מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Summary

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

Abstract

ספירת תאים ידנית על מיקרוסקופ הם אמצעי רגיש להערכת כדאיות סלולרית אבל הם גוזלים זמן ולכן יקר. מבחני כדאיות ממוחשבים הם יקרים במונחים של ציוד, אבל יכולים להיות מהיר יותר ואובייקטיבי יותר מספירת תאים ידנית. הדו"ח הנוכחי מתאר את השימוש בשלושה מבחני כדאיות כזה. שניים ממבחנים אלה הם אינפרא אדום ואחד הוא זורח. שני מבחני אינפרא אדום להסתמך על Imager אודיסיאה 16 קצת. assay אינפרא אדום אחת משתמש כתם DRAQ5 לגרעינים בשילוב עם כתם ספיר לcytosol והיא דמיינו בערוץ 700 ננומטר. Assay אינפרא אדום האחר, ב- Cell מערבי, משתמש בנוגדנים כנגד חלבוני cytoskeletal (החלבון קשור α-טובולין או microtubule 2) ומתייג אותם בערוץ 800 ננומטר. Assay הכדאיות השלישי הוא assay זורח נפוץ עבור ה-ATP, אבל אנחנו משתמשים ברבע מהנפח המומלץ לחסוך בעלויות. מדידות אלה הן כל ליניארי ולתאם עם מספר ceLLS מצופה, אבל להשתנות ברגישות. כל שלושה מבחני לעקוף מיקרוסקופיה זמן רב ולדגום את כולו היטב, ובכך להפחית טעות דגימה. לבסוף, כל מבחני יכולים בקלות להסתיים בתוך יום אחד של סוף הניסוי, המאפשר למספר גדול יותר של ניסויים להתבצע בתוך פרקים זמן קצרים. עם זאת, כולם מסתמכים על ההנחה שמספרי תאים להישאר בפרופורציה לעוצמת אות לאחר טיפולים, מתוך הנחה שהוא לפעמים לא פגש, במיוחד עבור ה-ATP הסלולרית. יתר על כן, אם תאי גידול או קיטון בגודל לאחר טיפול, זה עשוי להשפיע על עוצמת אות מבלי להשפיע על מספר תא. אנו מסיקים כי כל מבחני הכדאיות, כוללים ספירה ידנית, סובלים ממספר האזהרות, אבל שמבחני הכדאיות ממוחשבים הם שווים את ההשקעה הראשונית. שימוש בכל שלושת מבחני יחד מניב תצוגה מקיפה של מבנה ותפקוד תאיים.

Introduction

Assay הכדאיות הנפוץ ביותר במדעים הביולוגיים כרוך בספירת תאים. עדות לכך הוא על ידי ניתוח של 200 הפרסומים (האחרונים) העליונים שהופיעו בPubMed עם אחת ממילות המפתח "במבחנה" או "תרבות" ב2013/04/29 ו2013/4/30. פרסומים אלה, מבחני 23.5% משמשים ספירת תאים, כוללים ספירת מספר תאים ידנית, מספר תאים אוטומטי סופרים עם תוכנת הדמיה, והדרה כחולה Trypan. Assay חי / המלח שימש ב1% מפרסומים אלה. מספר הפרסומים באמצעות MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay לכדאיות טבולים היה 11%. סקר זה של הספרות גם מראה כי מספר הפרסומים באמצעות מבחני כגון MTT בשיתוף עם מבחני ספירת תאים היה רק ​​.3.5%. למרות המגמה להשתמש assay כדאיות אחד בפני עצמו, הערכת תפקוד תאי בשילוב עם מספר תא נראית הבחירה הטובה ביותר להערכתי סלולריתntegrity. ספירת תאים על ידי עצמם אינן מספיקות, כי התאים שנותרו לא יכולים להיות פונקציונליים או בריאים, למרות שהם נמצאים בבאר ^1,2. לעומת זאת, אמצעי פונקציונלי, כגון ATP עשוי להגדיל או להקטין בהיעדר שינויים מקבילים במספר התאים. שחרר את הסוגר של צגי בקרת חילוף חומרים ממספר התא עולה כי אף פעם לא צריכים לשמש מבחני ה-ATP וMTT כassay הכדאיות הבלעדי. בדו"ח הנוכחי, שלושה מבחני כדאיות שיסקרו שני מבנים תאיים ותפקוד מטבולים מתוארים, לתמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בפני עצמו יכול להרשות לעצמו.

שניים מהמבחנים שלנו דורשים תרמי אינפרא אדום שמודדת הקרינה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. רעש הוא נמוך באורכי הגל אינפרא אדום, מה שמוביל ליחסי אות לרעש גבוהים יותר ^3. תרמי אודיסיאה שאנחנו משתמשים יש טווח דינמי 4.5 יומן וקצת מעמיקה של 16, translatinגרם ל2 ¹⁶ או 65,536 גוונים של אינפרא אדום. זה יכול להיות בניגוד להדמיה בצבע של 8 ביט, אשר רק מאפשרת 2 ⁸ או 256 גוונים של צבע לכל אורך גל. לפיכך, יש הדמיה 16 סיביות רזולוציה עדינה. יש לציין שהתמונות אינפרא אדומות המקוריות לעתים קרובות pseudocolored ירוק (800 ננומטר) ואדום (700 ננומטר) בדוחות שפורסמו למצגת. הדמית אודיסיאה משמשות בדרך כלל גם למערבי סופג ובתוך תא המערבונים ^4-7. ב- Cell מערבונים על תאים קבוע פורמלדהיד להשתמש נוגדנים ראשוניים כנגד כל חלבון של עניין ולתייג אותם בתורו עם נוגדנים משני ניאון אינפרא אדום. טכניקה זו ידועה להיות שימושי במיוחד עבור נקודות קצה זירחון ^6. ב- Cell המערבונים שלנו, אנחנו להכתים תאים קבועים לחלבוני cytoskeletal α-טובולין או microtubule העצבי החלבון קשור 2 (MAP2) בערוץ 800 ננומטר. חלבונים אלה נמצאים בשפע מספיק כדי להניב יחס אות לרעש גבוה. אנחנו גם להכתים הצלחות שלנו ב700ערוץ ננומטר לגרעינים עם כתם DRAQ5 ולציטופלסמה עם כתם ספיר. שני חלבוני cytoskeletal וDRAQ5 + כתמי ספיר ובכך משקפים את המבנים הסלולר.

Assay הכדאיות השלישי מודד תפקוד מטבולים והוא נקרא "תא כייל Glo". ב assay מבוסס לוציפראז זה, ערכי הארה הם ביחס ישירים לרמות ה-ATP. מבחני ה-ATP משמשים בדרך כלל כדי לכמת תאי קיימא ^8-12. עם זאת, כולל את המילה "כייל" בשמו של assay הוא קצת מטעה, כי פלט ה-ATP לכל תא יכול להשתנות כפונקציה של טיפולי רעל ולכן הוא לא תמיד באופן יחסי לתא מספר ^8. יכולות גם להיות מושפעות רמות ה-ATP על ידי מקצבי היממה ¹³ ועל ידי חלוקת תא ותא ¹⁴ בידול ^15. אף על פי כן, assay-ATP שמוצג כאן הוא פשוט לביצוע ושימושי כי ה-ATP הוא מדד חזק של חילוף חומריםכדאיות ^16-21, אם לא מספר סלולרי כשלעצמה. שימוש assay זה כדי להשלים את האינפרא אדום ב- Cell מערבונים לכן מניב תמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בלבד.

Protocol

סכמטי של הפרוטוקולים מודגם באיור 1.

1. תא ציפוי

פלייט תאים בצלחות 96, גם בצפיפויות ציפוי שונות (איור 2). לבדיקות ליניאריות בשורת תאי נוירובלסטומה N2a, 2.5k צלחת, 5k, 10k, 15k ותאים לכל טוב ב3 או 6 בארות / קבוצה. לבדיקות ליניאריות בתאי עצב בקליפת המוח עכברוש עיקרי, 25k צלחת, 50k, 100k, 200k ותאים לכל טוב ב3 או 6 בארות / קבוצה. אם שורות תאים או תאים ראשוניים של עניין נראים בריאים בצפיפויות שונות ציפוי, צלחת ובסביב צפיפות תאים האופטימלית עבור אותו סוג התא.

שים לב: במחקר הנוכחי, תאי N2a היו מצופים ב100 תקשורת μl ונוירונים בקליפת המוח עיקרי ב200 תקשורת μl על צלחות המיועדות לאידוי נמוך יותר. למידע מפורט על טיפול בתא, תקשורת, סרה, אנטיביוטיקה, וטיפולי רעל, נא עיין Unnithan et al. עבור טלפונים סלולר N2als ⁸ וPosimo et al. לתרבויות קליפת המוח עיקריות ^22.

1. 1. חזור על ציפוי בצלחת 96, גם שנייה. צלחת אחת תהיה assayed ל( איור 2 א) ה-ATP ואחר עם מבחני אינפרא אדום (איור 2). אף אחד לא יכול להשתמש באותה הצלחת ה-ATP ומבחני אינפרא אדום, כי התאים חייבים להיות lysed פתוחים למדידות ATP תאיים.
   2. הקפד צלחת לפחות 3 בארות נוספות לחיסור רקע במבחני אינפרא אדום בצפיפות ציפוי האופטימלית (עמודת 2; איור 2).
2. הוסף מדיה ללא תאים או יותר ביוקר, מים סטריליים לבארות החיצוניות בשורות ו-H ובעמודות 1 ו 12. הימנע מהסתמכות על נתונים מבארות בשולי, כפי שהכדאיות היא לעתים קרובות נמוך כאן מהשפעות של שיפועי אידוי תקשורת וטמפרטורה. בעיות מסוג זה עם microplates נקראות בדרך כלל השפעות קצה ^23,24. אל תשמרו את הבארות הללו ריקיםכי אז שורות B ו-G ועמודות 2 ו -11 סובלים מאפקט הקצה.
   השפעות קצה עשויות להיות מופחתות על ידי דוגרים צלחת טרי שנזרעה בטמפרטורת חדר בתנאי סביבה לפני ההעברה לCO ₂ באינקובטור ^24. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה על ידי Carralot מתאר שיטת תיקון מתמטית לצלחות microtiter באמצעות עמודת שליטה יחידה ^23. אוליבר ועמיתיו השתמשו תוכננה במיוחד חממת צלחת microtitration האוויר נאלצה לצמצם את שינויי הטמפרטורה ^25. אם אפקט הקצה הוא דאגה משמעותית, תאי יציבות microplate (למשל BT & Incorporated C) ניתן לרכוש כדי ליצור microenvironment הומוגנית עם לחות גבוהה ואפילו הדרגתיים בטמפרטורה.
3. אם יותר מאשר בארות מוצגים באיור 1 יש צורך כי דילולים מגיב נוספים או יותר צפיפות ציפוי ייבחנו, השתמש בבארות הקצה לחיסור רקע.
4. חכה לילה עבור קובץ מצורףשל תאים וassay למחרת בבוקר, כמתואר להלן.

2. אור פלורסנט ATP Assay

1. עקוב אחר ההמלצות של תא יצרן כייל Glo לכינון מחדש של המצע עם חיץ ולפעמי דגירה.
   1. הסר 50 או 150 תקשורת μl משל מדיה ציפוי 100 או 200 μl, בהתאמה. מעט פחות מ50 μl יישאר מאחור בבאר. הוסף 25 μl של חומרים כימיים (מצע בתוספת חיץ) לעמודים 2-6 (איור 2 א) בדילול 1:2.
      הערה: היקפים שונים של מדיה שנותרו לאחר ההסרה יכולה לדלל או לרכז את חומרים כימיים assay ATP באופן דיפרנציאלי על פני בארות. תשמור על עצמך, כדי להבטיח כי רמת נוזל בכל טיפים פיפטה רבות היא שווה ערך. מדוד את הנוזל שנשאר בבארות בחרו על פני הצלחת עם טפטפת באופן מיידי לפני שמוסיף את ריאגנטים assay ATP כדי להבטיח דיוק. אם קיימת שונות גבוהות משיעורי ההפרש של evapor התקשורתation על פני השטח של הצלחת, להסיר את כל המדיה הישנה ולהוסיף את אותו הנפח של תקשורת טרי או שנאגרו מלוח פוספט (PBS) לכל הבארות באופן מיידי לפני תוספת של חומרים כימיים assay-ATP. אם הצלחות סובלות מרמות המשתנה של אידוי, נסה לעבור לצלחות אידוי נמוכות משחקן המשנה קורנינג. בלוחות האחרונים, 60 בארות פנים שמוצגים באיור 2 סובלות רק מממוצע של 0.995% ± לילה אידוי 0.41 תקשורת. יש אפוא השתנות זניחות בתקשורת קול בזמן של assay.
   2. בטורים 7 עד 11, שורות ב 'עד ד', להסיר את התקשורת מספיק לעזוב 50 μl מאחור, כמפורט לעיל, ולהוסיף 50 μl של חומרים כימיים בדילול 1:1.
   3. בטורים 7 עד 11, שורות E עד G, לצאת מתאים באמצעי תקשורת 100 μl ולהוסיף ריאגנטים 100 μl, שוב בדילול 1:1. החברה ממליצה לשל חומרים כימיים 100 μl צריך להיות מדולל 1:1 באמצעי תקשורת 100 μl.
      הערה: על מנתכדי לחסוך בעלות, זה אפשרי לקצץ בהמלצות אלה הן בנפח והן בדילול. עם זאת, לפני עושה את זה, ודא שהוא אינו מפחית את הליניאריות והרגישות של assay.
   4. ברגע שנפח ספציפי אחד וגורם לדילול של חומרים כימיים הנמצאים להיות משביע רצון, להישאר עם אותם בכל הניסויים הבאים. הקריטריונים לנתונים מספקים מתוארים בסעיף התוצאות.
   5. ניתן refrozen ריאגנטים מחדש שאינו בשימוש ושימוש במועד מאוחר יותר כדי לחסוך בעלויות. לדברי היצרן, ניתן לאחסן חומרים כימיים מחדש ב -20 מעלות צלזיוס במשך 21 שבועות עם אובדן ~ 3% מפעילות.
2. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 2 דקות או שייקר nutating 10 דקות. אם חלק מהצלחת הוא להיות assayed למדידה שונה ולא יכול להיות מזועזע אותו, להתסיס את התקשורת עם pipetting למעלה ולמטה פשוט רק בבארות של עניין. עם זאת, בועות מוגזמות שנוצרו במהלך שלב זה יפריעו לומיםפלט nescent.
   1. 10 דקות אחרי תוספת של חומרים כימיים, להעביר 60 μl של התוכן גם לתוך צלחות 96, גם לבנה. ערכי הארה גבוהים יותר בצלחות הלבנות מאשר בצלחות שקופות או שחורות משום שהם משקפים את האור כלפי מעלה לכיוון הגלאי.
      הערה: מניסיוננו, תאים לשרוד טוב יותר באידוי הנמוך, צלחות שחקן משנה ברורות מצלחות אחרות. צלחות ספציפיות אלה אינן נמכרים עם קירות לבנים. שנית, הצלחות אטומות דופן ובעל תחתית ברורה יקרות יותר צלחות ברורות לחלוטין. אם אחד מעביר את הנוזל זורח לצלחות הלבנות, ניתן לכבס את הצלחות הלבנות ושימוש חוזר, חסכון בעלות של שימוש בצלחות הלבנות חדשות עבור כל ניסוי. העברת נוזל היא אפוא האפשרות זולה יותר בטווח הארוך.
   2. פופ כל בועות אוויר לפני שקרא את הצלחת עם מחט או, עדיף, עם אוויר מאולץ מנורת פיפטה העברה פלסטיק. קראו את הצלחת על luminometer עם 1 שניות זמן אינטגרציה (recomme החברה0.25-1 שניות זמן אינטגרציה מספיק כnds). קראו את דקות 10-12 הצלחת לאחר תוספת של חומרים כימיים assay-ATP. עיתוי הוא קריטי להשוואה על פני צלחות שונות, משום שהאות זורח היא חולפת עם קצב דעיכה מהיר, כפי שמוצג על ידי גילברט ועמיתים ^26.
3. ממוצע הערכים זורח מ3 או 6 בארות בכל קבוצה ועלילה כפונקציה של מספר התאים בscatterplot (ראה איור 3). לחסר ראשון ערכים ממוצע רקע הארה של הבארות המתאימות הריקות (בארות 2B - 2G, בארות 11B - 11D, ובארות 11E - 11G) מכל נקודת נתונים מתאימה. תהיינה שלוש קבוצות שונות עבור כל צפיפות ציפוי ב( איור 2 א) ניסוי הראשוני הזה. רמות ה-ATP עשויות להיות מתואמות באופן ליניארי עם צפיפות תאים באחת או את כל הקבוצות האלה. להמשיך עם הדילול הגבוה ביותר של חומרים כימיים שעדיין נותן תוצאות משביעות רצון לחסוך בעלויות. קריטריונים לתוצאות משביעות רצון מתוארים in סעיף התוצאות.
   שים לב: עם התקשורת השתמשה במחקר הנוכחי, ערכי רקע עם assay זה אינם גבוהים וזה אפשרי לדלג על הבארות ריקות. עם זאת, יצרנית Promega מדווח הבדלים בהארה עם תקשורת ותרבות שונה. המחקר הנוכחי משתמש Hyclone העוברי Clone III, גרסה סינתטית של סרום שור עוברי לתאי N2a ועגל בסרום שור לתרבויות בקליפת המוח עיקריות. לדברי היצרן, נסיוב העגל קטן של ערכי הארה אבל לא להפחית את הרגישות של assay. עם זאת, אם זה של דאגה משמעותית, לדלל ריאגנטים assay-ATP בPBS במקום תקשורת בזמן של assay.
   1. אם התאים נראים לגדול בצורה לא אחידה על פני עמודות לילה, נסה מנסה לאמוד אותם תוך 6 שעות של ציפוי. עם זאת, לזכור כי הצפיפות בזמן הרגיל של assay (לדוגמא, 24 שעות לאחר טיפול) היא הצפיפות שבה חייבת להיות מושגת ליניאריות.

3. Infrareמבחני ד

1. בבוקר שלאחר ציפוי, לתקן את התאים בצלחת השנייה בטמפרטורת חדר במנדף. הקפד ללבוש כפפות לצעד זה ולהשליך מקבע כפסולת כימית כי פורמלדהיד הוא חומר מסרטן. הוספת פורמלין 4% וסוכרוז 4% בחיץ פוספט 0.1 M לתקשורת הקיימת בדילול 1:1. התקשורת יכולה להיות גם לשטוף עם PBS לפני תיקון במקבע כוח מלא. כך או טכניקה עובדת היטב.
   1. דגירה במקבעת עבור 20 דקות ולאחר מכן להסיר את מקבע ולשטוף 3x ב200 μl PBS.
2. אחסן את הצלחת ב-PBS עם 0.2% אזיד הנתרן על 4 מעלות צלזיוס אם assay לא יתקיים באותו היום. אם לא, המשך עם assay ולמקם את התאים בחסימת פתרון כדי למזער ספציפי מחייב של נוגדנים.
   1. לדלל את 01:01 בלוק דגי סרום אודיסיאה בPBS ולהוסיף 0.3% Triton-X 100 כpermeabilizer תא. הפוך פתרון חסימה מספיק כמו גם antibo הראשוני והמשניפתרונות dy, כך ניתן pipetted 35 μl לכל אחד. עם זאת, אם הרבה בועות שנצפו במהלך pipetting, לעשות> 50 μl עבור כל טוב, אחרת הבועות להגיע לתוך התאים והנוגדנים בלוק מכריכה. בועות סבון מוגזמות תופיע ככתם עגול בלא כתם באמצע הבאר. נסה להתאים את pipetting אם זה מתרחש.
   2. דגירה בפתרון חסימה זו ל30-60 דקות בטמפרטורת חדר.
      שים לב: גם 5% אלבומין בסרום שור או סרה רגיל מאותו המין כמו נוגדנים משני יכול לשמש כחסימת פתרונות לשמור על עלות של בלוק סרום דגים. חסימת פתרונות יכול להשפיע על ביצועים של הנוגדן. לפיכך, הבלוק האופטימלי לכל נוגדן הוא הטוב ביותר שנקבע באופן אמפירי.
      הערה: חוקרי מקום כלשהו ב- Cell לוחות מערביים שבייקרים בincubations. עם זאת, זה לא הכרחי.
3. הפוך את הנוגדנים העיקריים: 1:10,000 דילול אנטי α-טובולין(עכבר חד שבטי, טבלת 1) ו1:2,000 דילול אנטי MAP2 (עכבר חד שבטי, טבלת 1). נוגדנים אלה הם ספציפיים לחלבונים של עניין בדגמי הסלולר אלה; סגוליות הוא חיוני לכל כתם immunocytochemical.
   הערה: MAP2 הוא סמן לנוירונים ומתאים לתרבויות עצביות / גליה מעורבות. התרבויות לאחר הלידה מוצגות כאן גם מכילות כמה גליה (~ 25%) כי האסטרוציטים מופיעים לראשונה ביום עוברי 18, עם המספרים שלהם הגיעו לשיא בתקופת הילוד מוקדם ^27,28. אי אפשר שלא להבחין בין האסטרוציטים ונוירונים בATP ומבחני DRAQ5 + ספיר. על מנת למדוד את הנוירונים והאסטרוציטים בנפרד, השתמש MAP2 בו זמנית ומכתים GFAP ב800 ו700 ערוצי ננומטר, כפי שתואר על ידי Mullett ועמיתים ^4,29, עוזב את DRAQ5 + ספיר. עם זאת, אם כל התאים בתרבות רוצים להיות מוערכים, להשתמש בסמן הפאן סלולארי כגון α-טובולין, β-אקטין, או GAPDH.
   הערה: דילולים אלה עברו אופטימיזציה עבור N2a ותאים בקליפת המוח ראשוניים וייתכן שלא להכליל לכל דגם. לכן, נסה לפחות שני דילולים עיקריים נוגדנים, אחד במחצית השמאלית של צלחת ואחד על החצי הימני (ראו איור 2). לחלופין, נסה 3-4 דילולים של נוגדנים ראשוניים על 3 בארות כל אחת. למשל, הדילול המומלץ בגיליון להוסיף נוגדן יכול להיות מוקף בשינויים כפול. במילים אחרות, אם הדילול המומלץ לimmunocytochemistry הוא 1:500, גם לנסות 1:250 ו1:1,000 גורמי דילול.
   1. מדולל נוגדנים ב1:01 בלוק אודיסיאה: PBS ולהוסיף 0.3% Triton-X. כדי לחסוך בעלויות, נסה לעשות את הנוגדנים בפתרון החסימה שהיה מוחל על התאים בשלב 3.2.1 על ידי הסרת פתרון זה בסוף הדגירה. שמור את התאים ב-PBS בעת עושה את זה, אסור שהם יתייבשו.
   2. דגירה בנוגדנים ראשוניים או 1-2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. לחולשה בinding נוגדנים וחלבונים שהם לא בשפע, incubations הלילה יכולה לעזור להגביר את האות.
      הערה: השאר לפחות 3 בארות בחסימת פתרון לחיסור רקע בכל ריכוז נוגדנים משני (בארות 2B-2D ובארות 2E-2G באיור 2 ב). אל תחשפו בארות אלה לכל נוגדן ראשוני כלשהו. הם חושפים את המידה ספציפי מחייב על ידי הנוגדנים משני ושימושיים לחישובים של יחסי אות לרעש. אם יש חשש שהנוגדנים משני יביאו לרמות גבוהות של כריכה ספציפי, כולל גם בארות שליטה שאינם נחשפות לנוגדן ראשוני או המשני אבל מקבלות את אותו המספר של שוטף. ההבדל בין בארות אלה ובארות "המשני בלבד" יגלה כריכה נגרמת על ידי הנוגדנים משני לבד את המידה ספציפיות. בבדיקה שלנו על תאי N2a עכבר, לאותת בעוצמה עם שני נוגדנים אנטי עכבר לבד היה 0.557 ± 0.032, אות עם נגד ארנבנוגדנים משני לבדו היו 0.533 ± 0.041, לאותת שאין נוגדנים משני היו 0.357 ± 0.003, ואות עם נוגדנים ראשוניים ומשניים הייתה 11.867 ± 0.911. יש לנו ובכך לא נצפו רמות גבוהות של ספציפי מחייב גם בעת השימוש משני נוגדנים אנטי עכבר על תאי עכבר. יש יצרן של כמה נוגדנים משניים אינפרא אדום, אנחנו ממליצים לקנות רק מאוד חוצי adsorbed אלה. שים לב שהריכוז של נוגדני IgG משניים עשוי להשתנות בהתאם למקור.
4. לשטוף את הנוגדנים ראשוניים עם 3 שוטף של 200 μl PBS לכל טוב, 10 דקות כל אחד. ניתן לשמור נוגדנים ראשוניים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות ב0.2% אזיד הנתרן ושימוש חוזר עד כתמים זעירים של הפסולת לעין כאשר הפתרונות מתקיימים עד אור. זה נעשה רק כדי לחסוך בעלויות. אם העלות היא לא בעיה, לעשות נוגדנים טריים לכל שימוש.
5. לדלל את הנוגדנים משני על ידי 1:1,000 או 1:2,000 ב1:01 בלוק אודיסיאה: PBS עם 0.3% Triטון X (איור 2). מוסיף את דילול 1:1,000 למחצית העליונה של הצלחת ו1:2,000 למחצית התחתונה של הצלחת. ריכוזים אלה יכולים להיות מופחתים עוד יותר כדי לחסוך בעלות, אלא לבדוק ליניאריות לפני שאתחייב לכך.
   הערה: הקפד להוסיף את פתרון נוגדנים משני המתאים לבארות רקע החיסור (עמודה 2 באיור 2).
   1. אם חלבון שני יהיה מאושר במקום של DRAQ5 + ספיר, תאי תווית עבור α-טובולין או MAP2 עם עז 700 ננומטר אנטי העכבר IgG והחלבון השני בערוץ 800 ננומטר עם נוגדנים ראשוניים ממינים אחרים מאשר עכבר. ערוץ ננומטר 800 יש פחות רקע מערוץ 700 ננומטר וצריך להיות שמורה לחלבון הקריטי ביותר של עניין.
   2. דגירה בנוגדנים משני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במגירה מהאור.
6. לשטוף את נוגדנים משני עם 3 שוטף של 200 μl PBS לכל טוב, 10 דקות כל אחד.
7. הפוך את פתרונות DRAQ5 + ספיר. במחצית השמאלית של הצלחת, לדלל DRAQ5 1:10,000 (0.5 מיקרומטר ריכוז סופי) וספיר 1:1000 ב-PBS עם 0.3% Triton-X (עמודות 3 - 6; איור 2). למחצית הימנית של הצלחת, לדלל DRAQ5 1:20,000 (0.25 מיקרומטר) והספיר 1:2000 (עמודות 7-10; איור 2).
   הערה: DRAQ5 משמש להימכר במניות 1 מ"מ במקום מניית 5 מ"מ. חלק מהדיווחים שפורסמו בעבר ולכן משמשים 1:4,000 או 1:2,000 דילולים של DRAQ5 ^8.
   1. כדי לחסוך בעלות, אם שתי צלחות נמצאים assayed בו זמנית, באותו DRAQ5 + פתרונות ספיר ניתן להשתמש בשתי צלחות ברצף, pipetting אותו מהצלחת הראשונה והוספתו לשנייה. אם אותו הפתרונות ישמשו פעמיים באופן זה, השתמש אותם בתוך יום אחד. לא ניתן לשמור פתרונות DRAQ5 המדולל + ספיר על 4 מעלות צלזיוס או קפוא לשימוש מאוחר יותר.
   2. דגירה בפתרונות אלה עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר, הרחק from אור. אם הזמן הוא קצר ו+ פתרונות ספיר DRAQ5 לא לעשות שימוש חוזרים בצלחות אחרות עם גרורות שונות, להוסיף כתמים אלה לפתרונות נוגדנים משני בשלב 3.5 דגירה במשך שעה 1.
      שים לב: אל תוסיף DRAQ5 + פתרון ספיר לבארות רקע החיסור (עמודה 2 באיור 2) שלא צריכה להיות מוכתמות בארות אלה בערוץ 700 ננומטר.
8. לשטוף 3x הצלחת עם 200 μl PBS לכל גם ל10 דקות כל אחד. שים 0.2% אזיד הנתרן בכביסה PBS הסופי אם הצלחת הולכת להיות מוכתמת עם נוגדנים משני גלוי טווח אחרים לאחר ההדמיה אינפרא אדום היא מלאה.
9. סרוק את הצלחת על Imager אודיסיאה. בגין על ידי סריקת הלוחות בעוצמה 5 ו169 רזולוציה מ"מ. כך או "איכות בינונית" או הגדרות "באיכות נמוכה" מספיקות. החברה אינה משחררת מידע מסנן עירור / פליטה מפורטת. עם זאת, מסנני הפליטה הם ברוחב של כ 20 ננומטר והם התרכזו סביב 720 ו820 ננומטר, על פי היצרן.
   הערה: ניתן לסרוק צלחות ועדיין רטוב כחוקרים ייתכן שירצו להמשיך ולהכתים אותם עם סמנים אחרים. עם זאת, החברה מציעה בפרוטוקול האינטרנט שלה, כי צלחות יבשות לגרום פחות אות התפשט להיטב היטב. אם תסרוק את שניהם רטובים ולאחר מכן יבש כדי להשוות את הנתונים, כדי להיות בטוח כדי להסיר את כל PBS מן הבאר, כי מלחים שנותר לאחר ההתאדות יכול להוביל לקרינת רקע גבוהה לאורך הקצוות.
   1. אודיסיאה Imager סורק למעלה ודרך החלק התחתון של הצלחת. צלחות מיצרנים שונים עשויות לדרוש קיזוז פוקוס שונה, כי החלק התחתון של הבארות יכול להשתנות בעובי והעומק שלהם בצלחת. נסה סריקה בקיזוז מוקד שונה ולראות בו את היחס הגבוה ביותר אות לרעש וcrispest (רובם בפוקוס) אות מושגת: 2.5 מ"מ, 3.0 מ"מ, 3.5 מ"מ, 4.0 מ"מ. נסה גם כדי למדוד את העומק של הבאר מהחלק התחתון של צלחת עם שליט כדי לאשר שתמצאgs על האודיסיאה. זכור כי הפלסטיק בתחתית הבאר יכול להוסיף גובה נוסף למדידות השליט. צלחות שחקן המשנה ששמשו במחקר הנוכחי דורשות התמקדות קיזוז 4.0 מ"מ.
   2. השתמש בפונקציה המערבית ב- Cell בתוכנה כדי למקם את הרשת בגודל הנכונה על גבי התמונה של הצלחת ולייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel. בדוק את הערכים "משולבים בעוצמה" של אותו בארות על פני קיזוז מוקד שונה כדי למצוא את ערכי הקרינה הגבוהים ביותר. מוקד קיזוז שמניב היחס הגבוה ביותר אות לרעש (אות בבארות immunostained לעומת "אין שליטה שלילית עיקריות" בארות) הוא אחד לבחור להלן.
   3. ברגע שאחד ממוקדים של קיזוז יוחלט על, לסרוק שוב במרווחים קטנים יותר. לדוגמא, אם האות הבהירה ביותר הייתה ב3.5 ו4.0 מ"מ, נסה לסרוק ב3.6, 3.7, 3.8, ו3.9 מ"מ ותראה אם ​​יש שיפור נוסף בעוצמת אות. אם מיקוד הקיזוז הוא לא נכון, עוצמות אות על פני 12 העמודות בpl ריקאכלתי (כאשר כל העמודות צריכה אות שווה) יופיע כעקומה בצורת U, במקום קו שטוח. אם זה ממשיך להיות בעיה עם צלחות פלסטיק, נסה צלחות עם רצפת זכוכית.
10. הפחת את הממוצע של העוצמות משולבות בבארות רקע החיסור (איור 2; בארות 2B - 2D או בארות 2E - 2G) מכל נקודת נתונים מקבילה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. ואז בממוצע עוצמות אות המשולבת עבור כל קבוצה של בארות. להתוות את הנתונים כscatterplot נגד צפיפות תאים (ראה איור 3).
    1. השווה את התוצאות של שני דילולים השונים של נוגדנים ראשוניים ומשניים ואת התוצאות של שני דילולים השונים של DRAQ5 + ספיר להתיישב על דילול אחד עבור כל הניסויים הבאים. אם ליניאריות לא תושג, נסה סריקה בעוצמה שונה. לסרוק מחדש עם עוצמות 3 ו 7 במקום 5 ולנתח מחדש את הנתונים. אם הנתונים לשפר באחת מהעוצמות האלה, אבלהם עדיין אינו משביעת רצון, לסרוק מחדש במרווחים סביב עוצמה ש.
    2. היזהר שלא לנתח את התמונות שבו התוכנה מראה כתמים לבנים בבארות; כתמים אלה מסמנים אות רוויות מחוץ לטווח של תרמי. סרוק בעוצמה נמוכה יותר, אם זה מתרחש.
    3. אם ליניאריות לא תושג, תנסה גם לתקן את התאים בתוך 6 שעות של ציפוי, כי הם עלולים לגדול או למות בצורה לא אחידה בעמודות שונות בין לילה. נסה גם צפיפויות שונות ציפוי, עוצמות סריקה שונות, אופטימיזציות נוספות של גורמים מגיב דילול, צלחות עם רצפת זכוכית, DRAQ5 על ידי עצמו ככתם גרעין בלבד, או נוגדנים שונים אחרים מאשר אנטי α-טובולין או אנטי MAP2.

תוצאות

הגורם המגביל בריבית בניסויים אלה הוא הכתמים אדום, כמו assay ATP הוא יחסית קצר משך. למבחני אינפרא אדום, אנו צופים כי יכולים להיות מוכתמים שמונה צלחות 96 היטב וסרקו בתוך יום אחד על ידי שתי קבוצות מדהימות של ארבע צלחות כל אחד (ראה איור 1). הערכה זו מבוססת על ההנחה 20 דקות...

Discussion

מצאנו כי עוצמת אות בכל שלושת מבחני הכדאיות היא ליניארי ומתואם עם צפיפות ציפוי. עם זאת, לא כל מבחני הם לא פחות רגישים לפי 2 או שינויים 1.5 פי בצפיפות ציפוי. לתאי N2a, מבחני אינפרא אדום רגישים פחות assay-ATP, במיוחד בצפיפויות ציפוי נמוכות יותר. למרות שמבחני אינפרא אדום רגישים פחו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555