JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه المقالة ونحن نقدم سريع الصغرى الرحلان الشاردي من الناقلات العصبية كأسلوب للتحقيق التكامل من إشارات بعد المشبكي مع عالية الدقة المكانية والزمانية.

Abstract

واحدة من الاهتمامات الأساسية في علم الأعصاب هو فهم التكامل من المدخلات مثير والمثبطة على طول بنية معقدة جدا من شجرة شجيري، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى إنتاج الخلايا العصبية من إمكانات العمل في محور عصبي. تأثير العوامل المكانية والزمانية متنوعة من المدخلات متشابك محددة بشأن الانتاج العصبية هي حاليا قيد التحقيق، على سبيل المثال التوهين التي تعتمد على المسافة من المدخلات شجيري، والتفاعل الموقع التي تعتمد على مدخلات من مكانيا منفصلة، ​​وتأثير GABAergig تثبيط على التكامل مثير، وخطي وسائط التكامل غير الخطية، وغيرها الكثير.

مع السرعة في الدقيقة الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA فمن الممكن للتحقيق بدقة التكامل المكاني والزماني للإثارة وتثبيط مستقبلات GABAergic. المتطلبات الفنية الحرجة هي إما مصباح الفلورسنت أثار، ديود باعث للضوء (LED)، أو هيئة السلع التموينية اثنين من الفوتونnning المجهر لتصور فروع شجيري دون إدخال هامة الصور ضرر في الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فمن المهم جدا أن يكون مكبر للصوت الرحلان الشاردي الصغيرة التي تسمح للحصول على تعويض السعة بسرعة من ماصات مقاومة عالية. نقطة أخرى مهمة هي أن لا الارسال يتم تحريرها كرها بواسطة ماصة أثناء التجربة.

وبمجرد إنشاء، وهذه تقنية تعطي إشارات موثوقة وقابلة للتكرار مع ناقل عصبي عالية وخصوصية المكان. مقارنة الغلوتامات وGABA uncaging، الرحلان الشاردي سريع يسمح باستخدام كل أجهزة الإرسال في نفس الوقت ولكن في أماكن بعيدة جدا دون تحديد لمجال الرؤية. وهناك أيضا مزايا مقارنة التحفيز الكهربائي التنسيق من المحاور: مع الدقيقة الرحلان الشاردي الموقع من موقع الإدخال هو معروف بالتأكيد، وأنه على يقين من أن فقط الناقل العصبي من الفائدة يتم تحريرها. ومع ذلك فإنه لابد من النظر أنه مع الدقيقة الرحلان الشاردي فقطيتم تنشيط وpostsynapse لم يتم حل الجوانب قبل المشبكي من الافراج عن العصبي. في هذه المقالة ونحن لشرح كيفية إعداد الصغرى الرحلان الشاردي في التجارب شريحة الدماغ.

Introduction

الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الحصول على مجموعة متنوعة من المدخلات متشابك على عملياتها شجيري رقيقة ومتشعبة 1. هناك، يتم بوساطة الغالبية العظمى من المدخلات شجيري مثير عن طريق نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاميرجي. يمكن تنشيط هذه نقاط الاشتباك العصبي بطريقة توزيعها مكانيا، مما أدى إلى التكامل الخطي بعد المشبكي من إمكانات بعد المشبكي مثير (EPSPs). إذا تم تنشيط نقاط الاشتباك العصبي في وقت واحد وعلى مقربة المكاني على التغصنات، هذه المدخلات مثير يمكن أن تكون متكاملة فوق خطيا وتوليد المسامير شجيري 2-5.

وعلاوة على ذلك، ودمج المدخلات مثير يعتمد على موقع للمدخلات على الشجرة شجيري. الإشارات التي تصل في المنطقة خصل البعيدة هي أكثر من ذلك بكثير الموهن من المدخلات الداني بسبب كابل تصفية 6. في قرن آمون، يتم إنشاء مدخلات بعيدة إلى التشعبات قمية خصل من منطقة في الدماغ تختلف عن تلك في dendri الدانيTES 7. بالتالي مسألة إثارة هو، كيف تتم معالجة المدخلات متشابك من قبل مقصورات شجيري مختلفة، وإذا تكامل شجيري ينظم تأثير هذه المدخلات الطبقات على إطلاق الخلايا العصبية بطرق مختلفة.

ليس فقط الخصائص الفنية والسمات الشكلية للالتغصنات، ومكان وتجميع المدخلات التي تؤثر على التكامل شجيري من المدخلات مثير، أيضا المدخلات المثبطة إضافية من محطات GABAergic حاسم تحديد مدى فعالية من نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاميرجي 8،9. هذه الجوانب المختلفة من التكامل متشابك يمكن التحقيق بشكل مثالي باستخدام ناقل عصبي الصغرى الرحلان الشاردي، والذي يسمح تطبيق تعريف مكانيا من الناقلات العصبية المختلفة إلى مجالات شجيري. علينا أن نظهر هنا كيفية تأسيس-الرحلان الشاردي الصغيرة من الغلوتامات وGABA بنجاح إلى تحقيق التكامل إشارة في الخلايا العصبية.

لهذا التطبيق، ودفع غرامة ذات الرؤوسوتستخدم ماصات مقاومة عالية مليئة حلول العصبي المركزة. يتم وضع هذه الماصات بالقرب من الغشاء الخارجي للخلية، حيث توجد مستقبلات الناقل العصبي. مطلوب التصور الجيد للفروع شجيري. ويتحقق ذلك باستخدام أفضل الأصباغ الفلورية، والتي يتم تقديمها من خلال ماصة التصحيح. ثم (<1 ميللي ثانية) نبض الحالية قصيرة جدا (في نطاق 10-100 غ) يستخدم لإخراج جزيئات الناقل العصبي مشحونة. مع هذه النبضات القصيرة والتعويض السعة فعالة وإمكانات بعد المشبكي أو التيارات يمكن أثار مع ارتفاع الزمانية والمكانية الدقة، مما يعني أن الدولة من المدخلات مثير هو معروف على وجه التحديد. الغلوتامات الصغرى الرحلان الشاردي يمكن تنشيط نقاط الاشتباك العصبي في دائرة نصف قطرها محدد، وهو أصغر من 6 ميكرون كما هو موضح هنا (الشكل 1 9)، ولكن من الممكن أيضا للوصول إلى قرار المشبك واحدة 10-12.

هاينه، M.، وآخرون أن القرار المكاني للسريع الصغرى الرحلان الشاردي حتى يمكن تعديلها على الفور أحجام أقل من 0.5 ميكرون، والتي هي أصغر من حجم بقعة يتحقق بانتظام مع uncaging اثنين من الفوتون من الغلوتامات 13. مع السرعة في الدقيقة الرحلان الشاردي فمن الممكن بسهولة لاستخدام اثنين أو أكثر الماصات iontophoretic ووضعها في اماكن مختلفة، وحتى البعيدة على الشجرة شجيري. في هذه الطريقة، وإدماج الأحداث مثير، بما في ذلك تلك من مسارات مختلفة، ويمكن التحقيق فيها. ومن الممكن أيضا استخدام الغلوتامات وGABA ماصة iontophoretic مليئة في نفس الوقت. وبهذه الطريقة يمكن دراسة تأثير تثبيط GABAergic في مواقع مختلفة نسبة إلى المدخلات مثير (على الطريق، وتثبيط خارج المسار). أيضا، وتأثير تثبيط من قبل interneurons استهداف المجالات العصبية محددة، مثل التشعبات البعيدة، سوما أو محاور 14، يمكن التحقيق باستخدام الرحلان الشاردي GABA. في الخلايا العصبية مثقف، وسرعة متناهية الصغر الرحلان الشاردي يتيح الفرصة لإنفيstigate توزيع المشبك واحد والجوانب الابتدائية الاتصالات متشابك في الخلايا العصبية في أكثر بكثير من التفصيل 10،11.

في هذه المقالة ونحن لشرح بالتفصيل كيفية تأسيس الرحلان الشاردي الغلوتامات وGABA للاستخدام في شرائح الدماغ الحاد، والذي يسمح بالتحقيق التكامل متشابك من المدخلات مثير والمثبطة في الاعتماد من الموقع المدخلات، ونقاط القوة المدخلات، وتوقيت، وحده أو في التفاعل. ونشير الى المزايا والقيود المفروضة على هذه التقنية وكيفية استكشاف بنجاح.

Protocol

1. متطلبات النظام

  1. نظام المجهر: التصور جيد من التغصنات أمر بالغ الأهمية. إذا كانت متوفرة، واستخدام المسح الضوئي ليزر نظام مجهر ثنائي الفوتون. في تجاربنا كنا نطاق TRIM الثاني، LaVision بيوتيك، بيليفيلد، ألمانيا أو IV نظام ألتيما، المرج تكنولوجيز، ميدلتون، ويسكونسن مجهزة تي: الياقوت فائق السرعة نابض ليزر (الحرباء ألترا II ومتماسكة) والهدف NA عالية (60X، NA 0.9، أوليمبوس) لتصور التشعبات التي كنا قد ملأت مع صبغة الفلورسنت من خلال ماصة التصحيح. على الرغم من أن الصور الضرر ويعتقد أن يكون أقل حدة المسح الضوئي باستخدام 2 الفوتون، والحد من قوة الليزر (أقل من 8 ميغاواط في الأنسجة) ويسكن مرات (أقل من 1 μsec) أو قدر الإمكان.
  2. والاحتمال الثاني هو لتحريك مصدر الضوء مضان واسعة المجال (LED أو مصباح الفلورسنت) بشكل متزامن مع اكتساب لتقليل وقت التعرض قدر الإمكان. وقد استخدمنا مستوحد اللون مع مصدر ضوء المتكاملة (TILLPhoالمقويات، Gräfelfing، ألمانيا) على زايس Axioskop 2 FS المجهر تستقيم التي كانت مجهزة Dodt على النقيض من الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء (TILLPhotonics، Gräfelfing، ألمانيا). في تجاربنا تراوحت مرات التعرض من عادة 10 ميللي ثانية إلى الحد الأقصى. 30 ميللي ثانية.
  3. استخدام سريع مكبر للصوت الرحلان الشاردي الدقيقة، على سبيل المثال نظام الصغرى الرحلان الشاردي اثنين من قناة MVCS-C-02 (NPI الإلكترونية، تام، ألمانيا) مع التعويض السعة بسرعة. وmicroelectrodes الرحلان الشاردي غرامة ذات الرؤوس ديك المقاومة من 25-100 MΩ (اعتمادا جوهريا على حجم وشكل غيض ماصة)، ويمكن أن يتحقق إلا أوقات ارتفاع سريع إذا كان التعويض السعة من مكبر للصوت iontophoretic يتم ضبطها على النحو الأمثل. هذا التعويض بسرعة ضروري لتطبيق البقول الحالي مع ظهور موجزة وسريعة في نطاق شبه ميلي ثانية واحدة إلى ماصة iontophoretic وبالتالي لإخراج الارسال مع قرار مكانية عالية في أحجام نقطة أقل من 1 ميكرون 13. مكبرات الصوت هي الرحلان الشاردي آلالمتاحة حتى من العديد من الشركات الأخرى، والتي نحن لم تختبر في مختبرنا. وهذه الأجهزة هي على حد علمنا ليس مجهزة السعة الدوائر التعويض.

2. إعداد حلول

  1. إعداد الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF) والحل الداخلي كما هو مطلوب منها لتصميم تجريبي. الإضافة الوحيدة إلى حل داخلي، وهو مطلوب، هو صبغة الفلورسنت الأحمر أو الأخضر (على سبيل المثال 50-200 ميكرومتر اليكسا فلور 488 أو 594 هيدرازيد، إينفيتروجن)، اعتمادا على المعدات البصرية. هنا مثال لACSF السكروز والتي يمكن استخدامها للتشريح، في ملي: 60 كلوريد الصوديوم، و 100 السكروز، 2.5 بوكل، 1.25 ناه 2 ص 4، 26 NaHCO 3، 1 و CaCl 2، 5 MgCl 2، 20 الجلوكوز، وبالنسبة للACSF العادي الحل للتجارب التصحيح، المشبك ب (ملم): 125 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 1.25 ناه 2 ص 4، 26 NaHCO 3، 2.6 و CaCl 2، 1.3 MgCl 2، 15 الجلوكوز.
  2. Carbogenize (95٪ O 2، 5٪ CO 2) كل الحلول خارج الخلية باستمرار.
  3. إعداد الحل الداخلي، على سبيل المثال، في ملي: 140 K-غلوكونات، 7 بوكل، 5 HEPES الحمضية، 0.5 MgCl 2، 5 فسفوكرياتين، 0.16 EGTA؛ مع 50-200 ميكرومتر اليكسا 488.
  4. لالغلوتامات الصغرى الرحلان الشاردي يعد حل مع 150 ملي حمض الجلوتاميك وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 50 -200 ميكرومتر اليكسا فلور 488 أو 594 هيدرازيد (إينفيتروجن) عن التصور.
  5. لالرحلان الشاردي من GABA إعداد 1 M حل GABA وضبط درجة الحموضة إلى 5 مع حمض الهيدروكلوريك 15. في واتهم هذا الرقم الهيدروجيني GABA، عندها فقط يمكن تطبيقها باستخدام الرحلان الشاردي. يرجى ملاحظة أن انخفاض الرقم الهيدروجيني في المحلول طرد إلى الفضاء خارج الخلية قد تؤثر انتقال GABA نفسها 16،17.
    حماية حل GABA عن الضوء وبشكل متكرر إعداد الطازجة حل الأسهم GABA، منذ حل الأكبر سنا يمكن أن تفقد فعاليتها.
  6. إذا كان من الصعب أن نرى الأحداث GABAergic، ومرحباGH الكلورين - القيادة حل داخلي قوة، على سبيل المثال من خلال ترك خارج بوكل، قد تساعد على تصور الأحداث GABAergic لمعرفة ما إذا كان الرحلان الشاردي GABA يعمل، ولكن لتحقيق التكامل متشابك قد أوصت قوة دافعة الفسيولوجية. للكشف العام من الأحداث GABAergic صغيرة، يمكن للبروتوكول هو مبين في الشكل 8C مساعدة.

3. سحب واختبار الماصات الرحلان الشاردي

  1. بشكل عام، وسحب ماصات الحق هو ربما الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق رقابة الرحلان الشاردي ناقل عصبي. عند استخدام الرحلان الشاردي في خلية ثقافة، فمن الممكن لسحب أقطاب ناعم جدا مماثلة إلى microelectrodes حادة 10. في تجارب التصحيح، المشبك في شرائح حادة، ومع ذلك، هذه الماصات رقيقة جدا ينحني على سطح شريحة عندما يتم خفض هم في الأنسجة مع زاوية، مما يجعل من المستحيل التوصل إلى التشعبات أعمق.
  2. ولذلك، سحب ماصة مع نصيحة صغيرة جدا، بحيث لا غيرeurotransmitter يمكن أن يتسرب، ولكن الطرف يجب أن يكون لا يزال جامدة بما يكفي لتخترق الأنسجة (الشكل 2). على سبيل المثال، استخدم 150 GB F 8P ماصات فئة (منتجات العلوم، في Hofheim، ألمانيا) وساحبة الأفقي (على سبيل المثال DMZ-العالمي بولير، زيتز-أدوات محدودة، Martinsried، ألمانيا؛ أو بولير P-97، شركة سوتر الصك ، نوفاتو، CA) مع العديد من الخطوات لتحقيق سحب فتحة صغيرة، ولكن أيضا جامع قصيرة مع زاوية حادة (الشكل 2 والجدول 2).
  3. ومن الممكن أيضا استخدام ماصات زجاج الكوارتز لسحب ماصات iontophoretic 10. ومن المفترض أن هذه لها خصائص ميكانيكية أفضل وأن تكون أكثر موثوقية، ولكن هناك حاجة جر ليزر خاص. ولكن من الممكن أيضا لتحقيق نتائج جيدة مع ماصات الزجاج العادي، والتي عادة ما تستخدم لسحب ماصات التصحيح.
  4. اختبار أداء ماصة ومقاومة في غرفة دون الأنسجة، قبل استخدامها لأولالوقت، منذ تسرب من الغلوتامات يمكن أن تضر الأنسجة.
  5. إعداد مكبر للصوت الرحلان الشاردي بشكل صحيح. ثم ملء ماصة مع الناقل العصبي وصبغ تحتوي على الحل ووضعه في حمام (ACSF).
  6. تعويض السعة (الشكل 3). عادة ماصات حادة جدا سيكون لها السعة أعلى من تلك حادة.
  7. تحقق المقاومة من ماصة: مكبر للصوت-الرحلان الشاردي الدقيقة المستخدمة هنا لديه في بناء ميزة لقياس مقاومة ماصة. أنها تثير موجز البقول اختبار مستطيلة، والتي يمكن رصدها مع الذبذبات القياسية أو لوحة A / D وصله بجهاز الكمبيوتر مع برنامج الحصول على. اعتمادا على شكل وحجم غيض، ينبغي للطرف ديها مقاومة بين 25-90 MΩ.
  8. التركيز على طرف مع الهدف مياه الغمر 60X 40X أو والتحول إلى التصوير الفلورسنت وإذا كان ذلك ممكنا، تكبير. إذا تسرب صبغة الفلورسنت من طرف ماصة، وتطبيق إيجابية صغيرة (في حالة غلوtamate) أو سلبية (في حالة GABA، الشكل 4) الاحتفاظ الحالي (<0.02 أمبير). إذا كان هذا لا يساعد على إلغاء التسرب، وتغيير ماصة.
  9. تطبيق الحالية خطوة قوية أو استخدام المشغل اليدوي ومراقبة طرف في الصورة الفلورسنت لمعرفة ما إذا كان يمكن إخراج الحل للخروج من ماصة. كما ذكر أعلاه، فإن التقاطب من نبض الحالية يعتمد على المسؤول عن جزيء التي من المفترض أن يتم إخراجه. لإخراج الغلوتامات هو تيار السلبية والإيجابية GABA تيار (الشكل 4).
  10. فقاعات الهواء في ماصة أن طرد كتلة من صبغ والارسال، يمكن تطهيرها عن طريق تطبيق طرد العالية الحالية عدة مرات.
  11. أخذت معا، وإذا كان هناك أي تسرب وضوحا وكان طرد تجربة ناجحة، وتعويض السعة وبدء التجربة.
  12. تنبيه: بما أن يتحقق التعويض السعة من قبل دائرة ردود الفعل، وهذا يمكن التجاوز أو الدائرة التأرجح إذا كان overcompensated. استخدام بلطف إعداد الاتصال الهاتفي للحصول على تعويض السعة.
  13. اعتمادا على الاستقرار ساحبة من الضروري أحيانا لضبط إعدادات ساحبة من وقت لآخر، منذ خيوط قد تغيرت خصائص. ومع ذلك، إذا تم تصميم مرة واحدة في ماصة جيدة، ويمكن استخدامه لعدة أيام. لذلك، بعد الانتهاء من التجربة تخزين ماصة iontophoretic في حاوية مغلقة دون الإضرار طرف.
  14. للتجربة القادمة ملء ماصة مع الحل العصبي، وتطبيق العديد من البقول الإخراج قوية لمسح طرف وثم تحقق مما إذا الخصائص (مثل مقاومة) تغير بشكل ملحوظ. ثم تعويض السعة واستخدام ماصة مرة أخرى. لا تستخدم ماصة واحدة مع حلول العصبي المختلفة.

4. إعداد شرائح الدماغ

  1. إذا تم استخدام الصغرى الرحلان الشاردي للمرة الأولى بالتأكيد تحضير شرائح بعد وضع برنامج ساحب العمل بشكل موثوق.
    2. <إجراءات لى> أداء التخدير وقطع الرأس وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من مؤسستك أو السلطة المحلية.
  2. بعد إزالة الدماغ، ونقل ذلك إلى جليد السكروز ACSF الباردة (انظر بروتوكول 2.1).
  3. قطع المنطقة من الفائدة إلى شرائح من سمك المناسب (على سبيل المثال 300 ميكرون).
  4. احتضان شرائح في ACSF السكروز في 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وفي وقت لاحق، نقل منهم إلى دائرة القابضة المغمورة التي تحتوي على ACSF طبيعي في درجة حرارة الغرفة.
  5. في جميع أنحاء إعداد والتجربة carbogenize في ACSF المحيطة شرائح مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2.

5. إنشاء تسجيل خلية كاملة

  1. ضع ماصة الرحلان الشاردي (ق) بالفعل بالقرب من سطح شريحة قبل الترقيع خلية، لتجنب المواقع يدوم طويلا، بعد إنشاء وضع كامل الخلية.
  2. سحب مقاومة منخفضة التصحيح ماصة (3-5 mΩ)، ملئه مع دانتم تحتوي على حل داخلي وتطبيق الضغط الايجابي على ماصة (30 - 60 م بار).
  3. أدخل الحمام ونهج الخلية تحت التوجيه البصري (الأشعة تحت الحمراء على النقيض dodt أو اثنين الفوتون التدرج صورة النقيض).
  4. رصد المقاومة ماصة مع نبض الاختبار (على سبيل المثال -10 بالسيارات، و 20 مللي ثانية) في وضع المشبك الجهد. عندما لمس الأنسجة تصحيح إمكانية تعويض.
  5. نقترب من خلية ودفع بلطف غيض ماصة في ذلك حتى "الدمل" يمكن رؤيتها بوضوح. الافراج عن الضغط من ماصة فورا، وتطبيق 40 - 60 م بار الضغط السلبي وتبديل غشاء المحتملة إلى -65 بالسيارات.
  6. عندما تصل إلى عقد الحالي قيم أقل من 100 باسكال، والإفراج عن الضغط السلبي.
  7. بعد إنشاء ختم GIGA (المقاومة> 1 GΩ)، وتمزق الغشاء مع قصيرة، وشفط قوية للماصة أو إفراط وجيزة من الدائرة التعويض السعة.
  8. اعتمادا على الوضع الذي (المشبك الجهد أو التيار) مطلوبلتصميم تجريبي، وتعويض مناسب.
  9. بدء لجلب ماصة iontophoretic إلى موقفها النهائي. إذا كان هناك حاجة وصفا أكثر تفصيلا لكيفية تنفيذ التسجيلات المشبك التصحيح بنجاح، وهناك العديد من المبادئ التوجيهية الممتازة المتاحة 18،19.

6. ضع ماصة Iontophoretic وتوليد المحتملة Iontophoretic بعد المشبكي

  1. بشكل عام، يمكن أن أثار الأحداث iontophoretic في مواقع محددة اعتمادا على التجربة المطلوبة، على سبيل المثال، في التغصنات شائك للالغلوتامات الصغرى الرحلان الشاردي، في رمح شجيري، سوما أو الجزء الأولي محوار لGABA الصغرى الرحلان الشاردي.
  2. الاقتراب من الخلية يصل إلى حوالي 1 ميكرون مسافة دون لمسها. بعد وظيفة ذات الاهتمام فمن الأهمية بمكان أن لا العصبي يتسرب وأن يتم تعويض السعة ماصة بشكل صحيح.
  3. إذا تقترب من الخلية مع الغلوتامات مليئة pipett iontophoreticه يسبب الاستقطاب للكشف عن غشاء المحتملة، وضبط الاحتفاظ الحالية إن أمكن، أو تغيير ماصة.
  4. تطبيق نبضات قصيرة السلبية الحالية، بدءا من الصفر وزيادة التيار بشكل منتظم (على سبيل المثال 0،1-0،4 ميللي ثانية، ،01-1 أمبير البقول). وهذا يساعد على معرفة والتي تتراوح في التيار iontophoretic تثير استجابات المطلوب في تجريبية محددة انشاء.
  5. إذا لم يكن هناك استجابة يمكن كشفها، ورفع ماصة عدة مئات من ميكرومتر وتطبيق إخراج تيار قوي (> 0.1 أمبير) لتنظيف طرف. ضبط تعويض السعة، والاقتراب من الخلية، وحاول مرة أخرى.
  6. إذا كان لا يزال هناك أي رد، والحد من الاحتفاظ الحالي. كن حذرا جدا مع إعدادات الطلب لأن هذا الإجراء يمكن أن يؤدي إلى إطلاق ناقل عصبي غير المنضبط. ولذلك، رصد باستمرار تسجيل للكشف عن تغيرات منها في غشاء المحتملة.
  7. إذا كان من الصعب للكشف عن الأحداث GABAergic، يمكن أن يكون من المفيد استخدامن تكوين الحل الداخلي ينتج في الكلور عالية - القوة الدافعة. لتحقيق هذا، والحد من الكلورين - التركيز في حل ماصة (انظر القسم بروتوكول 2.6). وهذا سيؤدي في الأحداث GABAergic أكبر في غشاء المحتملة يستريح بسبب قوة دافعة أعلى.
  8. بدلا من ذلك، حقن الخطوات الحالية طويلة مما أدى إلى غشاء فرص محتملة من -100 إلى -48 بالسيارات بالسيارات (8C الشكل). مع هذا البروتوكول الكلورين - يتم زيادة القوة الدافعة في إمكانات hyperpolarized مما تسبب في استجابة GABA إزالة إستقطاب.
  9. ومن الممكن أيضا لاستخدام بروتوكول الحقن الحالية خطوة لتحديد إمكانية انعكاس للأحداث أثار، مما يساعد على تحديد طبيعة GABAergic من الأحداث. تسرب GABA هو أصعب للكشف عن تسرب من الغلوتامات. في هذه الحالة، يمكن للرصد المستمر للمقاومة مدخلات مساعدة، عندما اقترب ماصة GABA شغلها. إذا يقلل من مقاومة المدخلات، والاحتفاظ الحالية يمكن بزادت البريد أو ينبغي أن تستخدم ماصة مختلفة.
  10. كما التجارب الرقابة على الرحلان الشاردي الغلوتامات، نقترح 2 + تجربة التصوير كاليفورنيا، وذلك باستخدام 200 ميكرومتر OGB-1 و لا EGTA في حل ماصة لتصور تدفق الكالسيوم المحلية التي قد تكون ناجمة عن تسرب الغلوتامات.
  11. بشكل عام، من أجل تحقيق استجابة مستقرة من المهم جدا أن يكون ماصة مستقرة ميكانيكيا لتجنب الانجراف مع مرور الوقت. يمكن أن يكون سبب الانحراف عن طريق التغيرات في درجات الحرارة، ولذلك فمن المستحسن لتشغيل المعدات نصف ساعة على الأقل قبل القياسات لتجنب الانجراف الحرارية. تأكد من استخدام الأختام خرطوشة جيدة في حامل ماصة ويتم إصلاح غيض حقا. صاحب نفسها يمكن ان تكون ثابتة بالإضافة إلى ذلك مع شريط تفلون، وعلاوة على ذلك، تأكد من أنه لا يوجد أي توتر على الكابلات من headstage أو مناور، الذي هو أيضا مصدرا محتملا للانجراف.

النتائج

مقاربة بسيطة لتحديد مدى انتشار المكاني للالرحلان الشاردي هو التراجع عن ماصة iontophoretic متدرج من التغصنات، مع الحفاظ على الغلوتامات طرد مستمر. وجدنا أن مدى المكاني للتحفيز-iontophoretic الصغرى كان يبلغ قطرها حوالي 12 ميكرون (الشكل 1 يبين دائرة نصف قطرها). مدى عمق في أنس?...

Discussion

هنا نجد تفسيرا لكيفية تطبيق سريع الصغرى الرحلان الشاردي من الناقلات العصبية للتحقيق التكامل متشابك على التشعبات. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لتحقيق الجلوتاميرجي وGABAergic انتقال متشابك في مناطق الدماغ المختلفة في المختبر والمجراة 9،20-22. وقد استخدم الصغرى ...

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر هانس رينر أرض مستصلحة من البحر، مارتن فورمان ووكر جاكسون لقراءة المخطوطة بعناية. تلقى الكتاب التمويل الذي تم توفيره من قبل وزارة البحث MIWF الدولة Northrhine-WESTFALIA (SR)، وBMBF-Projekträger DLR التعاون بين الولايات المتحدة والألمانية في علم الأعصاب الحسابية (CRCNS؛ SR)، مراكز التميز في أمراض الاعصاب (COEN؛ SR)، وجامعة بون برنامج تمويل جماعية (BONFOR؛ SR).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)LaVision Biotec, Bielefeld, Germany 
Two-photon laser scanning microscope Ultima IVPrairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA 
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laserChameleon Ultra II, Coherent 
60X Objective, NA 0.9Olympus 
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscopeTILLPhotonics, Gräfelfing, Germany 
MonochromatorTILLPhotonics, Gräfelfing, Germany 
Micro-iontophoresis system MVCS-02NPI Electronics, Tamm, Germany 
Sutter puller P-97Sutter Instrument Company, Novato, CA 
Glass filaments (150 GB F 8P)Science Products, Hofheim, Germany 
 Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazideMolecular Probes life technologiesA-10436 
Alexa Fluor 594Molecular Probes life technologiesA-10438 
NaClSigma AldrichS7653 
KClSigma AldrichP9333 
NaH2PO4Sigma AldrichS8282 
NaHCO3Sigma AldrichS6297 
SucroseSigma AldrichS7903 
CaCl2Sigma AldrichC5080 
MgCl2Sigma AldrichM2670 
GlucoseSigma AldrichG7528 
K-GluconateSigma AldrichG4500 
HEPES-acidSigma AldrichH4034 
PhosphocreatinSigma AldrichP7936 
EGTASigma AldrichE3889 
Glutamic acidSigma AldrichG8415 
GABASigma AldrichA5835 
NaOHMerck1.09137.1000 
HClMerck1.09108.1000 

References

  1. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  2. Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
  3. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
  4. Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
  5. Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
  6. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
  7. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
  8. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
  9. Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
  10. Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
  11. Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
  12. Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
  13. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
  14. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
  15. Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
  16. Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
  17. Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
  18. . . Single-Channel Recording. , (2009).
  19. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
  20. Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
  21. Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
  22. Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
  23. Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
  24. Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
  25. Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
  26. Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
  27. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
  28. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

77 GABA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved