلك، فإنها كلها تعتمد على افتراض أن الأرقام تظل الخلية بما يتناسب مع قوة الإشارة بعد العلاج، وهو افتراض أن في بعض الأحيان لم يتم، وخاصة بالنسبة للاعبي التنس المحترفين الخلوية. وعلاوة على ذلك، إذا كان زيادة أو نقصان الخلايا في الحجم بعد العلاج، وهذا قد يؤثر على قوة الإشارة دون التأثير على عدد الخلايا. نستنتج أن جميع المقايسات الجدوى، بما في ذلك التهم اليدوي، يعاني من عدد من المحاذير، ولكن هذا المقايسات الجدوى محوسبة تستحق الاستثمار الأولي. باستخدام جميع المقايسات الثلاثة معا تعطي رؤية شاملة للبنية الخلية ووظيفتها.

Introduction

فحص الجدوى الأكثر شيوعا في العلوم البيولوجية ينطوي على عدد الخلايا. ويتجلى ذلك من خلال إجراء تحليل للأعلى (أحدث) 200 المطبوعات التي ظهرت في مجلات مع أي من الكلمات الرئيسية "في المختبر" أو "ثقافة" على 2013/04/29 2013/04/30 و. من هذه المنشورات، 23.5٪ تستخدم فحوصات تعداد خلايا، بما في ذلك دليل التهم عدد الخلايا، عدد الخلايا الآلي التهم مع برامج التصوير، والتريبان الأزرق الاستبعاد. تم استخدام لايف / الميت في مقايسة 1٪ من هذه المنشورات. وكان الفحص للبقاء الأيض بنسبة 11٪ - عدد المنشورات باستخدام MTT ((4،5-dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium 3). ويبين هذا المسح من الأدب أيضا أن عدد المنشورات باستخدام فحوصات مثل الإنتقالي العسكري بالتزامن مع المقايسات عدد خلايا كان 3.5٪ فقط. على الرغم من الاتجاه لاستخدام واحد مقايسة جدوى في حد ذاته، وتقييم وظيفة الخلوية بالاشتراك مع عدد الخلايا يبدو الخيار الأفضل لتقييم ط الخلويةntegrity. عدد الخلايا في حد ذاتها ليست كافية لأن الخلايا المتبقية قد لا تكون وظيفية أو صحية على الرغم من أنها موجودة في البئر ^1،2. على العكس، وتدابير وظيفية مثل ATP قد تزيد أو تنقص في غياب تغييرات موازية في عدد الخلايا. فك ربط قراءات الأيضية من عدد الخلايا يوحي بأن ATP والمقايسات MTT لا ينبغي أبدا أن تستخدم جدوى الفحص الوحيد. في هذا التقرير، وصفت ثلاثة فحوصات قابلية أن مسح كل الهياكل الخلوية وظيفة التمثيل الغذائي، للحصول على عرض أكثر شمولا من النزاهة الخلوية من أي فحص واحد في حد ذاته يمكن تحمله.

اثنين من المقايسات لدينا تتطلب تصوير بالأشعة تحت الحمراء الذي يقيس مضان في القنوات نانومتر 700 و 800. ضوضاء منخفضة في موجات الأشعة تحت الحمراء، مما يؤدي إلى ارتفاع إشارة إلى الضوضاء نسب ^3. وتصوير أوديسي التي نستخدمها لديها مجموعة ديناميكية 4.5 سجل وبت عمق 16، translatinز ¹⁶ إلى 2 أو 65،536 ظلال من الأشعة تحت الحمراء. وهذا يمكن أن يتناقض التصوير اللون 8 بت، والتي توفر سوى 2 ⁸ أو 256 ظلال من اللون لكل طول موجي. وبالتالي، والتصوير 16 بت لديه قرار الدقيقة. تجدر الإشارة إلى أن الصور بالأشعة تحت الحمراء الأصلي وغالبا ما pseudocolored الأخضر (800 نانومتر) والحمراء (700 نانومتر) في التقارير المنشورة للعرض. وتستخدم عادة أوديسي التصوير على حد سواء لالنشاف الغربية والغرب في خلية ^4-7. في خلية الغرب على الخلايا الثابتة الفورمالديهايد استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد أي بروتين من الفائدة وتسمية لهم بدوره مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية الأشعة تحت الحمراء. وتعرف هذه التقنية لتكون مفيدة بشكل خاص بالنسبة لنهايات الفسفرة ^6. لدينا في الغرب في خلية، ونحن وصمة عار الخلايا ثابتة لهيكل الخلية البروتينات α-تويولين أنيبيب العصبية أو البروتين 2 (MAP2) المرتبطة في القناة 800 نانومتر. هذه البروتينات وفيرة بما فيه الكفاية لتحقق نسب عالية إشارة إلى الضوضاء. نحن أيضا لدينا لوحات وصمة عار في 700قناة نانومتر للنوى مع وصمة عار DRAQ5 والسيتوبلازم مع وصمة عار الياقوت. كل من البروتينات هيكل الخلية وDRAQ5 + البقع الياقوت بالتالي تعكس الهياكل الخلوية.

فحص صلاحية الثالث يقيس وظيفة التمثيل الغذائي ويسمى "خلية عيار جلو" في هذا الاختبار القائم على luciferase المراسل، والقيم التلألؤ في نسبة مباشرة إلى مستويات ATP. وتستخدم المقايسات ATP شيوعا لقياس خلايا قابلة للحياة ^8-12. ومع ذلك، بما في ذلك كلمة "عيار" في اسم الاختبار هو نوعا من تسمية خاطئة لأن الناتج ATP لكل خلية يمكن أن تتغير بوصفها وظيفة من العلاجات السموم وبالتالي فهي ليست دائما في نسبة إلى الخلية رقم ^8. كما يمكن أن تتأثر مستويات ATP عن طريق ايقاعات كل يوم ¹³ وقبل انقسام الخلية ¹⁴ و ¹⁵ تمايز الخلايا. ومع ذلك، فإن فحص ATP المبين هنا هو بسيطة لأداء ومفيدة لاعبي التنس المحترفين هو مقياس قوية من التمثيل الغذائي^16-21 الجدوى، إن لم يكن الخلية رقم في حد ذاته. عن طريق هذا الاختبار لاستكمال الأشعة تحت الحمراء في سيل وبالتالي ينتج الغرب صورة أكثر شمولا من النزاهة الخلوية من أي فحص واحد فقط.

Protocol

ويتضح التخطيطي للبروتوكولات في الشكل 1.

1. خلية تصفيح

خلايا لوحة في لوحات 96 بشكل جيد في مختلف الكثافات الطلاء (الشكل 2). لالشيكات الخطية على خط الخلية العصبية N2A، لوحة 2.5K، 5K، 10K، 15K وخلايا لكل بئر في 3 أو 6 آبار / المجموعة. لاجراء فحوص الخطي في الخلايا العصبية الفئران القشرية الأولية، لوحة 25K، 50K، 100K، 200K وخلايا لكل بئر في 3 أو 6 آبار / المجموعة. إذا كانت خطوط الخلية أو الخلايا الأولية من الفائدة تبدو صحية في كثافة الطلاء المختلفة، لوحة في وحول كثافة الخلية الأمثل لهذا النوع من الخلايا.

ملاحظة: في هذه الدراسة، كانت مطلية الخلايا N2A في وسائل الإعلام 100 ميكرولتر والخلايا العصبية القشرية الأولية في وسائل الإعلام 200 ميكرولتر على لوحات التي تم تصميمها لخفض التبخر. للحصول على معلومات مفصلة عن التعامل مع الخلايا، ووسائل الإعلام، الأمصال والمضادات الحيوية وعلاجات للسموم، يرجى الاطلاع Unnithan وآخرون. لN2A سل⁸ ليرة سورية وPosimo وآخرون. للثقافات القشرة الأولية ^22.

1. 1. تكرار الطلاء على الثاني لوحة 96 جيدا. سيتم يعاير واحد لوحة للاعبي التنس المحترفين (الشكل 2A) والآخر مع فحوصات الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2B). يمكن للمرء أن لا تستخدم نفس لوحة للاعبي التنس المحترفين وفحوصات الأشعة تحت الحمراء لأن الخلايا هي lysed يجب مفتوحة للقياسات ATP داخل الخلايا.
   2. ومن المؤكد أن لوحة لا يقل عن 3 آبار اضافية لخلفية الطرح في فحوصات الأشعة تحت الحمراء في كثافة الطلاء الأمثل (العمود 2؛ الشكل 2B).
2. إضافة وسائط دون الخلايا أو أكثر غير مكلفة، الماء المعقم إلى الآبار الخارجي في الصفوف ألف وحاء والأعمدة في 1 و 12. تجنب الاعتماد على البيانات من الآبار على طول الحواف، كما هو في كثير من الأحيان أقل جدوى هنا من آثار التبخر وسائل الإعلام ودرجة الحرارة التدرجات. مثل هذه المشاكل مع microplates تسمى عادة آثار حافة ^23،24. لا تبقي هذه الآبار فارغةلأن ثم الصفوف B و G والأعمدة 2 و 11 يعانون من تأثير الحافة.
   وربما يتم تخفيض الآثار التي يحتضنها حافة صفيحة المصنفة حديثا في درجة حرارة الغرفة في الظروف المحيطة قبل نقلها إلى الحاضنة CO ₂ ^24. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أجرتها Carralot يصف طريقة تصحيح الرياضية لوحات microtiter باستخدام عمود تحكم واحد ^23. تستخدم اوليفر وزملاؤه المصممة خصيصا اضطر microtitration الهواء لوحة حاضنة للحد من التدرجات الحرارية ^25. إذا كان تأثير الحافة هو مصدر قلق كبير، وغرف الاستقرار صفيحة ميكروسكوبية (مثل BT و C للإعلام) يمكن شراؤها لإنشاء المكروية متجانسة مع ارتفاع نسبة الرطوبة ودرجة الحرارة حتى التدرجات.
3. إذا هناك حاجة لمزيد من الآبار هو مبين في الشكل 1 لأن التخفيفات كاشف إضافية أو أكثر كثافة الطلاء وسيتم اختبار، واستخدام الآبار لحافة الطرح الخلفية.
4. الانتظار بين عشية وضحاها لمرفقمن الخلايا وفحص في صباح اليوم التالي كما هو موضح أدناه.

2. الانارة ATP الفحص

1. متابعة توصيات خلية عيار جلو الشركة المصنعة لإعادة تشكيل الركيزة مع العازلة وللمرة الحضانة.
   1. إزالة 50 أو 150 ميكرولتر من وسائل الإعلام 100 أو 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام الطلاء، على التوالي. ستظل أقل قليلا من 50 ميكرولتر راء في البئر. إضافة 25 ميكرولتر من الكواشف (الركيزة زائد العازلة) إلى أعمدة 2-6 (الشكل 2A) في 01:02 التخفيف.
      ملاحظة: كميات متفاوتة من وسائل الاعلام تركت وراءها بعد إزالة يمكن تخفيف أو تركيز ATP الكواشف مقايسة تفاضلي عبر الآبار. الحرص على ضمان أن مستوى السائل في كل النصائح ماصة الأقنية هو ما يعادلها. قياس السائل المتبقي في آبار مختارة عبر لوحة مع ماصة على الفور قبل إضافة الكواشف ATP الفحص لضمان الدقة. في حالة وجود تباين عالية من معدلات التفاضلية من evapor وسائل الإعلامأوجه عبر سطح لوحة، وإزالة كافة وسائل الإعلام القديمة وإضافة نفس الحجم من وسائل الإعلام الجديدة أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لجميع الآبار مباشرة قبل إضافة ATP الكواشف مقايسة. إذا لوحات يعانون من مستويات مختلفة من التبخر، في محاولة التحول إلى لوحات تبخر منخفضة من COSTAR كورنينج. في لوحات الأخير، و60 بئرا الداخلية هو مبين في الشكل 2 يعانون فقط من متوسط ​​قدره 0.995٪ ± 0.41 وسائل الإعلام تبخر بين عشية وضحاها. وبالتالي هناك تباين يذكر في حجم وسائل الاعلام في وقت الفحص.
   2. في الأعمدة من 7 إلى 11، الصفوف B إلى D، وإزالة ما يكفي من وسائل الإعلام لترك 50 ميكرولتر وراء، على النحو المفصل أعلاه، وإضافة 50 ميكرولتر من الكواشف في 1:1 التخفيف.
   3. في الأعمدة من 7 إلى 11، من خلال الصفوف E G، وترك الخلايا في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام وإضافة 100 ميكرولتر من الكواشف، ومرة ​​أخرى في 1:1 التخفيف. توصي الشركة أن 100 ميكرولتر من الكواشف يجب تخفيفه 01:01 في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
      ملاحظة: من أجللانقاذ على تكاليف، فمن الممكن لخفض هذه التوصيات سواء في الحجم، والتخفيف. ومع ذلك، قبل القيام بذلك، تأكد من أنه لا يقلل من الخطي وحساسية الفحص.
   4. مرة واحدة تم العثور على حجم معين واحد وعامل التخفيف من الكواشف أن تكون مرضية، والعصا معهم في جميع التجارب اللاحقة. وصفت معايير للبيانات مرضية في قسم النتائج.
   5. الكواشف المعاد غير المستخدمة يمكن أعيد تجميدها مرة أخرى واستخدامها في وقت لاحق لانقاذ على التكاليف. وفقا لالصانع، الكواشف المعاد يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 21 أسبوعا مع فقدان ~ 3٪ من النشاط.
2. وضع لوحة على شاكر المداري لمدة 2 دقيقة أو الإيماء شاكر لمدة 10 دقيقة. إذا كان يتم يعاير جزء من لوحة لقياس مختلفة، وأنه لا يمكن أن تهتز، تستنهض الهمم وسائل الإعلام مع pipetting صعودا ونزولا بسيطة فقط في الآبار من الفائدة. ومع ذلك، فإن فقاعات المفرطة ولدت خلال هذه الخطوة تتعارض مع وميخرج nescent.
   1. 10 دقيقة بعد إضافة الكواشف، ونقل 60 ميكرولتر من محتويات جيدا في لوحات بيضاء 96 جيدا. القيم التلألؤ هي أعلى في لوحات بيضاء مما كان عليه في لوحات واضحة أو الأسود لأنها تعكس الضوء صعودا نحو كاشف.
      ملاحظة: في تجربتنا، وخلايا البقاء على قيد الحياة أفضل على تبخر منخفضة، لوحات COSTAR واضحة من لوحات أخرى. لا تباع هذه اللوحات محددة مع الجدران البيضاء. الثانية، لوحات مبهمة الجدران واضحة القاع هي أكثر تكلفة من لوحات واضحة تماما. إذا كان واحد ينقل السائل الانارة لوحات بيضاء، لوحات بيضاء يمكن غسلها وإعادة استخدامها، مما يوفر على تكلفة استخدام لوحات بيضاء جديدة لكل تجربة. نقل السائل وبالتالي الخيار أرخص على المدى الطويل.
   2. البوب ​​أي فقاعات الهواء قبل قراءة لوحة بإبرة أو، ويفضل، مع الهواء القسري من البلاستيك لمبة ماصة نقل. قراءة لوحة على luminometer مع 1 ثانية التكامل الوقت (recomme الشركةتفاحة 0.25-1 ثانية الوقت التكامل كاف). قراءة لوحة 10-12 دقيقة بعد إضافة ATP الكواشف مقايسة. توقيت حرج للمقارنة عبر لوحات مختلفة، وذلك لأن إشارة الانارة هو عابر مع معدل تسوس بسرعة، كما هو مبين من قبل جيلبرت وزملاؤه ^26.
3. متوسط ​​القيم الانارة من 3 أو 6 آبار في كل مجموعة والحبكة بوصفها وظيفة من عدد الخلايا في مخطط التشتت (انظر الشكل 3). أول طرح متوسط ​​خلفية القيم التلألؤ من الآبار الفارغة المناسبة (الآبار 2B - 2G والآبار 11B - 11D، والآبار 11E - 11G) من كل نقطة البيانات المقابلة. سيكون هناك ثلاث مجموعات مختلفة لكل كثافة الطلاء في هذا الأولي (2A الشكل) التجربة. مستويات ATP قد تكون مرتبطة خطيا مع كثافة خلية في واحد أو كل من هذه المجموعات. المضي قدما وفقا لأعلى التخفيف من الكواشف التي لا تزال تعطي نتائج مرضية لانقاذ على التكاليف. وصفت معايير للحصول على نتائج مرضية طن القسم نتائج.
   ملاحظة: مع وسائل الإعلام المستخدمة في الدراسة الحالية، والقيم الخلفية مع هذا الاختبار ليست مرتفعة، ومن الممكن لتخطي آبار فارغة. ومع ذلك، فإن الشركة المصنعة PROMEGA تقارير الاختلافات في التألق مع وسائل الإعلام ثقافة مختلفة. يستخدم هذه الدراسة Hyclone الجنين استنساخ الثالث، نسخة تركيبية من مصل بقري جنيني لخلايا N2A ومصل العجل البقري للثقافات القشرية الأولية. وفقا لالصانع، ويقلل مصل العجل القيم التلألؤ ولكن لا تقلل من حساسية الفحص. ومع ذلك، إذا كان هذا هو مصدر قلق كبير، وتمييع ATP الكواشف مقايسة في برنامج تلفزيوني بدلا من وسائل الاعلام في وقت الفحص.
   1. إذا تظهر الخلايا لتنمو بشكل غير متساو عبر الأعمدة بين عشية وضحاها، في محاولة منهم يعاير في غضون 6 ساعة من الطلاء. ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن كثافة في الوقت المعتاد للمقايسة (على سبيل المثال، 24 ساعة بعد العلاج) هو الكثافة الذي يجب أن يتحقق الخطي.

3. Infrareد فحوصات

1. في صباح اليوم التالي والطلاء، وإصلاح الخلايا في لوحة ثانية في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. تأكد من ارتداء القفازات لهذه الخطوة والتخلص من النفايات الكيميائية كما تثبيتي لأن الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة. إضافة 4٪ الفورمالديهايد و 4٪ سكروز في العازلة الفوسفات 0.1 M إلى وسائل الإعلام الموجودة في 1:1 التخفيف. ويمكن أيضا أن وسائل الإعلام أن يغسل مع برنامج تلفزيوني قبل تحديد في كامل القوة تثبيتي. إما التقنية تعمل بشكل جيد.
   1. احتضان في تثبيتي لمدة 20 دقيقة ثم إزالة تثبيتي، وغسل 3X في 200 ميكرولتر PBS.
2. تخزين لوحة في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ أزيد الصوديوم في 4 درجات مئوية إذا كان سيتم فحص لا يأخذ مكان في نفس اليوم. خلاف ذلك، والمضي قدما مع مقايسة ووضع الخلايا في عرقلة الحل لتقليل ملزم غير محدد من الأجسام المضادة.
   1. تمييع الأسماك المصل أوديسي كتلة 1:1 في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.3٪ تريتون X-100 على أنه permeabilizer الخلية. تقديم ما يكفي من الحل الحجب وكذلك antibo الابتدائي والثانويحلول دى بحيث يمكن pipetted 35 ميكرولتر في كل بئر. ومع ذلك، إذا كان الكثير من الفقاعات لوحظ خلال pipetting ل، وجعل> 50 ميكرولتر لكل بئر، وإلا فقاعات تصل بسرعة إلى الخلايا والأجسام المضادة كتلة من ملزمة. سوف تظهر فقاعات الصابون المفرط باعتبارها بقعة دائرية غير ملوثين في منتصف البئر. محاولة لضبط pipetting لفي حالة حدوث ذلك.
   2. احتضان هذا الحل في حجب لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن أيضا 5٪ ألبومين المصل البقري أو الأمصال العادي من نفس الأنواع من الأجسام المضادة الثانوية أن تستخدم عرقلة الحلول لانقاذ على تكاليف كتلة مصل الأسماك. يمكن عرقلة الحلول تؤثر على أداء الأجسام المضادة. وبالتالي، فإن كتلة الأمثل لكل الأجسام المضادة هي أفضل تحدد تجريبيا.
      ملاحظة: بعض المحققين في وضع خلية لوحات الغربية على الهزازات خلال حضانات. ومع ذلك، هذا ليس ضروريا.
3. جعل الأجسام المضادة الأولية: 1:10،000 التخفيف لمكافحة α-تويولين(وحيدة النسيلة الماوس، الجدول 1) و1:2،000 التخفيف لمكافحة MAP2 (الماوس وحيدة النسيلة، الجدول 1). هذه الأجسام المضادة هي بروتينات محددة إلى الاهتمام بهذه النماذج الخلوية؛ خصوصية أمر ضروري لأية وصمة عار immunocytochemical.
   ملاحظة: MAP2 هو علامة للحصول على الخلايا العصبية وغير مناسبة لالثقافات العصبية / الدبقية مختلطة. ثقافات ما بعد الولادة هو موضح هنا تحتوي أيضا على بعض الدبقية (~ 25٪) وذلك لأن الخلايا النجمية تظهر لأول مرة في يوم 18 الجنينية، مع أعدادهم تبلغ ذروتها في فترة الوليد المبكرة ^27،28. يمكن للمرء أن لا يميز بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في ATP وDRAQ5 + الياقوت المقايسات. من أجل قياس الخلايا العصبية والخلايا النجمية بشكل منفصل، استخدم MAP2 في وقت واحد وتلطيخ GFAP في القنوات نانومتر 800 و 700، كما وصفها Mullett وزملاؤه ^4،29، تاركة DRAQ5 + الياقوت. ومع ذلك، إذا كان كل الخلايا في الثقافة ترغب في أن تقيم، استخدم علامة عموم الخلوية مثل α-تويولين، β-الأكتين، أو GAPDH.
   ملاحظة: وقد تم تحسين هذه التخفيفات لN2A والخلايا القشرية الأولية والتعميم قد لا إلى كل نموذج. لذا، حاول اثنين على الأقل من التخفيفات الأجسام المضادة الأولية، واحدة على النصف الأيسر من لوحة واحدة على النصف الأيمن (انظر الشكل 2B). بدلا من ذلك، حاول 3-4 التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية في 3 آبار لكل منهما. على سبيل المثال، والتخفيف الموصى بها على ورقة الضد يمكن إدراج يحيط مع التغييرات شقين. وبعبارة أخرى، إذا كان التخفيف الموصى بها للكيمياء سيتولوجية مناعية هو 1:500، 1:250 وأيضا محاولة 1:1،000 عوامل التخفيف.
   1. تمييع الأجسام المضادة في 1:01 كتلة أوديسي: برنامج تلفزيوني وإضافة 0.3٪ تريتون-X. لانقاذ على تكاليف، ومحاولة جعل الأجسام المضادة في عرقلة الحل الذي تم تطبيقه على الخلايا في الخطوة 3.2.1 عن طريق إزالة هذا الحل في نهاية الحضانة. إبقاء الخلايا في برنامج تلفزيوني حين نفعل ذلك، بل يجب أن لا تجف.
   2. احتضان في الأجسام المضادة الأولية إما 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لضعيفة بinding الأجسام المضادة والبروتينات التي ليست وفيرة، ويمكن أن تساعد على زيادة حضانات بين عشية وضحاها إشارة.
      ملاحظة: اترك على الأقل 3 آبار في عرقلة الحل للالطرح الخلفية في كل تركيز الضد الثانوية (الآبار 2B-2D و 2E-2G الآبار في الشكل 2B). لا تعرض هذه الآبار إلى أي الأجسام المضادة الأولية على الإطلاق. أنها تكشف عن مدى غير محدد ملزمة من قبل الأجسام المضادة الثانوية ومفيدة لحسابات نسب الإشارة إلى الضوضاء. إذا كان هناك قلق من أن الأجسام المضادة الثانوية سوف يؤدي إلى مستويات عالية من الربط غير محددة، وتشمل أيضا آبار المراقبة التي لم يتم كشفها إلى الضد إما الابتدائية أو الثانوية ولكن الحصول على نفس العدد من يغسل. والفرق بين هذه الآبار و"الثانوية فقط" آبار تكشف مدى غير محدد ملزم الناجمة عن الأجسام المضادة الثانوية وحدها. في اختبار لدينا على الماوس الخلايا N2A، مع شدة الإشارة مكافحة فأر الضد الثانوية وحدها كانت 0.557 ± 0.032، إشارة مع المضادة للأرنبكان الضد الثانوية وحدها 0.533 ± 0.041، مع عدم وجود إشارة الضد الثانوية و0.357 ± 0.003، وكان إشارة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية 11.867 ± 0.911. نكون بذلك قد لا تراعى مستويات عالية من الربط غير محددة حتى عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس على خلايا الفأر. وهناك العديد من الشركات الصانعة للالأجسام المضادة الثانوية الأشعة تحت الحمراء، ونحن نوصي فقط شراء تلك عالية عبر كثف. نلاحظ أن تركيز الأجسام المضادة مفتش الثانوي قد تختلف تبعا للمصدر.
4. يغسل الأجسام المضادة الأولية مع 3 يغسل من 200 ميكرولتر لكل بئر برنامج تلفزيوني، 10 دقيقة لكل منهما. يمكن حفظ الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية لمدة بضعة أسابيع في 0.2٪ أزيد الصوديوم وإعادة استخدامها حتى تصبح بقع صغيرة من الحطام وضوحا عندما تقام الحلول حتى الضوء. يتم ذلك فقط لانقاذ على التكاليف. إذا كانت التكلفة ليست قضية، وجعل الأجسام المضادة جديدة لكل استخدام.
5. تمييع الضد الثانوي بحلول 1:1،000 أو 1:2،000 في 1:01 كتلة أوديسي: برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريطن-X (الشكل 2B). إضافة إلى التخفيف 1:1،000 النصف العلوي من لوحة و1:2،000 إلى النصف السفلي من اللوحة. هذه التركيزات يمكن تخفيض أخرى لانقاذ على التكاليف، ولكن تحقق لالخطي قبل الالتزام بذلك.
   ملاحظة: تأكد من إضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لآبار الطرح الخلفية (عمود 2 في الشكل 2B).
   1. إذا كان سيتم يعاير بروتين الثانية في مكان DRAQ5 + الياقوت، والخلايا تسمية α-تويولين أو MAP2 مع 700 نانومتر الماعز المضادة للماوس مفتش والبروتين الثاني في القناة 800 نانومتر مع الأجسام المضادة الأولية من الأنواع الأخرى من الماوس. قناة نانومتر 800 لديه الخلفية أقل من 700 نانومتر القناة ويجب أن تكون محفوظة للبروتين الأكثر أهمية من الفائدة.
   2. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في درج بعيدا عن الضوء.
6. يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع 3 يغسل من 200 ميكرولتر لكل بئر برنامج تلفزيوني، 10 دقيقة لكل منهما.
7. جعل الحلول DRAQ5 + الياقوت. في النصف الأيسر من لوحة، وتمييع DRAQ5 1:10،000 (0.5 ميكرومتر تركيز النهائي) والياقوت 1:1000 في برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون-X (الأعمدة 3-6؛ الشكل 2B). للنصف الأيمن من لوحة، وتمييع DRAQ5 1:20،000 (0.25 ميكرومتر) والياقوت 1:2000 (الأعمدة 7-10؛ الشكل 2B).
   ملاحظة: DRAQ5 المستخدمة ليتم بيعها في الأوراق المالية 1 ملم بدلا من الأسهم 5 ملم. لذا تستخدم بعض التقارير المنشورة سابقا 1:4،000 أو 1:2،000 التخفيفات من DRAQ5 ^8.
   1. لانقاذ على التكاليف، إذا كان يتم يعاير اثنين من لوحات في وقت واحد، ونفس DRAQ5 + حلول الياقوت يمكن استخدامها على اثنين من لوحات في تسلسل، pipetting لتشغيله لوحة الأول وإضافته إلى الثاني. إذا كان سيتم استخدام نفس حلول مرتين بهذه الطريقة، واستخدامها في غضون يوم واحد. لا يمكن حفظ الحلول DRAQ5 المخفف + الياقوت في 4 درجات مئوية أو تجميدها لاستخدامها لاحقا.
   2. احتضان في هذه الحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا وضوء مدمج. إذا كان الوقت قصيرا ولن يتم إعادة استخدام DRAQ5 + حلول الياقوت على لوحات أخرى مع المرتبات الثانية مختلفة، إضافة إلى هذه البقع الحلول الضد الثانوية في الخطوة 3.5 واحتضان لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: لا إضافة DRAQ5 + حل الياقوت إلى الآبار الطرح الخلفية (عمود 2 في الشكل 2B) كما لا ينبغي أن تكون ملطخة هذه الآبار في القناة 700 نانومتر.
8. غسل 3X لوحة مع 200 ميكرولتر لكل بئر برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما. وضع 0.2٪ أزيد الصوديوم في غسل PBS النهائي إذا كانت لوحة ستكون ملطخة الأخرى الأجسام المضادة الثانوية مرئية المدى بعد التصوير بالأشعة تحت الحمراء كاملة.
9. تفحص اللوحة على تصوير أوديسي. تبدأ عن طريق المسح الضوئي لوحات في كثافة 5 و 169 مم القرار. إما "جودة متوسطة" أو إعدادات "جودة منخفضة" كافية. الشركة لا يعفي معلومات مفصلة مرشح الإثارة / الانبعاثات. ومع ذلك، فإن المرشحات الانبعاثات ما يقرب من 20 نانومتر واسعة، وتتمحور حول 720 و 820 نانومتر، وفقا إلى الشركة المصنعة.
   ملاحظة: من الممكن لمسح لوحات في حين لا يزال الرطب كما قد يرغب المحققون على مواصلة وصمة عار لهم مع علامات أخرى. ومع ذلك، تقترح الشركة في بروتوكول الإنترنت من أن لوحات الجافة يؤدي إلى انتشار أقل جيدا إلى إشارة جيدا. إذا كنت تفحص لهم على حد سواء الرطب والجاف ثم مقارنة البيانات، تأكد من إزالة كل برنامج تلفزيوني من البئر بسبب الأملاح المتبقية بعد تبخر يمكن أن يؤدي إلى مضان الخلفية عالية على طول الحواف.
   1. الأوديسة تصوير بالاشعة فوق وخلال الجزء السفلي من اللوحة. لوحات من مختلف الصانعين قد يطلبون إزاحة التركيز مختلفة لأن الجزء السفلي من الآبار يمكن أن تختلف في السمك والعمق في اللوحة. محاولة المسح في إزاحة التركيز مختلفة، وترى فيها أعلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء وcrispest (أكثر في التركيز) ويتحقق إشارة: 2.5 ملم، 3.0 ملم، 3.5 ملم، 4.0 ملم. أيضا في محاولة لقياس عمق البئر من أسفل لوحة مع حاكم لتأكيد findinع على الأوديسة. تذكر أن البلاستيك في قاع البئر يمكن أن تضيف ارتفاع إضافي للمقاييس المسطرة. لوحات COSTAR المستخدمة في الدراسة الحالية تتطلب التركيز إزاحة 4.0 ملم.
   2. استخدم الدالة في خلية الغربية في البرنامج لوضع الشبكة ذات حجم مناسب على صورة لوحة وتصدير البيانات إلى Microsoft Excel. دراسة "كثافة متكاملة" القيم من نفس الآبار عبر إزاحة التركيز مختلفة للعثور على أعلى القيم مضان. التركيز تعويض يمكن أن ينتج أعلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء (في إشارة الآبار immunostained مقابل "أي سيطرة السلبية الأولية" آبار) هو واحد أن يختار الآخرة.
   3. بمجرد قررت التركيز على تعويض واحد، تفحص مرة أخرى على دفعات صغيرة. على سبيل المثال، إذا كان ألمع إشارة عند 3.5 و 4.0 ملم، في محاولة المسح على 3.6، 3.7، 3.8، و 3.9 ملم ومعرفة ما إذا كان هناك أي مزيد من التحسن في قوة الإشارة. إذا كان التركيز تعويض خطأ، شدة إشارة عبر 12 عمودا على رر فارغةأكلت (عندما ينبغي أن يكون كافة الأعمدة إشارة المساواة) وسوف تظهر كما منحنى على شكل حرف U بدلا من خط مستو. إذا كان هذا لا يزال يشكل مشكلة مع لوحات من البلاستيك، في محاولة لوحات ذات القاع الزجاجي.
10. طرح متوسط ​​شدة المتكاملة في الخلفية الآبار الطرح (الشكل 2B؛ الآبار 2B - 2D أو الآبار 2E - 2G) من كل نقطة البيانات المقابلة في القنوات نانومتر 700 و 800. ثم متوسط ​​شدة إشارة متكاملة لكل مجموعة من الآبار. رسم البيانات بمثابة مخطط التشتت ضد كثافة الخلايا (انظر الشكل 3).
    1. مقارنة نتائج اثنين من التخفيفات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية ونتائج اثنين من التخفيفات مختلفة من DRAQ5 + الياقوت ليستقر على التخفيف احد في كل من التجارب اللاحقة. إذا لم يتحقق الخطي، في محاولة المسح في كثافة مختلفة. إعادة تفحص مع شدة 3 و 7 بدلا من 5 وreanalyze البيانات. إذا تحسين البيانات في واحدة من تلك الشدة ولكنلا تزال غير مرضية، إعادة تفحص بزيادات حول أن كثافة.
    2. يجب الحرص على عدم تحليل الصور حيث يظهر البرنامج بقع بيضاء في الآبار؛ تلك البقع يعني إشارة المشبعة خارج نطاق من تصوير. مسح في كثافة أقل في حالة حدوث ذلك.
    3. إذا لم يتحقق الخطي، في محاولة أيضا لإصلاح الخلايا في غضون 6 ساعة من الطلاء لأنها قد تنمو بشكل غير متساو أو يموت في أعمدة مختلفة بين عشية وضحاها. أيضا محاولة كثافة الطلاء المختلفة، شدة المسح المختلفة، مزيد من التحسينات من العوامل كاشف التخفيف، لوحات ذات القاع الزجاجي، DRAQ5 في حد ذاته بمثابة وصمة عار النواة فقط، أو الأجسام المضادة المختلفة الأخرى من مكافحة α-تويولين أو المضادة للMAP2.

النتائج

عامل معدل الحد في هذه التجارب هو تلطيخ الأشعة تحت الحمراء، وفحص ATP هو وجيزة نسبيا من حيث المدة. لفحوصات بالأشعة تحت الحمراء، ونحن نتوقع أن ثماني لوحات 96 بشكل جيد يمكن أن تكون ملطخة ومسحها ضوئيا في غضون يوم واحد بواسطة مذهلة دفعتين من أربع لوحات لكل منها (انظر الشكل...

Discussion

لقد وجدنا أن قوة الإشارة في جميع المقايسات بقاء ثلاثة هي الخطية والمترابطة مع كثافة الطلاء. ومع ذلك، ليس كل المقايسات حساسة بالتساوي على 2 أضعاف أو تغييرات 1.5 أضعاف في كثافة الطلاء. لخلايا N2A، والأشعة تحت الحمراء هي فحوصات أقل حساسية من فحص ATP، ولا سيما في أقل كثافة الط?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555