I saggi di redditività per le cellule in coltura

Riepilogo

Composti terapeutici sono spesso prima esaminate in vitro con saggi di vitalità. Conta delle cellule cieche da un osservatore umano può essere molto sensibile alle piccole variazioni di numero di cellulare, ma non valutare la funzione. Test di vitalità computerizzati, come qui descritto, in grado di valutare sia la struttura e la funzione in modo obiettivo.

Abstract

Conta delle cellule manuali su un microscopio sono un mezzo sensibile per valutare la vitalità cellulare, ma sono in termini di tempo e quindi costoso. Test di vitalità computerizzati sono costose in termini di attrezzature, ma può essere più veloce e più obiettivo di conta delle cellule manuali. La presente relazione descrive l'uso di tre di questi test di vitalità. Due di questi saggi sono infrarossi e uno è luminescente. Entrambi i saggi infrarossi si basano su un Imager Odyssey 16 bit. Un saggio infrarossi utilizza la macchia DRAQ5 per nuclei combinati con la macchia zaffiro per citosol e viene visualizzato nel canale 700 nm. L'altra analisi a raggi infrarossi, un In-Cell occidentale, utilizza anticorpi contro le proteine ​​del citoscheletro (α-tubulina o microtubuli proteina associata 2) e le etichette nel canale 800 nm. Il terzo saggio vitalità è un saggio luminescente comunemente usato per ATP, ma usiamo un quarto del volume consigliato di risparmiare sui costi. Queste misurazioni sono affatto lineare e correlazione con il numero di ceLLS placcato, ma variano in sensibilità. Tutti e tre saggi eludere microscopio che richiede tempo e assaggiare l'intero bene, riducendo errore di campionamento. Infine, tutti i saggi possono facilmente essere completata entro un giorno della fine dell'esperimento, consentendo un maggior numero di esperimenti da eseguire entro brevi tempi. Tuttavia, tutti si basano sul presupposto che il numero di cellule rimangono in proporzione alla potenza del segnale dopo il trattamento, un presupposto che a volte non viene soddisfatta, soprattutto per ATP cellulare. Inoltre, se le cellule aumentano o diminuiscono in dimensioni dopo il trattamento, questo potrebbe influenzare la potenza del segnale senza compromettere numero di cellulare. Concludiamo che tutti i saggi di redditività, inclusi i conteggi manuali, risentono di una serie di avvertimenti, ma che i test di vitalità informatici sono ben merita l'investimento iniziale. Utilizzando tutti e tre saggi insieme produce una visione completa della struttura e della funzione cellulare.

Introduzione

Il saggio vitalità più comune nelle scienze biologiche comporta la conta delle cellule. Ciò è dimostrato da un'analisi delle superiori (più recenti) 200 pubblicazioni apparse in PubMed sia con le parole chiave "in vitro" o "cultura" a 2013/04/29 e 2013/04/30. Di queste pubblicazioni, il 23,5% utilizzati saggi di conta delle cellule, compresi i manuali numero di cellulare conteggi, numero di cellulare automatizzata conta con il software di imaging, e Trypan esclusione blu. Il / dosaggio Morto Live è stato usato in 1% di queste pubblicazioni. Il numero di pubblicazioni che utilizzano il MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) test per la vitalità metabolica era l'11%. Questa rassegna della letteratura mostra anche che il numero di pubblicazioni usando saggi come MTT in combinazione con saggi conteggio cellulare era solo 3,5%. Nonostante la tendenza ad utilizzare un dosaggio vitalità di per sé, la valutazione della funzione cellulare in associazione con il numero di cellule sembra la scelta migliore per valutare i cellularintegrity. Conta delle cellule da soli non sono sufficienti perché le cellule rimanenti non possono essere funzionali o sani anche se sono presenti nel pozzo ^1,2. Viceversa, misure funzionali quali ATP possono aumentare o diminuire in assenza di variazioni parallele nel numero di cellule. Il disaccoppiamento di letture metaboliche da numero di cellulare suggerisce che ATP e MTT test non dovrebbero mai essere utilizzati come unico saggio di redditività. Nella presente relazione, tre saggi di vitalità che il sondaggio sia le strutture cellulari e funzione metabolica sono descritti, per una visione più completa della integrità cellulare di qualsiasi test di per sé può permettersi.

Due dei nostri saggi richiedono un Termovisore che misura la fluorescenza nei canali 700 e 800 nm. Il rumore è basso nelle lunghezze d'onda infrarosse, portando a maggiori rapporti ³ segnale-rumore. L'imager Odissea che usiamo ha una gamma dinamica 4,5 log e un po 'profondità di 16, Translating di 2 ¹⁶ o 65.536 tonalità di infrarossi. Questo può essere contrapposta a immagini a colori a 8 bit, che offre solo 2 ⁸ o 256 tonalità di colore per ogni lunghezza d'onda. Così, a 16 bit di imaging ha una risoluzione più fine. Va notato che le immagini infrarosse originali vengono pseudocolored verde (800 nm) e rosso (700 nm) in rapporti pubblicati per la presentazione. Imager Odyssey sono comunemente utilizzati sia per Western blotting e In-Cell western ^4-7. In-Cell western sulle cellule formaldeide-fisso utilizzano anticorpi primari contro qualsiasi proteina di interesse ed etichettarli in giro con anticorpi secondari fluorescenti a raggi infrarossi. Questa tecnica è nota per essere particolarmente utile per gli endpoint fosforilazione ^6. Nella nostra In-Cell western, abbiamo macchiare cellule fissate per le proteine ​​del citoscheletro α-tubulina o microtubuli neuronali proteina associata 2 (MAP2) nel canale 800 nm. Queste proteine ​​sono abbastanza abbondanti per produrre elevati rapporti segnale-rumore. Abbiamo anche macchiare i nostri piatti in 700canale nm per nuclei con la macchia DRAQ5 e per il citoplasma con la macchia zaffiro. Entrambe le proteine ​​del citoscheletro e le DRAQ5 + macchie Sapphire riflettono quindi le strutture cellulari.

Il terzo saggio di redditività misura la funzione metabolica e si chiama "Cell Titer Glo." In questo saggio basato luciferasi-, valori di luminescenza sono direttamente proporzionali ai livelli di ATP. Saggi ATP sono comunemente usati per quantificare cellule vitali ^8-12. Tuttavia, compresa la parola "titolo" nel nome del saggio è un termine improprio perché ATP uscita per cella può cambiare in funzione di trattamenti tossina e quindi non è sempre proporzionale al numero di cellule ^8. Livelli di ATP possono anche essere influenzati da ritmi circadiani ¹³ e ¹⁴ la divisione cellulare e la differenziazione cellulare ^15. Tuttavia, il saggio ATP mostrato qui è semplice da eseguire e utile perché ATP è una misura robusta metabolicaredditività ^16-21, se non cellulare il numero di per sé. Usando questo test per completare l'infrarosso In-Cell western cede quindi un quadro più completo della integrità cellulare di qualsiasi saggio da solo.

Protocollo

Uno schema dei protocolli è illustrato in Figura 1.

1. Cella di placcatura

Cellule piastra in piastre da 96 pozzetti a diverse densità di placcatura (Figura 2). Per i controlli di linearità sulla linea cellulare di neuroblastoma N2a, piatto 2.5k, 5k, 10k e 15k cellule per pozzetto in 3 o 6 pozzetti / gruppo. Per i controlli di linearità di ratto neuroni corticali primarie, piatto 25k, 50k, 100k, 200k e cellule per pozzetto in 3 o 6 pozzetti / gruppo. Se le linee cellulari o cellule primarie di interesse aspetto sano a diverse densità di placcatura, piastra in e intorno alla densità cellulare ottimale per tale tipo di cellula.

Nota: In questo studio, le cellule N2a sono state placcate in 100 microlitri mezzi e neuroni corticali primarie in 200 microlitri media su piatti che sono progettati per minori evaporazione. Per informazioni dettagliate sulla manipolazione delle cellule, dei media, sieri, antibiotici e trattamenti di tossina, consultare Unnithan et al. per N2a cells ⁸ e Posimo et al. per le culture corteccia primaria ^22.

1. 1. Ripetere la placcatura su una seconda piastra a 96 pozzetti. Una piastra sarà saggiato per ATP (Figura 2A) e l'altro con i dosaggi infrarossi (Figura 2B). Non si può usare lo stesso piatto per l'ATP e saggi infrarossi perché le cellule devono essere lisate aperto per le misure di ATP intracellulari.
   2. Assicurati di piastra almeno 3 pozzi aggiuntivi per sottrazione del fondo nei saggi infrarossi alla densità di placcatura ottimale (colonna 2; Figura 2B).
2. Aggiungere supporti senza cellule o, più economico i, acqua sterile per i pozzi esterni nelle righe A e H e nelle colonne 1 e 12. Evitare di fare affidamento su dati provenienti da pozzi lungo i bordi, in quanto la redditività è spesso inferiore qui dagli effetti di evaporazione media e gradienti di temperatura. Tali problemi con micropiastre sono comunemente chiamati effetti di bordo ^23,24. Non tenere questi pozzi vuotiperché poi righe B e G e colonne 2 e 11 soffrono dell'effetto bordo.
   Effetti di bordo possono essere ridotti incubando una piastra appena seminati a temperatura ambiente in condizioni ambientali prima del trasferimento in CO ₂ incubatore ^24. Inoltre, un recente studio Carralot descrive un metodo di correzione matematica per micropiastre utilizzando una singola colonna di controllo ^23. Oliver e colleghi hanno usato un forzato microtitolazione aria piastra incubatore appositamente progettati per ridurre i gradienti termici ^25. Se l'effetto di bordo è particolarmente preoccupanti, camere stabilità micropiastra (ad esempio, BT & C Incorporated) possono essere acquistati per creare un microambiente omogeneo con elevata umidità e perfino gradienti di temperatura.
3. Se sono necessari più pozzi rispetto mostrato in Figura 1 perché diluizioni dei reagenti supplementari o più densità di placcatura saranno testati, utilizzare i pozzi bordi per sottrazione del fondo.
4. Aspettate la notte per l'attaccodi cellule e test la mattina successiva come descritto di seguito.

2. Luminescenti ATP Assay

1. Seguire le raccomandazioni del cellulare Titer Glo quelle del per la ricostituzione del substrato con tampone e per i tempi di incubazione.
   1. Togliere 50 o 150 microlitri supporti da 100 o 200 ml di mezzi di placcatura, rispettivamente. Poco meno di 50 microlitri rimarranno dietro nel pozzo. Aggiungere 25 ml di reagenti (substrato con soluzione tampone) alle colonne 2-6 (Figura 2A) in una diluizione 1:2.
      Nota: Variando volumi di supporti lasciati alle spalle dopo la rimozione potrebbe diluire o concentrare i reagenti del dosaggio ATP differenziale di tutti i pozzetti. Fate attenzione a garantire che il livello del liquido in tutti i puntali delle pipette multicanale è equivalente. Misurare il liquido restante nel selezionare pozzetti attraverso la piastra con una pipetta immediatamente prima di aggiungere i reagenti del test ATP per assicurare la precisione. Se l'alta variabilità esiste da differenziali di media evaporzione attraverso la superficie della piastra, rimuovere tutti i vecchi media e aggiungere lo stesso volume di mezzi freschi o tampone fosfato salino (PBS) a tutti i pozzetti immediatamente prima aggiunta di reagenti di saggio ATP. Se le piastre soffrono di livelli variabili di evaporazione, provare a passare alle piastre di evaporazione bassi da Corning Costar. In questi ultimi piastre, i 60 pozzi interni illustrati nella Figura 2 soffrono solo da una media di 0,995% ± 0,41 supporti evaporazione durante la notte. Vi è quindi trascurabile variabilità nel volume del supporto al momento del dosaggio.
   2. Nelle colonne da 7 a 11, le righe B a D, rimuovere il supporto in 50 microlitri lasciare alle spalle, come descritto sopra, e aggiungere 50 ml di reagenti in una diluizione 1:1.
   3. Nelle colonne da 7 a 11, le righe E a G, lasciare le cellule in 100 microlitri di media e aggiungere 100 ml di reagenti, di nuovo in una diluizione 1:1. La società raccomanda che 100 ml di reagenti devono essere diluiti 1:1 in 100 ml di media.
      Nota: Al fine diper risparmiare sui costi, è possibile tagliare queste raccomandazioni sia in volume che in diluizione. Tuttavia, prima di fare questo, assicurarsi che non riduca la linearità e sensibilità del saggio.
   4. Una volta che un volume specifico e fattore di diluizione dei reagenti si trovano ad essere soddisfacenti, bastone con loro in tutti gli esperimenti successivi. I criteri di dati soddisfacenti sono descritti nella sezione dei risultati.
   5. Reagenti ricostituiti non utilizzati possono essere ricongelati e utilizzati in un secondo momento per risparmiare sui costi. Secondo il costruttore, reagenti ricostituiti possono essere conservati a -20 ° C per 21 settimane con perdita ~ 3% dell'attività.
2. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale per 2 minuti o un agitatore oscillante per 10 min. Se una parte della piastra viene saggiato per una misura diversa e non può essere scosso, agitare il supporto con semplice pipettaggio-up e down solo nei pozzetti di interesse. Tuttavia, bolle eccessivi generati durante questa fase interferiscano con lumiUscita nescent.
   1. 10 min dopo l'aggiunta dei reagenti, trasferire 60 ml di contenuto e in piastre da 96 pozzetti bianchi. I valori di luminescenza sono più alti in bianco piatti che in lastre trasparenti o neri perché riflettono la luce verso l'alto verso il rivelatore.
      Nota: Nella nostra esperienza, le cellule sopravvivono meglio sulla bassa evaporazione, piastre Costar chiare rispetto ad altri piatti. Queste piastre specifici non sono venduti con pareti bianche. In secondo luogo, le lastre opache con pareti chiare e fondo sono più costosi rispetto alle piastre completamente chiari. Se si trasferisce il liquido luminescente a targhe bianche, le piastre bianche possono essere lavati e riutilizzati, risparmiando sul costo delle nuove utilizzando piastre bianche per ogni esperimento. Trasferimento di liquido è quindi la soluzione meno costosa nel lungo periodo.
   2. Pop eventuali bolle d'aria prima della lettura della piastra con un ago o, preferibilmente, con aria forzata da un bulbo trasferimento pipetta di plastica. Leggere la piastra su un luminometro con un tempo di integrazione 1 sec (la società recommends 0,25-1 sec tempo di integrazione sufficiente). Leggere la piastra 10-12 minuti dopo l'aggiunta di reagenti del dosaggio ATP. Il tempismo è fondamentale per il confronto tra diversi piatti, perché il segnale luminescente è transitoria con un tasso di decadimento veloce, come dimostrato da Gilbert e colleghi ^26.
3. La media dei valori luminescenti dai 3 o 6 pozzetti in ciascun gruppo e trama in funzione del numero di cellule in un grafico a dispersione (vedi Figura 3). Prima di sottrarre la media dei valori di fondo di luminescenza dei pozzi vuoti appropriate (pozzi 2B - 2G, pozzi 11B - 11D, e pozzi 11E - 11G) da ciascun punto dati corrispondente. Ci saranno tre diversi gruppi per ogni densità di placcatura in questo esperimento iniziale (Figura 2A). Livelli di ATP possono essere linearmente correlati con densità cellulari in uno o tutti questi gruppi. Procedere con la più alta diluizione dei reagenti che dà ancora risultati soddisfacenti per risparmiare sui costi. Criteri di risultati soddisfacenti sono descritti in sezione dei risultati.
   Nota: Con i supporti utilizzati nel presente studio, i valori di fondo con questo test non sono elevati ed è possibile saltare i pozzetti del bianco. Tuttavia, il produttore Promega riporta le differenze di luminescenza con i media cultura diversa. Il presente studio utilizza Hyclone fetale Clone III, una versione sintetica di siero fetale bovino per le cellule N2a e siero di vitello bovini per colture corticali primarie. Secondo il costruttore, siero di vitello diminuisce valori di luminescenza ma non diminuisce la sensibilità del saggio. Tuttavia, se questo è di rilevante interesse, diluire ATP reagenti di saggio in PBS anziché media al momento del test.
   1. Se le cellule sembrano svilupparsi in modo non uniforme tra le colonne durante la notte, prova a saggiare entro 6 ore di placcatura. Tuttavia, tenere a mente che la densità al solito orario di dosaggio (ad esempio, 24 ore dopo il trattamento) è la densità a cui linearità deve essere raggiunto.

3. Infrared Saggi

1. La mattina dopo placcatura, fissare le cellule nella seconda piastra a temperatura ambiente in una cappa aspirante. Assicuratevi di indossare i guanti per questo passaggio e smaltire il fissativo come rifiuto chimico, perché la formaldeide è cancerogena. Aggiungere formaldeide al 4% e il 4% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M ai media esistente in una diluizione 1:1. Il supporto può anche essere lavato con PBS prima di fissare in fissativo piena forza. In entrambi i casi la tecnica funziona bene.
   1. Incubare in fissativo per 20 minuti e poi rimuovere il fissativo e lavare 3 volte in 200 microlitri di PBS.
2. Conservare la piastra in PBS con 0,2% di sodio azide a 4 ° C se il test non avrà luogo lo stesso giorno. Altrimenti, procedere con il test e inserire le cellule in soluzione bloccante per minimizzare il legame non specifico degli anticorpi.
   1. Diluire il pesce siero Odyssey blocco 1:1 in PBS e aggiungere 0,3% Triton X-100 come permeabilizer cella. Fai la soluzione di saturazione abbastanza così come Antibo primaria e secondariaLe soluzioni dy modo che 35 ml possono essere pipettati in ogni pozzetto. Tuttavia, se un sacco di bolle osservati durante pipettaggio, rendere> 50 microlitri per ogni pozzetto, altrimenti le bolle raggiungono giù nelle cellule e gli anticorpi blocco dal legame. Bolle di sapone eccessive apparirà come un luogo senza macchia circolare al centro del pozzo. Provare a regolare il pipettaggio se questo si verifica.
   2. Incubare in questa soluzione bloccante per 30-60 min a temperatura ambiente.
      Nota: 5% di albumina sierica bovina o sieri normali dalla stessa specie come anticorpo secondario possono essere utilizzati anche come blocco soluzioni per risparmiare sul costo del blocco siero pesce. Blocco soluzioni in grado di influire sulle prestazioni degli anticorpi. Pertanto, il blocco ottimale per ciascun anticorpo è meglio determinato empiricamente.
      Nota: alcuni ricercatori collocano In-Cell piatti occidentali sul agitatori durante l'incubazione. Tuttavia, questo non è necessario.
3. Rendere gli anticorpi primari: 1:10.000 diluizione per l'anti-α-tubulina(Monoclonale di topo, Tabella 1) e 1:2.000 diluizione per anti-MAP2 (monoclonale di topo, tabella 1). Questi anticorpi sono specifici per le proteine ​​di interesse in questi modelli cellulari; specificità è essenziale per qualsiasi macchia immunocitochimica.
   Nota: MAP2 è un marcatore per i neuroni ed è adatto per colture neuronali / gliali miste. Le culture postnatali qui riportati contengono anche alcune glia (~ 25%) perché astrociti sembrano primo giorno embrionale 18, con i loro numeri picco nei primi anni del periodo neonatale ^27,28. Non si può distinguere tra astrociti e neuroni nel ATP e DRAQ5 + Sapphire saggi. Per misurare neuroni e astrociti separatamente, utilizzare MAP2 simultanea e GFAP colorazione nei canali 800 e 700 nm, come descritto da Mullett e colleghi ^4,29, tralasciando DRAQ5 + zaffiro. Tuttavia, se tutte le cellule nella coltura desiderano essere valutata, utilizzare un marcatore pan-cellulare come α-tubulina, β-actina, o GAPDH.
   Nota: Queste diluizioni sono stati ottimizzati per il N2a e cellule corticali primarie e non possono generalizzare ad ogni modello. Pertanto, provare almeno due diluizioni principali anticorpi, una sulla metà sinistra del piatto e uno nella metà destra (vedi Figura 2B). In alternativa, provate 3-4 diluizioni di anticorpi primari su 3 pozzetti ciascuno. Ad esempio, la diluizione raccomandata sul foglio inserto anticorpo può essere accompagnata da cambiamenti duplici. In altre parole, se la diluizione raccomandata per immunocitochimica è 1:500, 1:250 e provare anche 1/1.000 fattori di diluizione.
   1. Diluire gli anticorpi 1:1 blocco Odyssey: PBS e aggiungere 0,3% Triton-X. Per risparmiare sui costi, rendere gli anticorpi nella soluzione bloccante che è stato applicato alle celle nel passo 3.2.1 rimuovendo questa soluzione al termine dell'incubazione. Mantenere le cellule in PBS mentre si fa questo, non devono asciugare.
   2. Incubare in anticorpi primari o 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Per debolmente binding anticorpi e proteine ​​che non sono abbondanti, incubazioni overnight possono contribuire ad aumentare il segnale.
      Nota: Lasciare almeno 3 pozzi nel bloccare soluzione per la sottrazione del fondo per ogni concentrazione anticorpo secondario (pozzi 2B-2D e pozzi 2E-2G in Figura 2B). Non esporre questi pozzi a qualsiasi anticorpo primario di sorta. Essi rivelano il grado di legame non specifico per l'anticorpo secondario e sono utili per i calcoli di rapporti segnale-rumore. Se c'è una preoccupazione che gli anticorpi secondari porterà ad alti livelli di legame non specifico, comprendere anche pozzetti di controllo che non sono esposte all'anticorpo primario o secondario ma ricevono lo stesso numero di lavaggi. La differenza tra questi pozzetti e le "secondario solo" pozzi rivelerà il grado di legame non specifico causato dal anticorpo secondario solo. Nel nostro test su cellule di topo N2a, intensità del segnale con l'anticorpo secondario anti-topo alone era 0,557 ± 0,032, il segnale con anti-conigliosolo anticorpo secondario era 0,533 ± 0,041, segnale senza anticorpo secondario è stato 0,357 ± 0,003, e il segnale con anticorpi primari e secondari era 11,867 ± 0,911. Non abbiamo così constatato alti livelli di legame non specifico anche quando si utilizza anticorpi secondari anti-topo su cellule di topo. Ci sono diversi produttori di anticorpi secondari infrarossi; si consiglia di acquistare solo quelli altamente cross-adsorbite. Si noti che la concentrazione di anticorpi secondari IgG può variare a seconda della fonte.
4. Lavare anticorpi primari con 3 lavaggi di 200 microlitri di PBS per pozzetto, 10 min ciascuno. Gli anticorpi primari possono essere salvati a 4 ° C per un paio di settimane nello 0,2% di sodio azide e riutilizzati fino a minuscoli granelli di detriti diventano evidenti quando le soluzioni sono tenuti fino alla luce. Questo viene fatto solo per risparmiare sui costi. Se il costo non è un problema, gli anticorpi freschi per ogni uso.
5. Diluire l'anticorpo secondario da 1:1.000 o 1:2.000 1:1 blocco Odyssey: PBS con 0,3% Triton-X (Figura 2B). Aggiungere la diluizione 1:1000 per la metà superiore della piastra e 1:2.000 per la metà inferiore della piastra. Tali concentrazioni potrebbero essere ulteriormente ridotti per risparmiare sui costi, ma verificare la linearità prima di impegnarsi in questo.
   Nota: Assicurarsi di aggiungere la soluzione di anticorpo secondario appropriato sfondo pozzetti di sottrazione (colonna 2 nella Figura 2B).
   1. Se una seconda proteina verrà saggiata in luogo di DRAQ5 + zaffiro, cellule etichetta per α-tubulina o MAP2 con 700 nm di capra anti-IgG di topo e la seconda proteina nel canale 800 nm con anticorpi primari da una specie diversa mouse. Il canale nm 800 ha meno di fondo rispetto al canale 700 nm e dovrebbe essere riservato per la proteina più critico di interesse.
   2. Incubare in anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente in un cassetto al riparo dalla luce.
6. Lavare anticorpi secondari con 3 lavaggi di 200 microlitri di PBS per pozzetto, 10 minuti ciascuno.
7. Effettuare le soluzioni DRAQ5 + Sapphire. Per la metà sinistra del piatto, diluire DRAQ5 1:10.000 (0,5 micron concentrazione finale) e Sapphire 1:1000 in PBS con 0,3% Triton-X (colonne 3-6, Figura 2B). Per la metà destra del piatto, diluire DRAQ5 1:20.000 (0,25 micron) e Sapphire 1:2000 (colonne 7-10; Figura 2b).
   Nota: DRAQ5 utilizzato per essere venduto ad un archivio di 1 mm invece di uno stock di 5 mm. Alcuni rapporti pubblicati in precedenza utilizzati, pertanto 1:4,000 o 1:2.000 diluizioni di DRAQ5 ^8.
   1. Per risparmiare sui costi, se due piastre vengono dosati contemporaneamente, le stesse soluzioni zaffiro DRAQ5 + possono essere utilizzati sulle due piastre in sequenza, pipettando fuori la prima piastra e aggiungendolo al secondo. Se vengono utilizzati due volte le stesse soluzioni in questo modo, usarli entro un giorno. Le soluzioni DRAQ5 diluito + Sapphire non possono essere salvate a 4 ° C o congelati per un uso successivo.
   2. Incubare in queste soluzioni per 30 minuti a temperatura ambiente lontano fluce rom. Se il tempo è breve e le DRAQ5 + soluzioni Sapphire non viene riutilizzato in altre lastre con differenti secondari, aggiungere queste macchie alle soluzioni anticorpo secondario nel passaggio 3.5 e incubare per 1 ora.
      Nota: Non aggiungere DRAQ5 soluzione + Sapphire a sfondo pozzetti di sottrazione (colonna 2 nella figura 2B), come questi pozzi non devono essere colorati nel canale 700 nm.
8. Lavare le piastre 3x con 200 microlitri di PBS per pozzetto per 10 minuti ciascuno. Mettere 0,2% di sodio azide nel lavaggio finale PBS se il piatto sta per essere colorate con altri anticorpi secondari visibile raggio dopo l'imaging a raggi infrarossi è completa.
9. Scansione la piastra su un Odyssey Imager. Iniziare la scansione le piastre a intensità 5 e 169 mm risoluzione. O "qualità media" o impostazioni "bassa qualità" sono sufficienti. La società non rilascia informazioni sul filtro di eccitazione / emissione dettagliata. Tuttavia, i filtri di emissione sono larghi circa 20 nm e sono centrati intorno a 720 e 820 nm, secondo il produttore.
   Nota: È possibile eseguire la scansione di lastre mentre ancora bagnato, gli investigatori potrebbero voler continuare a macchiare con altri marcatori. Tuttavia, l'azienda suggerisce nel suo protocollo online che lastre secche producono meno spread segnale ben-to-bene. Se li si esegue la scansione sia bagnato e poi asciutto per confrontare i dati, assicurarsi di rimuovere tutta la PBS dal bene perché rimanenti sali dopo l'evaporazione può portare a sfondo alta fluorescenza lungo i bordi.
   1. L'Odissea Imager scansiona e attraverso il fondo della piastra. Piastre di produttori diversi possono richiedere diversi offset fuoco perché il fondo dei pozzetti può variare nel loro spessore e profondità nella piastra. Prova di scansione a diversi offset di messa a fuoco e vedere dove il più alto rapporto segnale-rumore e nitidissime (più a fuoco) segnale viene raggiunto: 2,5 millimetri, 3,0 millimetri, 3,5 millimetri, 4,0 millimetri. Prova anche per misurare la profondità del pozzo dal fondo di un piatto con un righello per confermare la Findings sulla Odyssey. Si ricordi che la plastica nel fondo del pozzo può aggiungere altezza supplementare alle misure del righello. Le piastre Costar utilizzati nel presente studio richiedono uno spostamento di 4,0 mm Messa.
   2. Utilizzare la funzione Occidentale In-Cell nel software per posizionare la griglia di giuste dimensioni sull'immagine della piastra ed esportare i dati in Microsoft Excel. Esaminare i valori "integrati intensità" degli stessi pozzi attraverso diversi spostamenti di messa a fuoco per trovare i valori di fluorescenza più alti. Il focus di offset che produce il più alto rapporto segnale-rumore (segnale in pozzi immunostained contro "non primari di controllo negativo" pozzi) è quello di scegliere in futuro.
   3. Una volta compensare una messa a fuoco è decisa, eseguire nuovamente la scansione con incrementi più piccoli. Ad esempio, se il segnale luminoso era a 3,5 e 4,0 millimetri, provare a scansione a 3.6, 3.7, 3.8 e 3,9 millimetri e vedere se c'è qualche ulteriore miglioramento della potenza del segnale. Se l'offset attenzione è sbagliato, intensità di segnale attraverso le 12 colonne su un pl vuotomangiato (quando tutte le colonne devono avere parità di segnale) apparirà come una curva a forma di U invece di una linea piatta. Se questo continua ad essere un problema con piatti di plastica, provare a lastre di fondo di vetro.
10. Sottrarre la media delle intensità integrate nei precedenti sottrazione pozzetti (Figura 2B; pozzi 2B - 2D o pozzi 2E - 2G) da ogni punto dati corrispondente nei canali 700 e 800 nm. Poi la media delle intensità di segnale integrati per ogni gruppo di pozzi. Tracciare i dati come una dispersione contro densità cellulare (vedi Figura 3).
    1. Confrontare i risultati dei due differenti diluizioni di anticorpi primari e secondari e dei risultati delle due diverse diluizioni di DRAQ5 + zaffiro di stabilirsi su una diluizione ciascuno per esperimenti successivi. Se la linearità non è raggiunto, provare la scansione a una diversa intensità. Ripetete la scansione con intensità di 3 e 7 invece di 5 e rianalizzare i dati. Se i dati migliorano in uno di quei intensità manon sono ancora soddisfacenti, ripetere la scansione con incrementi intorno a tale intensità.
    2. Fare attenzione a non analizzare le immagini in cui il software mostra macchie bianche nei pozzetti; quei punti significano segnale satura di fuori della gamma della termocamera. Scansione ad una minore intensità se questo si verifica.
    3. Se la linearità non è raggiunto, anche cercare di fissare le cellule entro 6 ore di placcatura perché potrebbero crescere o morire in modo non uniforme nelle diverse colonne durante la notte. Prova anche a diverse densità di placcatura, diverse intensità di scansione, ulteriori ottimizzazioni dei fattori di diluizione dei reagenti, lastre fondo di vetro, DRAQ5 da solo come una macchia unico nucleo-, o diversi anticorpi diversi da quelli anti-α-tubulina o anti-MAP2.

Risultati

Il fattore limitante in questi esperimenti è la colorazione infrarossi, come il saggio ATP è relativamente breve durata. Per i saggi infrarossi, anticipiamo che otto piastre da 96 pozzetti possono essere colorati e scansione entro un giorno incredibile cifra di due lotti di quattro piastre ciascuno (vedi Figura 1). Questa stima assume 20 min di fissazione, 30 min di lavaggio, 30 min di blocco, 2 ore di incubazione anticorpo primario seguita da 30 minuti di lavaggi, 1 ora di incubazione anticorpo secon...

Discussione

Abbiamo scoperto che la potenza del segnale in tutte e tre saggi di vitalità è lineare e correlazione con la densità di placcatura. Tuttavia, non tutti i saggi sono ugualmente sensibili a 2 volte o cambiamenti di 1,5 volte in densità di placcatura. Per le cellule N2a, i saggi infrarossi sono meno sensibili di dosaggio ATP, particolarmente a basse densità di placcatura. Sebbene i saggi infrarossi sono meno sensibili di ATP, i DRAQ5 + zaffiro saggi e saggi α-tubulina sono in buon accordo in che rivelano l'impatt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555