Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.

Zusammenfassung

Eines der grundlegenden Interessen in den Neurowissenschaften ist es, die Integration von erregenden und hemmenden Eingänge entlang der sehr komplexen Struktur der dendritischen Baumes, die schließlich führt zu neuronalen Ausgang der Aktionspotentiale am Axon verstehen. Der Einfluss verschiedener räumlicher und zeitlicher Parameter des spezifischen synaptischen Eingang neuronale Ausgang wird derzeit untersucht, z. B. den Abstand Dämpfung von dendritischen Eingänge, die ortsabhängige Wechselwirkung von räumlich getrennten Eingängen der Einfluss GABAergig Hemmung exzitatorischen Integration linearen und nichtlineare Integration Modi und vieles mehr.

Mit schnellen Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA ist es möglich, genau zu untersuchen, die räumliche und zeitliche Integration der glutamatergen Anregung und GABAergen Hemmung. Critical technischen Anforderungen entweder eine ausgelöste Leuchtstofflampe, Leuchtdiode (LED) oder eine Zwei-Photonen-scanning Mikroskop zu dendritischen Zweigen, ohne dabei signifikante Foto-Schädigung des Gewebes sichtbar zu machen. Weiterhin ist es sehr wichtig, eine Mikro-Verstärker Iontophorese, das eine schnelle Kompensation der Kapazität hohe Pipetten ermöglicht haben. Ein weiterer entscheidender Punkt ist, dass kein Sender unfreiwillig durch die Pipette während des Experiments veröffentlicht.

Einmal eingerichtet, wird diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Signale mit einer hohen Spezifität Neurotransmitter und Lage geben. Im Vergleich zu Glutamat und GABA Uncaging, ermöglicht eine schnelle Iontophorese mit beiden Sendern gleichzeitig aber zu sehr weit entfernten Orten ohne Einschränkung des Sichtfeldes. Es gibt auch Vorteile gegenüber Schwerpunkt elektrische Stimulation von Axonen: mit Mikro-Iontophorese die Lage des Eingangs Website ist definitiv bekannt und es ist sicher, dass nur der Neurotransmitter von Interesse freigesetzt wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass mit Mikro-Iontophorese werden nur diePostsynapse aktiviert und präsynaptischen Aspekte der Freisetzung von Neurotransmittern werden nicht aufgelöst. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen, wie Sie Mikro-Iontophorese in Hirnschnitt Experimente.

Einleitung

Neuronen im zentralen Nervensystem erhalten eine Vielzahl von synaptischen Eingänge auf ihren dünnen und verzweigten dendritischen Prozesse ^1. Es sind die meisten der exzitatorischen dendritischen Eingänge glutamatergen Synapsen vermittelt. Diese Synapsen in einem räumlich verteilten Weise aktiviert werden, was zu postsynaptischen lineare Integration von exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP). Wenn die Synapsen gleichzeitig und in räumlicher Nähe auf der Dendriten aktiviert sind, können diese exzitatorischen Eingänge supra-linear integriert werden und erzeugen dendritische Dornen ^2-5.

Darüber hinaus hängt die Integration von exzitatorischen Eingänge von der Lage des Eingangs auf die dendritische Struktur. Signale, die am distalen Büschel Region ankommen sind viel stärker gedämpft als proximalen Eingänge aufgrund Kabel Filterung ^6. Im Hippocampus, werden entfernte Eingänge zu den apikalen Dendriten Büschel durch eine andere Hirnregion als die auf proximalen dendri erzeugttes ^7. Eine spannende Frage ist daher, wie synaptische Input von verschiedenen dendritischen Fächer verarbeitet und wenn dendritischen Integration regelt den Einfluss dieser geschichteten Eingänge auf neuronale Aktivität in unterschiedlicher Weise.

Nicht nur die funktionellen Eigenschaften, morphologische Merkmale des Dendriten, sind der Ort und die Clusterbildung der Eingänge, die die dendritische Integration von exzitatorischen Eingänge, die auch die zusätzliche hemmende Eingänge von GABAergen Terminals bestimmen maßgeblich die Wirksamkeit der glutamatergen Synapsen ^8,9. Diese verschiedenen Aspekte der synaptischen Integration lässt sich ideal mit untersucht werden Neurotransmitter Mikro-Iontophorese, die räumlich definierte Anwendung verschiedener Neurotransmitter ermöglicht dendritischen Domänen. Wir zeigen hier, wie man erfolgreich etablieren Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA um das Signal Integration in Neuronen zu untersuchen.

Für diese Anwendung, spitzenhohe Beständigkeit Pipetten mit konzentrierter Neurotransmitter Lösungen gefüllt werden. Diese Pipetten sind in der Nähe der äußeren Membran der Zelle, wobei die Neurotransmitter-Rezeptoren befinden positioniert. Eine gute Visualisierung der dendritischen Äste erforderlich. Dies wird am besten durch Fluoreszenzfarbstoffe, die über der Patch-Pipette eingeführt werden. Dann wird eine sehr kurze (<1 ms) Stromimpuls (im Bereich 10 - 100 nA) verwendet wird, um die geladenen Neurotransmittermolekülen auszuwerfen. Mit diesen kurzen Pulsen und effektive Kapazität Kompensation kann postsynaptischen Potentiale oder Ströme mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision, die die Lage des exzitatorischen Eingang genau bekannt ist bedeutet hervorgerufen werden. Glutamate Mikro-Iontophorese kann Synapsen in einem definierten Radius, der kleiner als 6 um, wie hier (1 ⁹⁾ gezeigt wird, zu aktivieren, sondern es ist auch möglich, einzelne Synapse Auflösung ^10-12 zu erreichen.

Heine, M., et al zeigte, dass die räumliche Auflösung des schnellen Mikro-Iontophorese auch eingestellt werden, um Größen unterhalb 0,5 um, die kleiner als Messfelder regelmäßig mit zwei Photonen Uncaging von Glutamat ¹³ erreicht, zu beschmutzen. Mit schnellen Mikro-Iontophorese ist es leicht möglich, zwei oder mehr iontophoretisches Pipetten verwenden und legen Sie sie in verschiedenen, auch weit entfernte Punkte auf der dendritischen Baum. Auf diese Weise läßt sich der Einbau von exzitatorischen Ereignisse, einschließlich der aus den verschiedenen Wegen, untersucht werden. Es ist auch möglich, eine Glutamat und GABA gefüllten Pipette iontophoretischen gleichzeitig verwenden. Auf diese Weise wird die Wirkung von GABA-erge Hemmung an verschiedenen Orten relativ zu der exzitatorischen Eingang (on-Pfad, außerhalb des Weges Hemmung) untersucht werden können. Auch die Auswirkungen der Hemmung durch Interneurone auf bestimmte neuronale Domains, wie distalen Dendriten, Soma oder Axonen ^14, untersucht mit GABA Iontophorese werden. In kultivierten Neuronen, bietet schnellen Mikro-Iontophorese die Möglichkeit, Investigate einzelne Synapse Verteilung und die elementaren Aspekte der Kommunikation von Synapsen in Neuronen in viel mehr Details ^10,11.

In diesem Artikel zeigen wir im Detail, wie Glutamat und GABA Iontophorese für den Einsatz in akuten Hirnschnitten, die Untersuchung synaptischer Integration von erregenden und hemmenden Eingänge ermöglicht in Abhängigkeit der Eingabe Lage, Eingang Stärken und Timing, allein oder im Zusammenspiel zu etablieren. Wir weisen darauf hin, die Vorteile und Grenzen dieser Technik und wie man erfolgreich beheben.

Protokoll

1. Systemanforderungen

1. Mikroskop-System: Gut Visualisierung des Dendriten ist entscheidend. Falls vorhanden, verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop-System. In unseren Experimenten verwendeten wir eine TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Deutschland oder Ultima IV-System, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin mit einem Ti ausgestattet: Sapphire ultraschnelle-gepulste Laser (Chameleon Ultra II, Coherent) und eine hohe NA Ziel (60X, 0,9 NA, Olympus) zur Visualisierung der Dendriten, die wir mit einem Fluoreszenzfarbstoff über die Patch-Pipette gefüllt hatte. Obwohl photo-Schäden als weniger stark mit der 2-Photonen-Scanning, reduzieren die Laserleistung (unter 8 mW im Gewebe) und Verweilzeiten (unter 1 us) oder so viel wie möglich.
2. Eine zweite Möglichkeit besteht darin, eine Weitfeld-Lichtquelle (LED oder eine Leuchtstofflampe) synchron auslösen mit der Akquisition bis Belichtungszeit so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben einen Monochromator mit einer integrierten Lichtquelle (TILLPho verwendetTonika, Gräfelfing, Deutschland) auf einem Zeiss Axioskop 2 FS aufrechten Mikroskop, das mit Dodt kontrastreiche Infrarot-Beleuchtung (TILLPhotonics, Gräfelfing, Deutschland) ausgerüstet war. In unseren Experimenten Belichtungszeiten reichten von üblicherweise 10 ms bis max. 30 msec.
3. Nutzen Sie eine schnelle Mikro-Iontophorese Verstärker, zB eine Zwei-Kanal-Mikro-Iontophorese-System MVCS-C-02 (NPI electronic, Tamm, Deutschland) mit schnellen Kapazität Entschädigung. Die spitzen Iontophorese Mikroelektroden haben Widerstände von 25 - 100 MOhm (entscheidend abhängig von der Größe der Spitze der Pipette und Form), und schnelle Anstiegszeiten kann nur erreicht werden, wenn die Kapazität Kompensation der iontophoretisches Verstärker optimal abgestimmt wird. Dieser schnelle Ausgleich ist notwendig, um Stromimpulse mit einer kurzen und schnellen Wirkungseintritt im Sub-Millisekundenbereich zur iontophoretisches Pipette anwenden und dadurch die Sender mit hoher räumlicher Auflösung in Messfelder unter 1 um ¹³ auszuwerfen. Iontophorese-Verstärker sind also ab mehrere andere Unternehmen, die wir nicht in unserem Labor getestet. Diese Geräte sind nach unserem Wissen nicht mit der Kapazität Kompensationsschaltungsanordnung ausgestattet.

2. Bereiten Lösungen

1. Bereiten künstlichen Liquor (ACSF) und interne Lösung, da es für die experimentelle Design erforderlich ist. Die einzige zusätzlich zum inneren Lösung, die erforderlich ist, ist eine rote oder grüne Fluoreszenz-Farbstoff (zB 50 bis 200 um Alexa Fluor 488 oder 594 Hydrazid, Invitrogen), abhängig von der optischen Vorrichtung. Hier ein Beispiel für ACSF _Saccharose, die für die Präparation verwendet werden kann, in mM: NaCl 60, ​​100 Saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 1 CaCl _2, 5 MgCl _2, 20 Glukose, und für normale ACSF Lösung für Patch-Clamp-Experimente in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 2,6 CaCl _2, 1,3 MgCl _2, 15 Glukose.
2. Carbogenize (95% O _2, 5% CO ₂₎ Alle extrazellulären Lösungen ständig.
3. Bereiten interne Lösung, beispielsweise in mm: 140 K-Gluconat, 7 KCl, 5 HEPES-Säure, 0,5 MgCl _2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA; mit 50-200 pM Alexa 488.
4. Für Glutamat Mikro-Iontophorese Herstellung einer Lösung mit 150 mM Glutaminsäure und der pH-Wert mit NaOH auf 7,0. In 50 -200 uM Alexa Fluor 488 oder 594 Hydrazid (Invitrogen) für die Visualisierung.
5. Für Iontophorese von GABA bereiten eine 1 M GABA-Lösung und der pH-Wert bis 5 mit HCl ^15. Bei diesem pH GABA aufgeladen ist, nur dann kann es unter Verwendung Iontophorese werden. Bitte beachten Sie, dass der niedrige pH-Wert in der Lösung auf den extrazellulären Raum ausgestoßen könnte bewirken GABA Getriebe selbst ^16,17.
   Schützen Sie das GABA-Lösung vor Licht und häufig frisch zubereiten GABA Stammlösung, da ältere Lösung seine Wirksamkeit verlieren kann.
6. Wenn es schwierig ist, GABAergic Veranstaltungen, ein hallo sehengh Cl ^- treibende Kraft interne Lösung, beispielsweise durch Weglassen KCl, könnte dazu beitragen, die GABAerge Ereignisse visualisieren, um zu sehen, wenn die GABA Iontophorese arbeitet, jedoch zu synaptischen Integration untersuchen eine physiologische Antriebskraft empfohlen werden könnte. Für allgemeine Erfassung von kleinen GABAergic Veranstaltungen kann ein Protokoll in 8C gezeigt helfen.

3. Ziehen Sie und testen Sie die Iontophorese Pipetten

1. In der Regel ziehen die richtigen Pipetten ist vielleicht der wichtigste Schritt, um eine kontrollierte Neurotransmitter Iontophorese erreichen. Bei der Verwendung von Iontophorese in der Zellkultur, ist es möglich, sehr feine Elektroden ähnlich scharfen Mikroelektroden ¹⁰ ziehen. In patch-clamp Experimente in akuten Scheiben jedoch äußerst dünnen Pipetten auf der Scheibenoberfläche biegen, wenn sie in das Gewebe mit einem Winkel abgesenkt werden, wodurch es unmöglich tiefer Dendriten zu erreichen.
2. Daher ziehen eine Pipette mit einem sehr kleinen Spitze, so dass kein neurotransmitter austreten kann, aber die Spitze hat noch steif genug sein, um in das Gewebe (Abbildung 2) zu durchdringen. Verwenden Sie zum Beispiel 150 GB F 8P Klasse Pipetten (Science Products, Hofheim, Deutschland) und einen horizontalen Puller (zum Beispiel ein DMZ-Universal-Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Deutschland, oder ein P-97 Abzieher, Sutter Instrument Company , Novato, CA) mit mehreren Ziehen Schritte, um eine kleine Öffnung, aber auch eine kurze Tapper mit einem steilen Winkel (Abbildung 2 und Tabelle 2) zu erreichen.
3. Es ist auch möglich, Quarzglas Pipetten verwenden zu ziehen iontophoretischen Pipetten ^10. Diese sollen eine bessere mechanische Eigenschaften aufweisen und zuverlässiger zu sein, aber spezielle Laser-Abzieher sind erforderlich. Es ist aber auch möglich, gute Ergebnisse beim Glaspipette, die in der Regel zum Ziehen Patch-Pipetten verwendet erzielen.
4. Testen Sie die Pipette Leistung und Widerstand in einer Kammer ohne Gewebe, bevor Sie sie zum erstenZeit konnte seit Auslaufen von Glutamat schadet dem Gewebe.
5. Richten Sie die Iontophorese Verstärker richtig. Dann füllen Sie die Pipette mit dem Neurotransmitter und Farbstoff enthaltenden Lösung und legen Sie sie in das Bad (ACSF).
6. Kompensieren Sie die Kapazität (Abbildung 3). In der Regel sehr scharf Pipetten haben eine höhere Kapazität als diejenigen stumpf.
7. Überprüfen Sie den Widerstand der Pipette: Der Mikro-Iontophorese Verstärker verwendet hier eine build-in Funktion für die Messung der Pipette Widerstand. Es erinnert an kurzen rechteckigen Testpulse, die mit einem Standard-Oszilloskop oder einem A / D-Karte mit einem Computer verbunden mit dem Erwerb Software überwacht werden kann. Abhängig von der Form und Größe der Spitze, sollte die Spitze einen Widerstand zwischen 25 bis 90 MOhm.
8. Fokus auf die Spitze mit einem 60X oder 40X Wasserimmersionsobjektiv und Schalter auf Fluoreszenz-Bildgebung und, wenn möglich, zu vergrößern in. Wenn Fluoreszenzfarbstoff Lecks aus der Pipettenspitze, eine kleine positive (im Falle von gluTamate) oder negativ (im Falle von GABA, Abbildung 4) behalten Strom (<0,02 uA). Wenn das nicht hilft, um die Leckage stornieren, ändern Sie die Pipette.
9. Tragen Sie einen starken Schritt aktuellen oder verwenden Sie die manuelle Auslösung und Überwachung der Spitze in der fluoreszierenden Bild zu sehen, ob die Lösung aus der Pipette ausgestoßen werden. Wie oben erwähnt, wird die Polarität des Stromimpulses von der Ladung des Moleküls, die angeblich ausgeworfen wird abhängig. Um Glutamat auszuwerfen ist es ein negativer Strom und für GABA ein positiver Strom (Abbildung 4).
10. Luftblasen in der Pipette, die Block Ausstoß von Farbstoff und Sender, durch Anlegen einer hohen Ausstoß aktuellen mehrmals gelöscht werden.
11. Zusammen genommen, wenn es keine sichtbare Leckage und Test Auswurf erfolgreich war, kompensieren die Kapazität und starten das Experiment.
12. Achtung: Seit Kapazität Entschädigung durch eine Feedback-Schaltung erreicht wird, kann diese Schaltung Überschreitung oder schwingen, wenn es overcomp istensated. Vorsichtig mit dem Rad zur Einstellung Kapazität Entschädigung.
13. Abhängig von der Abzieher Stabilität ist es manchmal notwendig, um die Einstellungen Abzieher von Zeit zu Zeit anpassen, da das Filament Eigenschaften verändert haben. Wenn jedoch einmal eine gute Pipette ausgebildet ist, kann es für einige Tage verwendet werden. Deshalb wird nach Fertigstellung das Experiment speichern die iontophoretisches Pipette in einem geschlossenen Behälter, ohne die Spitze.
14. Für das nächste Experiment füllen Sie die Pipette mit dem Neurotransmitter Lösung gelten mehrere starke Impulse Auswurftaste, um die Spitze zu löschen und dann prüfen, ob die Eigenschaften (z. B. Widerstand) wesentlich ändern. Dann kompensieren die Kapazität und mit der Pipette wieder. Verwenden Sie nicht eine einzelne Pipette mit unterschiedlichen Neurotransmitter-Lösungen.

4. Bereiten Sie die Rätsel Slices

1. Wenn Mikro-Iontophorese zum ersten Mal verwendet wird, auf jeden Fall bereiten die Scheiben nach dem Aufbau einer zuverlässig arbeitenden Puller Programm.
2. Perform Anästhesie und Enthauptung Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege Ihrer Institution oder Lokalbehörde.
3. Nach der Entfernung des Gehirns, dann in eiskalte ACSF _Saccharose (siehe Protokoll 2.1).
4. Schneiden Sie die Region von Interesse in Scheiben entsprechender Dicke (z. B. 300 um).
5. Inkubieren der Scheiben in ACSF _Saccharose bei 35 ° C für 30 min. Anschließend Übertragung auf einen untergetauchten Haltekammer mit normaler ACSF bei Raumtemperatur.
6. Während der Vorbereitung und Experiment carbogenize die ACSF rund um die Scheiben mit 95% O _2, 5% CO _2.

5. Stellen Sie eine Whole-cell Recording

1. Positionieren Sie die Pipette Iontophorese (s) bereits in der Nähe der Scheibe Oberfläche vor dem Patchen einer Zelle, um dauerhafte Positionierung zu vermeiden, nach Gründung der whole-cell-Modus.
2. Ziehen Sie einen niedrigen Widerstand Patch-Pipette (3 - 5 mOhm), füllen Sie es mit der dye enthält interne Lösung und gelten positiven Druck auf die Pipette (30 - 60 mbar).
3. Geben Sie das Bad und den Ansatz der Zelle unter visuelle Führung (Infrarot Dodt Kontrast oder Zwei-Photonen-Gradienten kontrastreiches Bild).
4. Überwachen Sie die Pipette Widerstand mit einem Test-Impuls (zB -10 mV, 20 ms) in Voltage-Clamp-Modus. Beim Berühren des Gewebes korrigieren Sie die Offset-Spannung.
5. Nähern Sie die Zelle, und schieben Sie die Pipettenspitze in es, bis ein "Grübchen" ist deutlich zu erkennen. Sofort den Druck der Pipette, gelten 40 - 60 mbar Unterdruck und schalten Sie das Membranpotential auf -65 mV.
6. Wenn die Haltestromwert Werte unter 100 pA erreicht, lassen Sie die Unterdruck.
7. Nach dem Aufbau einer giga Dichtung (Widerstand> 1 G), Bruch der Membran mit einem kurzen, starken Sog auf die Pipette oder kurze Überkompensation der Kapazität Entschädigung Schaltung.
8. Je nachdem, welcher Modus (Spannung oder Strom Klemme) ist erforderlichfür die experimentelle Design, angemessen zu kompensieren.
9. Start, um den iontophoretisches Pipette in seine endgültige Position zu bringen. Wenn eine genauere Beschreibung, wie man erfolgreich durchführen Patch-Clamp-Aufnahmen benötigt wird, gibt es mehrere ausgezeichnete Leitlinien verfügbar ^18,19.

6. Legen Sie die Pipette und Iontophoretische generieren Postsynaptische Iontophoretische Potential

1. Im Allgemeinen kann iontophoretischen Ereignissen an definierten Stellen in Abhängigkeit von der gewünschten Experiment zum Beispiel bei einer spiny Dendriten Glutamat Mikro-Iontophorese, bei der dendritischen Welle Soma oder Axon Anfangsstück für GABA Mikro-Iontophorese hervorgerufen werden.
2. Nähern Sie die Zelle bis zu etwa 1 um Distanz, ohne es zu berühren. Nach Erreichen der Position von Interesse ist es entscheidend, dass keine Neurotransmitter ausläuft und daß die Pipette Kapazität vollständig kompensiert.
3. Wenn Annäherung der Zelle mit einem Glutamat gefüllt iontophoretischen pipette bewirkt nachweisbar Depolarisation des Membranpotentials, passen Sie die behalten, wenn möglich, Strom, oder ändern Sie die Pipette.
4. Bewerben kurzen negativen Stromimpulse, beginnend bei Null und erhöhen die aktuelle systematisch (z. B. von 0,1 bis 0,4 ms, 0,01 bis 1 uA Impulse). Dies hilft, um herauszufinden, in welchem ​​Bereich die aktuellen iontophoretisches die gewünschten Antworten evoziert in der spezifischen experimentellen Aufbaus.
5. Wenn es keine Reaktion nachweisbar, heben Sie die Pipette mehreren hundert Mikrometern und wenden Sie einen starken Auswurf Strom (> 0,1 uA), um die Spitze zu reinigen. Stellen Sie die Kapazität Entschädigung, nähern sich die Zelle, und versuchen Sie es erneut.
6. Wenn es immer noch keine Antwort, reduzieren Sie die aktuelle behalten. Seien Sie sehr vorsichtig mit den DFÜ-Einstellungen da dieses Verfahren unkontrollierte Freisetzung von Neurotransmittern führen kann. Daher überwachen ständig die Aufnahme zu den jeweiligen Änderungen des Membranpotentials zu erkennen.
7. Wenn es schwierig, GABAergic Ereignisse zu erkennen ist, kann es hilfreich sein, eine Verwendungn interne Lösung Zusammensetzung was in einem hohen Cl ^- treibende Kraft. Um dies zu erreichen, reduzieren Sie die Cl ^- Konzentration in der Pipette Lösung (siehe Abschnitt 2.6-Protokoll.). Dies wird in größeren GABAergic Ereignissen an Ruhemembranpotenzial aufgrund einer höheren treibende Kraft führen.
8. Alternativ injizieren lange Stromstufen was Membranpotential von -100 mV Chancen auf -48 mV (8C). Mit diesem Protokoll die Cl ^- treibende Kraft bei hyperpolarisierte Potentiale verursacht einen depolarisierenden GABA Reaktion erhöht.
9. Es ist auch möglich, den Schritt Strominjektion Protokoll verwenden, um die Umkehrung des evozierten Potentials Ereignisse, die die GABA-erge Art der Ereignisse zu bestimmen hilft zu bestimmen. Austritt von GABA ist schwerer zu erkennen als Leckage von Glutamat. In diesem Fall kann eine ständige Überwachung der Eingangswiderstand helfen, wenn die GABA Pipettenspitze nähert. Wenn der Eingang Widerstand abnimmt, nimmt die aktuelle behalten kann be erhöht oder eine andere Pipette verwendet werden.
10. Als Kontrolle Experimente für Glutamat Iontophorese, empfehlen wir einen Ca ^{2 +-Imaging} Experiment mit 200 uM OGB-1 und keine EGTA in der Pipette Lösung für lokale Calciumeinstrom visualisieren, die möglicherweise durch auslaufende Glutamat verursacht werden.
11. In der Regel, um eine stabile Reaktion zu erzielen, ist es sehr wichtig, eine mechanisch stabile Pipette Drift mit der Zeit zu vermeiden. Drift kann durch Temperaturschwankungen verursacht werden, daher empfiehlt es sich, auf dem Gerät mindestens eine halbe Stunde wechseln, bevor die Messungen thermische Drift zu vermeiden. Achten Sie darauf, gute Dichtungen der Kartusche in die Pipette Halter verwenden und die Spitze ist wirklich fixiert. Der Halter selbst kann zusätzlich mit Teflon-Band befestigt werden, außerdem sicher sein, dass es keine Spannungen an den Kabeln aus dem headstage oder Manipulator, der auch eine potenzielle Quelle der Drift.

Ergebnisse

Ein einfacher Ansatz, um die räumliche Ausdehnung der Iontophorese zu bestimmen ist, um den iontophoretischen Pipette schrittweise von Dendriten zurückzuziehen, während die ausgeworfene Glutamat konstant. Wir fanden, dass die räumliche Ausdehnung eines Mikro-iontophoretischen Stimulation einen Durchmesser von etwa 12 um (Fig. 1, Radius) hat. Wie tief in das Gewebe der Iontophorese verwendet werden kann, hängt von der Steifigkeit der Pipette. Doch die iontophoretisches Pipetten für Experimente in S...

Diskussion

Hier erklären wir, wie man schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern gelten synaptischen Integration auf Dendriten zu untersuchen. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um glutamatergen und GABAergen synaptischen Übertragung in verschiedenen Hirnregionen in vitro und in vivo zu untersuchen ^9,20-22. Micro-Iontophorese ist seit mehr als 60 Jahren verwendet worden, aber in den frühen Jahren war es meist verwendet, um entweder lokal gelten Neurotransmittern und Drogen bei langsam...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV	Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser	Chameleon Ultra II, Coherent
60X Objective, NA 0.9	Olympus
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope	TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany
Monochromator	TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany
Micro-iontophoresis system MVCS-02	NPI Electronics, Tamm, Germany
Sutter puller P-97	Sutter Instrument Company, Novato, CA
Glass filaments (150 GB F 8P)	Science Products, Hofheim, Germany
			Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide	Molecular Probes life technologies	A-10436
Alexa Fluor 594	Molecular Probes life technologies	A-10438
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6297
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
CaCl2	Sigma Aldrich	C5080
MgCl2	Sigma Aldrich	M2670
Glucose	Sigma Aldrich	G7528
K-Gluconate	Sigma Aldrich	G4500
HEPES-acid	Sigma Aldrich	H4034
Phosphocreatin	Sigma Aldrich	P7936
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Glutamic acid	Sigma Aldrich	G8415
GABA	Sigma Aldrich	A5835
NaOH	Merck	1.09137.1000
HCl	Merck	1.09108.1000