Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

Özet

Bu yazıda yüksek uzaysal ve zamansal hassasiyetle postsinaptik sinyal entegrasyonu araştırmak için bir teknik olarak nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez tanıtmak.

Özet

Nörobilim temel ilgi alanlarından biri sonunda akson de aksiyon potansiyeli nöronal çıkışına yol açan dendritik ağaç, çok kompleks yapısı boyunca eksitatör ve inhibitör girdi entegrasyonu anlamaktır. Nöronal çıkış belirli sinaptik giriş farklı mekansal ve zamansal parametrelerinin etkisi dendritik girdi mesafe bağımlı zayıflama, mekansal ayrılmış giriş yerini bağımlı etkileşim, uyarıcı entegrasyonu, lineer üzerinde GABAergig inhibisyon etkisi örneğin, halen araştırılmaktadır ve doğrusal olmayan entegrasyon modları, ve çok daha fazlası.

Glutamat ve GABA hızlı mikro-iyontoforez ile tam glutamaterjik uyarma ve GABAerjik inhibisyon mekansal ve zamansal entegrasyonu incelemek mümkündür. Kritik teknik gereksinimleri ya tetiklenen floresan lamba, ışık yayan diyot (LED), ya da bir iki foton SCA olandoku önemli fotoğraf zarar tanıtan olmadan dendritik dalları görselleştirmek için mikroskop nning. Ayrıca, yüksek direnç pipetler hızlı kapasite tazminat sağlayan bir mikro-iyontoforez amplifikatör olması çok önemlidir. Başka bir önemli nokta hiçbir verici istemsiz deney sırasında pipet tarafından yayımlanan olmasıdır.

Bir kez kurulan bu tekniği yüksek bir nörotransmitter ve konumu özgüllük ile güvenilir ve tekrarlanabilir sinyalleri verecektir. Glutamat ve GABA uncaging ile karşılaştırıldığında, hızlı iyontoforez görüş alanı için sınırlama olmaksızın aynı anda ama çok uzak yerlerde hem vericileri kullanarak sağlar. Orada akson odak elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında avantajları da vardır: mikro-iyontoforez ile giriş sitenin konumu kesinlikle bilinir ve ilgi sadece nörotransmitter serbest emin olabilirsiniz. Ancak bu mikro-iyontoforez sadece dikkate alınmalıdırpostsynapse devreye girer ve nörotransmitter serbest presinaptik yönleri çözülmüş değildir. Bu yazıda beyin dilim deneylerinde mikro-iyontoforez kurmak nasıl gösterilmektedir.

Giriş

Merkezi sinir sisteminde nöronların ince ve dallanmış dendritik süreçleri ¹ sinaptik çeşitli girişler almak. Orada, eksitatör dendritik girişlerin çoğunluğu glutamaterjik sinaps aracılık eder. Bu sinaps eksitatör postsinaptik potansiyeller (EPSPS) bir postsinaptik doğrusal entegrasyonu ile sonuçlanan, bir mekansal dağıtılmış şekilde devreye alınabilir. Sinaps aynı anda ve dendrit üzerine mekansal yakınlık içinde aktif ise, bu uyarıcı girişler supra-lineer entegre ve dendritik ani ^2-5 oluşturmak olabilir.

Ayrıca, eksitatör girdilerin entegrasyonu dendritik ağaç üzerindeki giriş yerini bağlıdır. Distal tutam bölgede varmak sinyalleri çok daha zayıflatılmış kablo filtreleme ⁶ nedeniyle proksimal girişi daha vardır. Hipokampus, apikal tutam dendritler için uzak girdi proksimal dendri üzerinde daha farklı bir beyin bölgesi tarafından oluşturulantes ^7. Heyecan verici bir soru bu nedenle, ne kadar sinaptik giriş farklı dendritik bölmeleri tarafından işlenen ve dendritik entegrasyon farklı şekillerde nöronal ateşleme bu katmanlı girişlerinin etkisi düzenler eğer. Edilir

Fonksiyonel özellikleri, dendrit morfolojik özellikleri Sadece, giriş yerini ve kümeleme önemlisi glutamaterjik sinaps ^8,9 etkinliğini belirlemek de uyarıcı girişleri, GABAerjik terminallerinden ek inhibitör girişlerin dendritik entegrasyonu etkiliyor. Sinaptik entegrasyon Bu farklı yönlerini ideal dendritik etki için farklı nörotransmitterlerin mekansal tanımlı uygulama sağlar nörotransmitter mikro-iyontoforez, kullanılarak incelenebilir. Biz başarıyla nöronlar sinyal entegrasyon araştırmak glutamat ve GABA mikro-iyontoforez kurmak için nasıl burada göstermek.

Bu uygulama, ince uçlu içinKonsantre nörotransmitter çözeltisi ile doldurulur, yüksek direnç pipetler kullanılır. Bu pipet nörotransmiter reseptörleri bulunmaktadır hücresi, dış membran yakın konumlandırılmıştır. Dendritik dalların iyi bir görüntüleme gereklidir. Bu en iyi yama pipet vasıtasıyla tanıtılmaktadır floresan boyalar kullanılarak elde edilir. Daha sonra çok kısa bir (<1 milisaniye) akım darbesi (10 aralığında - 100 NA) şarj nörotransmitter molekülleri çıkarmak için kullanılır. Bu kısa bakliyat ve etkili kapasite tazminat ile, postsinaptik potansiyelleri veya akımlar eksitatör giriş yerini tam olarak bilinen anlamına gelir yüksek zamansal ve mekansal hassas, ile uyarılmış olabilir. Glutamat mikro iyontoforez (Şekil 1 ^9), burada gösterildiği gibi 6 um'den daha küçük olan bir yarıçap tanımlanabilir, sinaps aktive olabilir, ancak tek bir sinaps çözünürlük ^10-12 ulaşmak da mümkündür.

Heine, M., ve ark hızlı mikro-iyontoforez mekansal çözünürlükte bile düzenli glutamat ¹³ iki-foton uncaging ile elde nokta boyutları daha küçük olan 0.5 mikron altında boyutları, nokta ayarlanabilir gösterdi. Hızlı mikro-iyontoforez ile iki veya daha fazla iyontoforez pipetler kullanın ve dendritik ağaç üzerinde farklı, hatta uzak noktalarda yerleştirmek için kolayca mümkündür. Bu şekilde, farklı yollar gelenler de dahil olmak üzere uyarıcı etkinlik, entegrasyonu araştırılabilir. Bu, aynı zamanda, bir glutamat, GABA dolu bir iyontoforetik pipet kullanmak da mümkündür. Bu şekilde eksitatör giriş (on-yolu, off-yolu inhibisyonu) göre farklı yerlerde GABAerjik inhibisyon etkisi incelenebilir. Ayrıca, belirli nöronal etki hedef internöronlar tarafından inhibisyon etkisi, distal dendritler gibi, soma veya aksonlar ^14, GABA iyontoforez kullanılarak incelenebilir. Kültürlü nöronlarda, hızlı mikro-iyontoforez INVE için bir fırsat sunuyorçok daha ayrıntılı ^10,11 nöronların tek sinaps dağıtım ve sinaptik iletişim temel yönlerini stigate.

Bu yazıda giriş yeri, giriş güçlü ve zamanlama, tek başına ya da etkileşim içinde bağımlılığında eksitatör ve inhibitör girdi sinaptik entegrasyonu soruşturma sağlar akut beyin dilimleri, en kullanılmak üzere glutamat ve GABA iyontoforez kurmak için nasıl ayrıntılı olarak göstermektedir. Biz avantajları ve sınırlamaları bu tekniğin ve nasıl başarılı bir şekilde gidermek için işaret olacaktır.

Protokol

1. Sistem Gereksinimleri

1. Mikroskop sistemi: dendrit iyi görselleştirme önemlidir. Varsa, bir iki foton lazer tarama mikroskop sistemi kullanın. Sapphire ultra-darbeli lazer (Chameleon Ultra II, Tutarlı) ve yüksek NA amacı: Deneylerde bir Ti ile donatılmış bir TRIM Kapsam II, LaVision Biotec, Bielefeld, Almanya ya da Ultima IV sistemi, Prairie Teknolojileri, Middleton, Wisconsin kullanılan (60X, 0.9 NA, Olympus) biz yama pipet ile bir floresan boya ile dolu olan dendritler görselleştirmek için. Fotoğraf-zarar 2-foton tarama kullanarak daha hafif olduğu düşünülmektedir rağmen, lazer gücü azaltmak (dokuda altında 8 mW) ve bekleme süreleriyle (aşağıda 1 mikrosaniye) veya mümkün olduğunca.
2. İkinci bir olasılık mümkün olduğunca maruz kalma süresini azaltmak için satın alma ile eşzamanlı bir geniş alan floresan ışık kaynağı (LED veya floresan lamba) tetiklemek için olduğunu. Biz entegre bir ışık kaynağı (TILLPho bir monokromatör kullanmışDodt kontrastlı kızılötesi aydınlatma (TILLPhotonics, Gräfelfing, Almanya) ile donatılmış bir Zeiss Axioskop 2 FS dik mikroskop tonikler, Gräfelfing, Almanya). Deneylerde pozlama süreleri msn genellikle 10 maks değişmektedir. 30 msn.
3. Iki kanallı mikro-iyontoforez sistemi örneğin Kızamık aşılamasından-C-02 (npi elektronik, Tamm, Almanya) hızlı kapasitans tazminat ile., Hızlı mikro-iyontoforez amplifikatör kullanın Ince uçlu iyontoforez Mikroelektronlar 25 dirençleri var - MQ 100 (en önemlisi ucu boyutu ve pipet şekline bağlı olarak), ve iyontoforez amplifikatör kapasitans tazminat en iyi şekilde ayarlanmış ise hızlı artış kez elde edilebilir. Bu hızlı tazminat iyontoforez pipet için alt milisaniye aralığında kısa ve hızlı başlayan akım darbeleri uygulamak ve böylece 1 mikron ¹³ aşağıda yer boyutlarda yüksek uzaysal çözünürlüğü ile verici çıkarmak için gereklidir. İyontoforez amplifikatörler al vardırbizim laboratuvarda test değil diğer bazı şirketler, bu kadar kullanılabilir. Bu cihazlar kapasite tazminat devresi ile donatılmış değil bilgimizi için vardır.

2. Çözümler hazırlayın

1. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ve deney tasarımı için gerekli olduğu gibi iç çözeltisi hazırlayın. Gerekli iç çözüm, tek sıra optik donanım bağlı olarak kırmızı veya yeşil floresan boya (örneğin 50 ila 200 mcM Alexa Fluor 488 veya 594 hidrazin Invitrogen) 'dir. Ve normal ACSF için, 60 NaCl, 100 sukroz, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, 1 _CaCl2, 5 _MgCl2, 20 glukoz: mM diseksiyon için kullanılabilir ACSF _sukroz, burada bir örnek mM olarak patch-clamp deneyler solüsyon: 125 NaCI, 3 KCI, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, 2.6 _CaCl2, 1.3 _MgCl2, 15 glukoz.
2. Tüm dışı çözümler sürekli olarak (% 95 O _2,% 5 CO ₂₎ Carbogenize.
3. MM olarak, örneğin, iç çözeltisi hazırlayın: 140 K-glukonat, 7 KCI, 5 Hepes-asit, 0.5, _MgCl2, 5 fosfat, 0.16 mM EGTA, 50 - 200 uM Alexa 488.
4. Glutamat için mikro-iyontoforez 150 mM glutamik asit, bir çözelti hazırlamak ve NaOH ile pH değeri 7.0 'ye ayarlayın. 50 -200 mcM Alexa Fluor 488 veya görselleştirme için 594 hydrazide (Invitrogen) ekleyin.
5. GABA iyontoforez 1 M'lik bir çözeltinin hazırlanması GABA ve HCl ¹⁵ 5 ile, pH yi ayarlamak için. Bu pH GABA tahsil edilir de, ancak o zaman iyontoforez ile uygulanabilir. Çözümünde düşük pH GABA iletim kendisi ^16,17 etkileyebilecek dışı alana atılan lütfen unutmayın.
   Işıktan GABA çözüm korumak ve eski çözüm etkinliğini kaybedebilir çünkü sık sık, taze GABA stok solüsyon hazırlanır.
6. Bu GABAerjik olaylar, bir hi görmek zor isegh Cl ^- itici güç iç çözüm, KCl bırakarak, örneğin, GABA iyontoforez çalışıp çalışmadığını görmek için GABAerjik olayları görselleştirmek için yardımcı olabilir, ancak fizyolojik bir itici güç tavsiye olabilir sinaptik entegrasyon araştırmak. Küçük GABAerjik olayların genel tespiti için, Şekil 8C gösterilen bir protokol yardımcı olabilir.

3. İyontoforez Pipetler çekin ve test edin

1. Genel olarak, doğru pipetler çekerek belki kontrollü nörotransmitter iyontoforez elde etmek için en kritik adımdır. Hücre kültüründe iyontoforez kullanırken, ¹⁰ keskin bir mikroelektrot benzer çok ince elektrotlar çekmek mümkündür. Bunlar, bir açı ile dokuya indirildiğinde akut dilimleri içinde patch-clamp deneylerde, ancak, bu çok ince olan pipetler imkansız derin dendrit ulaşmak için yapım kesit yüzeyi üzerinde eğilir.
2. Bu nedenle, bu yüzden, çok küçük bir ucu ile bir pipet çekin hiçbir neurotransmitter dışarı sızıntı olabilir, ancak yine de ucu doku (Şekil 2) içine geçmek için yeterince sert olması gerekir. Veya P-97 Çektirme, Sutter Instrument Company, örneğin, 150 GB F 8P sınıf pipetler (Bilim Ürünleri, Hofheim, Almanya) ve yatay çektirmesi (örneğin bir DMZ-Evrensel Çektirme, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Almanya kullanın , dik bir açı ile (Şekil 2 ve Tablo 2) ile birlikte küçük bir delik, aynı zamanda, bir kısa uzantılar elde etmek için çeşitli çekme adımları Novato, CA).
3. Bu iyontoforez pipetler ¹⁰ çekmek için kuvars cam pipetler kullanmak da mümkündür. Bu daha iyi mekanik özelliklere sahip olduğu ve daha güvenilir olması gerekiyordu, ancak özel lazer Elcikler gereklidir. Ama genellikle yama pipetler çekme için kullanılan normal bir cam pipet ile iyi sonuçlar elde etmek de mümkündür.
4. İlk için kullanmadan önce, doku olmayan bir çember içinde pipet performans ve direnç testizaman, glutamat kaçak yana doku zarar verebilir.
5. Doğru iyontoforez amplifikatör ayarlayın. Daha sonra nörotransmitter ve boya içeren çözüm ile pipet doldurun ve banyo (ACSF) içine yerleştirin.
6. Kapasitans (Şekil 3) telafi. Genellikle çok keskin pipetler künt olanlardan daha yüksek bir kapasite olacak.
7. Pipet direnci kontrol edin: Burada kullanılan mikro-iyontoforez amplifikatör pipet direnci ölçmek için bir yap-özelliği vardır. Bu standart bir osiloskop veya satın alma yazılımı ile bir bilgisayara bağlı bir A / D kurulu ile izlenebilir kısa dikdörtgen test darbeleri, çağrıştırıyor. Şekil ve ucu boyutuna bağlı olarak, uç 25 arasında bir dirence sahip olmalıdır - MQ 90.
8. Pipet dışında floresan boya akarsa, bir 60X veya 40X suya daldırma hedefi ve floresan görüntüleme geçiş ile ve mümkünse ucu odaklanın, yaklaştırma, (glu durumunda küçük bir olumlu uygulamaktamate) veya negatif (GABA, Şekil 4 ile ilgili olarak) (<0.02 uA) akım korur. Bu kaçak iptal etmek için işe yaramazsa, pipet değiştirin.
9. Güçlü bir adım mevcut uygulama veya manuel tetik kullanımı ve çözüm pipet dışına çıkarılır olabilir görmek için floresan görüntü ucu izlemek. Yukarıda belirtildiği gibi, mevcut darbe kutup çıkartılabilmesi için gerekiyordu molekülün yük bağlıdır. Glutamat çıkarmak için bir negatif akım ve GABA olumlu akım (Şekil 4) için. Olduğu
10. Boya ve verici blok çıkarma, yüksek ejeksiyon akım birkaç kez uygulanarak giderilebilir ki pipet hava kabarcıkları var.
11. Hiçbir görünür sızıntı olup testi ejeksiyon başarılı olup olmadığını, Birlikte ele alındığında, kapasite telafi ve deney başlar.
12. Dikkat: kapasitans tazminat bir geri besleme devresi ile elde olduğundan, bu devre aşmayı olabilir veya overcomp ise salınımensated. Yavaşça kapasite tazminat için arama ayarını kullanın.
13. Filament özellikleri değişmiş olabilir bu yana çektirmesi istikrar bağlı olarak bu, bazen zaman zaman çektirmenin ayarlarını yapmak için gereklidir. Bir kere iyi bir pipet tasarlanmıştır, ancak birkaç gün için kullanılabilir. Bu nedenle, bitirdikten sonra deney ucu zarar vermeden kapalı bir kapta iyontoforez pipet saklayın.
14. Bir sonraki deneme nörotransmitter çözüm pipet doldurmak için, ucu açık ve daha sonra özellikleri (örneğin direnci) değişirse önemli ölçüde kontrol etmek için birkaç güçlü çıkarma bakliyat geçerlidir. Daha sonra kapasite telafi ve tekrar pipet kullanın. Farklı nörotransmitter çözümleri ile tek bir pipet kullanmayın.

4. Beyin Dilimleri hazırlayın

1. Mikro-iyontoforez ilk defa kullanılırsa kesinlikle güvenilir çalışma çektirmesi programı kurduktan sonra dilimleri hazırlamak.
Perform anestezi ve baş kesme işlemleri.
2. Beynin çıkarıldıktan sonra, buz soğuk ACSF _sakaroz (Protokol 2.1) aktarın.
3. Uygun kalınlıkta dilimler (örneğin 300 mikron) içine ilgi bölgesi kesin.
4. 30 dakika boyunca 35 ° C'de ACSF _sükroz dilimleri inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında normal ACSF içeren bir batık tutma odasına aktarabilirsiniz.
5. Hazırlanması ve deney boyunca% 95 O _2,% 5 CO ₂ ile dilim çevreleyen ACSF carbogenize.

5. Bir Tüm hücre Kayıt oluşturulması

1. Tam hücreli modu kurduktan sonra, uzun süreli konumlandırma önlemek için, yama bir hücre önce dilim yüzeyine yakın zaten iyontoforez pipet (ler) yerleştirin.
2. Düşük dirençli bir yama pipet (3 - MQ 5) çekin, d ile doldurunye iç çözüm içeren ve pipet pozitif basınç (30 - 60 mbar) geçerlidir.
3. Görsel gözetiminde banyo ve yaklaşım hücre (kızılötesi Dodt kontrast veya iki foton degrade kontrast görüntü) girin.
4. Gerilim kelepçe modunda bir test darbe (örneğin -10 mV, 20 msn) ile pipet direnci izleyin. Doku ofset potansiyel düzeltmek dokunurken.
5. Hücre yaklaşım ve hafifçe açıkça görülebilir bir "çukur" kadar içine pipet itin. 60 mbar negatif basınç ve -65 mV membran potansiyeli geçiş - hemen pipet basınç serbest, 40 geçerlidir.
6. Tutma akımı 100 pA altındaki değerler ulaştığında, negatif basınç bırakın.
7. Bir giga mühür kurduktan sonra (direnci> 1 GΩ), pipet veya kapasitans tazminat devrenin kısa aşırı telâfi için kısa, güçlü emiş gücü ile kopma membran.
8. Moda bağlı olarak (gerilim veya akım kelepçe) gereklidirdeneysel tasarım için, uygun telafi.
9. Nihai konumuna iyontoforez pipet getirmek için başlayın. Başarılı bir yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl daha ayrıntılı bir açıklama gerekiyorsa, ^18,19 kullanılabilir harika birkaç kurallar vardır.

6. Iontophoretic Pipet yerleştirin ve postsinaptik Iontophoretic Potansiyel Oluştur

1. Genel olarak, iyontoforez olaylar soma GABA ya da mikro-İyontoforez akson başlangıç ​​çizgi parçasının, dendritik şaftında, glutamat mikro iyontoforez bir dikenli dendrit de, örneğin, arzu edilen deneye bağlı olarak tanımlanan konumlarda uyarılmış olabilir.
2. Dokunmadan yaklaşık 1 mikron mesafe için hücre kadar Yaklaşım. Ilgi konumunu ulaştıktan sonra hiçbir nörotransmitter dışarı sızdıran ve pipet kapasitans doğru telafi olduğu olduğu çok önemlidir.
3. Glutamat ile hücre yaklaşan iyontoforetik pipett doldurulduğundae membran potansiyeli tespit depolarizasyon neden, mümkünse mevcut korumak ayarlamak, ya da pipet değiştirin.
4. , Kısa negatif akım darbeleri uygulayın sıfırdan başlayarak ve (örneğin 0,1-0,4 msn, 0,01-1 uA bakliyat) sistematik akım artar. Bu iyontoforez mevcut spesifik deneysel olarak istenen yanıtları set-up çağrıştıran hangi aralığında öğrenmek için yardımcı olur.
5. Yanıt tespit varsa, pipet birkaç yüz mikrometre kaldırmak ve ucu temizlemek için (> 0.1 uA) güçlü bir çıkarma akımı uygulanır. , Kapasite tazminat ayarlayın hücre yaklaşım ve yeniden deneyin.
6. Yanıt hala var ise, mevcut muhafaza azaltır. Bu işlem kontrolsüz nörotransmitter salınımına neden olabilir bu yana arama ayarlarını çok dikkatli olun. Bu nedenle, sürekli membran potansiyeli ilgili değişiklikleri tespit etmek için kayıt izlemek.
7. Bu GABAerjik olayları tespit etmek zor ise, bir kullanmak yararlı olabilirn iç çözüm kompozisyon yüksek Cl verimli ^- itici güç. Bunu başarmak için, Cl azaltmak ^- pipet çözüm (. Protokol bölüm 2.6 bakınız) konsantrasyonu. Bu, daha yüksek bir itici güç nedeniyle istirahat membran potansiyeli büyük GABAerjik etkinlik ile sonuçlanır.
8. Alternatif olarak, -100 mV -48 mV (Şekil 8C) için membran potansiyeli şansı sonuçlanan uzun geçerli adımları enjekte. Bu protokol ile Cl ^- itici güç bir depolarizan GABA tepki neden hiperpolarize potansiyelleri de artar.
9. Bu olayların GABAerjik nedenini belirlemek için yardımcı olur uyarılmış olaylar, ters potansiyelini belirlemek için adım mevcut enjeksiyon protokolü kullanmak da mümkündür. GABA Kaçak glutamat sızıntı daha tespit etmek zordur. Bu durumda, giriş direnci bir sürekli izlenmesi GABA dolduran pipet yaklaştığı zaman, yardımcı olabilir. Giriş direnci azalır, geçerli olabilir b korumakE artan ya da farklı bir pipet kullanılmalıdır.
10. Glutamat iyontoforez için kontrol deneyleri olarak, glutamat sızıntı neden olabileceği yerel kalsiyum girişini görselleştirmek için pipet çözüm 200 mcM OGB-1 ve hiçbir EGTA kullanarak, bir Ca ^{2 +} görüntüleme deney öneririz.
11. Genel olarak, kararlı bir yanıt elde etmek için zaman zarfında önlemek için mekanik olarak stabil bir pipet olması çok önemlidir. Drift sıcaklık değişimleri neden olabilir, bu nedenle ölçümlerin termal sürüklenme önlemek için önce en az yarım saat ekipman açmak için tavsiye edilir. Pipet tutucu iyi kartuş mühürler kullanmak ve ucu gerçekten sabit olduğundan emin olun. Sahibi kendisi ayrıca teflon bant ile tespit edilebilir, ayrıca, aynı zamanda kayması potansiyel bir kaynağı olan headstage veya manipülatör, gelen kabloları üzerinde herhangi bir gerilim olduğundan emin olun.

Sonuçlar

İyontoforez mekansal yayılmasını belirlemek için basit bir yaklaşım, püskürtülen glutamat sabit tutarken, dendrit arasında aşamalı iyontoforetik pipet geri etmektir. Bir mikro-iyontoforetik stimülasyon mekansal ölçüde yaklaşık 12 mikron (Şekil 1 yarıçapı arası) bir çapa sahip olduğu bulundu. Ne iyontoforez kullanılabilir dokusunda derin pipet sertliği bağlıdır. Bununla birlikte, burada kullanılan dilimleri (Şekil 2), deneyler için gerekli olan iyontofor...

Tartışmalar

Burada dendritler üzerinde sinaptik entegrasyon araştırmak için nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez nasıl uygulanacağını açıklar. Bu teknik, başarılı bir şekilde, in vitro ve in vivo olarak ^9,20-22, beynin farklı bölgelerinde ve glutamaterjik sinaptik transmisyonu GABAerjik araştırmak için kullanılmıştır. Mikro-iyontoforez 60 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır, ancak erken yıllarda çoğunlukla yerel olarak yavaş ya da ara zaman çizelgesi ^23...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV	Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser	Chameleon Ultra II, Coherent
60X Objective, NA 0.9	Olympus
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope	TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany
Monochromator	TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany
Micro-iontophoresis system MVCS-02	NPI Electronics, Tamm, Germany
Sutter puller P-97	Sutter Instrument Company, Novato, CA
Glass filaments (150 GB F 8P)	Science Products, Hofheim, Germany
			Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide	Molecular Probes life technologies	A-10436
Alexa Fluor 594	Molecular Probes life technologies	A-10438
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6297
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
CaCl2	Sigma Aldrich	C5080
MgCl2	Sigma Aldrich	M2670
Glucose	Sigma Aldrich	G7528
K-Gluconate	Sigma Aldrich	G4500
HEPES-acid	Sigma Aldrich	H4034
Phosphocreatin	Sigma Aldrich	P7936
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Glutamic acid	Sigma Aldrich	G8415
GABA	Sigma Aldrich	A5835
NaOH	Merck	1.09137.1000
HCl	Merck	1.09108.1000