JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الفيروسات القهقرية داخلية المنشأ البشرية (هيرفي)، التي تحتل 8٪ من الجينوم البشري، في الحفاظ على قدرات الترميز النادرة ولكن مائة ألف يكرر محطة الطويلة (لترا). تم تصميم مخصص [أفمتريإكس] ميكروأري لتحديد الفرد التعبير هيرفي مكان، وكان يستخدم على الأنسجة سرطان البروستاتا كدليل على مفهوم للدراسات السريرية في المستقبل.

Abstract

مستضد البروستات محددة (PSA) هو التشخيص الرئيسي العلامات البيولوجية لسرطان البروستاتا في الاستخدام السريري، ولكنه يفتقر إلى الدقة والحساسية، وبخاصة في القيم جرعة منخفضة 1. "كيفية استخدام PSA 'يبقى العدد الحالي، إما للتشخيص كمنطقة رمادي المقابلة لتركيز في مصل الدم من 2،5 حتي 10 نانوغرام / مل الذي لا يسمح تمايز واضح ليكون بين السرطان وnoncancer 2 أو متابعة المريض المتابعة عن تحليل PSA بعد الجراحة يمكن أن المعلمات الحركية تشكل تحديات كبيرة لتطبيقها العملي 3،4. بدلا من ذلك، غير المكودة الرنا (ncRNAs) آخذة في الظهور كما الجزيئات الرئيسية في سرطان الإنسان، مع احتمال أن تكون علامات الرواية اعتبارا من المرض، مثل سرطان البروستاتا PCA3 في 5،6 والكشف عن جوانب uncharacterized البيولوجيا الورم. علاوة على ذلك، أظهرت بيانات من مشروع ترميز نشرت في عام 2012 أن أنواع RNA مختلفة تغطي حوالي 62٪ من جنراللى بعد. ويبدو أيضا أن كمية الزخارف التنظيمية النسخي هو 4.5X على الأقل أعلى من واحد المقابلة لالإكسونات الترميز البروتين. وبالتالي، يكرر محطة الطويلة (لترا) من الفيروسات القهقرية داخلية المنشأ البشرية (HERVs) تشكل مجموعة واسعة من المفترضة / مرشح متواليات التنظيمية النسخي، كما هو وظيفتها الأساسية في الفيروسات القهقرية المعدية. HERVs، والتي تنتشر في جميع أنحاء الجينوم البشري، تنشأ من الالتهابات الأجداد ومستقلة داخل الخط الجرثومية، تليها عمليات نشر النسخ واللصق ويؤدي إلى multicopy أسر الاحتلال 8٪ من الجينوم البشري (لاحظ أن تمتد الإكسونات 2٪ من الجينوم لدينا ). بعض مواضع هيرفي يزال التعبير عن البروتينات التي ارتبطت مع العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان 7-10. لقد قمنا بتصميم ميكروأري عالية الكثافة، في شكل [أفمتريإكس]، والتي تهدف إلى تميز الفرد على النحو الأمثل التعبير هيرفي مواضع، من أجل فهم أفضل لما إذا كان يمكن أن تكون نشطة، وإذا كانت قيادة ncRNA النسخ أو مodulate الترميز التعبير الجيني. وقد تم تطبيق هذه الأداة في مجال سرطان البروستاتا (الشكل 1).

Introduction

وتنتشر الفيروسات القهقرية داخلية المنشأ الإنسان (وتسمى أيضا HERVs) في جميع أنحاء الجينوم لدينا. أنها تنشأ من الالتهابات الأجداد ومستقلة داخل الخط الجرثومية، تليها عمليات نشر النسخ واللصق ويؤدي إلى الأسر multicopy. اليوم، فإنها ليست أكثر المعدية ولكنها تحتل 8٪ من الجينوم البشري؛ كنقطة المقارنة، الإكسونات تمتد 2٪ من الجينوم البشري. وأظهرت بيانات من مشروع ترميز نشرت في عام 2012 أن أنواع RNA مختلفة تغطي حوالي 62٪ من الجينوم، بما في ذلك الثلث في المناطق بين الجينات. وعلاوة على ذلك، يبدو أن كمية الزخارف التنظيمية النسخي هو 4.5X على الأقل أعلى من واحد المقابلة لالإكسونات الترميز البروتين. يكرر HERVs محطة الطويلة (LTR) تمثل مجموعة واسعة من العناصر التنظيمية النسخي المحتملة، كما هو وظيفتها المعتادة في الفيروسات القهقرية المعدية. تاريخيا، باستثناء عدد قليل من مواضع أعرب في المشيمة أو الخصية، وكان يعتقد عموما أن هيرفي صامتون بسبب الجيش الشعبيتنظيم igenetic. لذلك، قمنا بتصميم ميكروأري عالية الكثافة، في شكل [أفمتريإكس]، والتي تهدف إلى تميز الفرد على النحو الأمثل التعبير هيرفي مواضع، من أجل فهم أفضل سواء كانت نشطة، وإذا كانت قيادة lncRNA النسخ أو تعدل الترميز التعبير الجيني. هذه الأداة يطلق عليها اسم هيرفي-V2 GeneChip يدمج 23583 probesets هيرفي ويمكن تمييز عناصر 5،573 هيرفي متميزة تتألف من ترا منفردا وكذلك proviruses الكاملة والجزئية (الشكل 2).

التشخيص، والتقييم، والخطة:

ويستند تشخيص سرطان البروستاتا على جرعة من مستضد البروستات المعين (بي إس) العلامات البيولوجية في المختبرات السريرية، وفحص المستقيم الرقمية لتقييم التعديلات الشكلية البروستاتا وأخيرا خزعات البروستاتا لوحظ من قبل الطبيب الشرعي. عدم وجود خصوصية وحساسية كافية بين المؤشرات الحيوية سرطان التقليدية، مثل دعم البرامج والإدارة للكشف عن سرطان البروستاتا، فقد تم الاعتراف على نطاق واسع بالعربيةثالثا عدة عقود من الآثار السريرية 1. في البداية، اقترح PSA لتشخيص وعلاج غدية في البروستاتا 11. كان الأخير المقترحة لفحص سرطان ورصد تطور هذا المرض 12. ومع ذلك، لا يزال هناك السؤال الذي يطرح بانتظام: 'كيفية استخدام PSA'. (ط) المنطقة الرمادية المقابلة لتركيز في مصل الدم من 2،5 حتي 10 نانوغرام / مل لا تسمح لفرق واضح إلى أن يتم بين السرطان وnoncancer 2، (ب) دراستين فوج كبير الالتحاق مئات الآلاف من الناس في أوروبا و الولايات المتحدة الأمريكية فشلت في التوصل إلى استنتاج واضح حول جدوى الفحص من حيث الوفيات الناجمة عن مرض معين 13،14، (ج) تحليل PSA المعلمات الحركية بعد الجراحة مثل إزالة PSA، PSA السرعة ومضاعفة الوقت، على الرغم بسيطة من الناحية النظرية، يمكن أن تشكل تحديات كبيرة في عملية 3،4 التطبيق. ونحن قد نتوقع أن في السنوات المقبلة، العلامات البيولوجية التطبيقسوف lications دعم خيار السريرية بين الانتظار الساهرة وأكثر أو أقل عدوانية العلاجات اعتمادا على النمط الظاهري الورم. بشأن التشخيص المقدمة من قبل الطبيب الشرعي، وهو عامل يحد من أول يأتي من 20٪ التشخيص سلبية كاذبة في خزعات البروستاتا (وغاب عن العديد من أنواع السرطان بأخذ عينات). ومصدر القلق الثاني يتعامل مع الحاجة لإجراء خزعة الإضافية التالية واحد سلبي، والتي قد تعرض آثار ضارة.

استئصال البروستاتا تعد حاليا واحدة من العلاجات القياسية لسرطان البروستاتا. يقترح في المرضى الأصحاء، والشيخوخة 45-65 سنة، لا سيما في حالة أنماط عدوانية (جليسون 7-10)، الورم متعدد البؤر أو ورم واضح. يتم ذلك الآن في قسمنا استخدام الجراحة الروبوتية بمساعدة. بسبب أدلة متزايدة على أن الواسمات الجزيئية سيكون لها أهمية قصوى في السنوات المقبلة، قررنا أن يقترح على جميع مرضانا إمكانية المشاركة في برنامج لالبروستاتاالمصرفية الأنسجة. بتعبير أدق، أدت برامج البحوث الجزيئية التوسع في سرطان البروستاتا في مطلب زيادة للوصول إلى جودة عالية أنسجة الورم الطازجة من العينات استئصال البروستاتا. هذا البحث، ولا سيما النهج الجيني، مطلوب عينات واسعة من نوعية عالية DNA / RNA. وهناك حاجة إلى الورم و 'غير الورم' الأنسجة المجاورة من نفس المريض. وقد صممت للتعامل مع توصيات ومعالجة جراحات استئصال البروستاتا للحفاظ على ميزات المرضية التي تحدد المرحلة والوضع الهامش ومزيد من العلاج والتشخيص وبالتالي المحتملة. أي طريقة جديدة أخذ عينات الأنسجة، وبالتالي، لا ينبغي التنازل التقييمات المرضية اللاحقة من أجل أن تكون مقبولة من التشخيص. تشريح العيانية البروستات أمر صعب ويحتاج إلى عناية كبيرة لدفعها إلى الهامش والأنسجة غزو المحفظة: ينبغي إجراء أي تشريح للأعمال المصرفية البروستاتا دائما من قبل المدربين uropathologist وفقا لتوافقد البروتوكول. لجنة أخلاقيات كلية الطب والمجلس الطبي الدولة وافق على هذه التحقيقات وأبلغت تم الحصول على الموافقة لجميع المرضى المدرجة في أنسجة البروستاتا المصرفي.

Protocol

1. عملية جراحية

إزالة مرة واحدة من قبل الجراح، والحفاظ على البروستاتا على الجليد حتى تؤخذ في تهمة من قبل الطبيب الشرعي.

2. التعامل مع الأنسجة البروستاتا

  1. احترام تأخير نقص التروية المحيطة بالجراحة، ونقل العينات استئصال البروستاتا على الجليد إلى المختبر من قبل الموظفين المتفانين في غضون 30 دقيقة بعد الاستئصال الجراحي. تأخر تجميد ينبغي أن يكون أقل من 20-30 دقيقة (الشكل 3A).
  2. وزن وصمة عار على البروستاتا وفقا للبروتوكول المعتاد (مثلا الأخضر على الجانب الأيمن والأسود على الجانب الأيسر، انظر أرقام 3B و 3C).
  3. تنفيذ المقطع العرضي كبير من الغدة على الجانب الخلفي (الشكل 3D). توجيه البروستاتا ووضعها على الجانب الأمامي. تنفيذ المقطع العرضي كبير من الغدة على الجانب الخلفي بسكين جراحية معقمة.
  4. تشريح قطعة من النسيج على المنطقة تمر بمرحلة انتقالية،على المناطق الطرفية اليسار واليمين، وترك هوامش سليمة (الشكل 3E).
  5. وضع النوى من الأنسجة في أنبوب إيبندورف، والمفاجئة تجميد وتخزينها في النيتروجين السائل (الشكل 3F). إذا كنت لا يجعل البنك الحيوي الانتقال مباشرة إلى الخطوة 2.7.
  6. بأداء الخدمات المصرفية البروستاتا فقط إذا كان إجمالي طول سرطان في الخزعات متفوقة على 10 مم. استخدام خيط خياطة لإغلاق البروستاتا ومنع تشويه الغدة والحد الأدنى من تعطيل هامش الجراحية (الشكل 3G). ثم إصلاح العينة استئصال البروستاتا مع الفورمالين وتضمين في البارافين وفقا للإجراءات المعتادة للتحليل النسيجي.
  7. جبل النوى الأنسجة المجمدة عموديا على كومة صغيرة من أكتوبر وجعل المقاطع في ناظم البرد. تأخذ أول واحد 5 ميكرومتر القسم المجمدة وصمة عار مع طولويدين الأزرق.
  8. إجراء الفحص النسيجي سريعة لتحليل طبيعة الأنسجة (أي. حميدة أو خبيثة). لالورمالأنسجة، وتقدير كمية خلايا الورم وتحديد النوى فقط مع أكثر من 80٪ من خلايا الورم.
  9. وفي أعقاب ذلك، إجراء واحد 5 ميكرومتر القسم المجمدة الجديدة وصمة عار مع الهيماتوكسيلين، يوزين وسافران. ثم، وقطع 15 × 30 ميكرومتر المقاطع ووضعها في أنبوب إيبندورف ريبونوكلياز الحرة.
  10. تأخذ مشاركة 5 ميكرون القسم المجمدة لالهيماتوكسيلين، يوزين وسافران وصمة عار على السيطرة على كمية من الخلايا الورم في نهاية الإجراء.
  11. وضع أنبوب إيبندورف في الثلج الجاف وإرسال العينة إلى مختبر البيولوجيا الجزيئية.

3. استخراج الحمض النووي الريبي، تنقية، ومراقبة الجودة

  1. التجانس. أداء التجانس في وجود من 1 مل من Trizol/100 الأنسجة ملغ حتى يذوب تماما في الأنسجة الحل. إضافة Trizol الحل تدريجيا والمضي قدما في الرعاية على الجليد باستخدام طاحونة باليد. مرة واحدة متجانسة، قسامة الحل لأنابيب إيبندورف وترك في Trizol في درجة حرارة الغرفة لخمس دقائق.
  2. مرحلة الانفصال. إضافة 300 ميكرولتر كلوروفورم (أو 150 مل ميكرولتر BCP/1.5 Trizol). دوامة 15 ثانية ثم ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية.
  3. هطول الحمض النووي الريبي. نقل بعناية المرحلة المائية أعلى إلى أنبوب جديد. إضافة 750 ميكرولتر الأيزوبروبانول. احتضان عند RT لمدة 10 دقيقة (تستنهض الهمم بواسطة انقلاب). احتضان 2 ساعة عند درجة -19 درجة مئوية C/-31 عينات الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 2-8 درجة مئوية.
  4. غسل الحمض النووي الريبي وتعليق. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف. غسل الحمض النووي الريبي بيليه مع 1 مل 80٪ ETOH (عكس بلطف الأنابيب). عينات الطرد المركزي في 7،500 x ج لمدة 10 دقيقة في 2-8 درجة مئوية. إزالة طاف باستخدام P1000 وP10. تسمح المتبقية ETOH إلى الهواء الجاف لمدة 2-3 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية المياه، وأنابيب نقل إلى 70 درجة مئوية كتلة الحرارة وترك الجلوس لمدة 2-3 دقيقة إلى حل بيليه. ثم وضعت على الجليد. المحل في -19 درجة التخزين C/-31 درجة مئوية لمدة قصيرة الأجل و-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  5. تنقية الحمض النووي الريبي. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام عدة RNeasy البسيطة (في Qiagen). لفترة وجيزة، تبدأ بإضافة 350 ميكرولتر العازلة RLT إلى عينة الحمض النووي الريبي 100 ميكرولتر وتخلط جيدا، ثم اتبع الإجراء في Qiagen. أخيرا، واتخاذ ميكرولتر 3 (من أصل 50 ميكرولتر) قسامة من المنتج المنقى لمراقبة الجودة (الخطوة 3.6). متجر الحمض النووي الريبي في -19 ° C/-31 درجة مئوية لفترة قصيرة أو في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
  6. RNA QC (الشكل 4A). التحقق من جودة وسلامة الحمض النووي الريبي RNA باستخدام Bioanalyzer (اجيلنت) ومعمل NanoDrop (الحرارية)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. النزاهة عدد الحمض النووي الريبي (رين) ويستخدم لتقييم نوعية الحمض النووي الريبي. على وجه الخصوص، تنجح في الكشف عن 18S 28S والقمم فمن المستحسن بشدة لاستخدام العينات في اتخاذ مزيد من الخطوات.

4. WT-RNA إحتفاء التضخيم

توصيات لتنفيذ الخطوات التضخيم باستخدام WT-OVأوجه عدة التضخيم في الظروف المثلى:

  • تشغيل ما لا يقل عن ثماني عينات التضخيم في وقت لضمان الدقة pipetting ل. ثم، تمثل 1 حجم النفايات عند إعداد الخلائط الرئيسية التي تتطلب تقسيم هذه المجموعة إلى 3 دفعات من 8 ردود الفعل.
  • دائما الكواشف المذوبة وأنابيب رد الفعل على الجليد ما لم يتقرر غير ذلك.
  • تستخدم سوى 80٪ من محلول الإيثانول جديدة لتنقية.
  • لا تتوقف في أي مرحلة من البروتوكول.

  1. تمييع الحمض النووي الريبي مجموع للحصول على تركيز 25 نانوغرام / ميكرولتر. معالجة 2 ميكرولتر من العينة المخففة.
  2. إعداد بولي A RNA ارتفاع في التحكم في حل عن طريق التخفيف من المسلسل بولي-A RNA الأسهم مع بولي A تحكم التخفيف العازلة ([أفمتريإكس])، لتحقيق 1:25،000 التخفيف.

    الخطوة 1: أولا ستراند التجميعي [كدنا] 4،3-4،8. ويشار الكواشف المذكورة من قبل المورد على النحو التالي: A1 (ستراند الأولى التمهيدي ميكس)، A2 (فايRST الاحتياطي ستراند ميكس)، A3 (ستراند الأولى أنزيم ميكس).

  3. ذوبان الجليد A1 و A2 في درجة حرارة الغرفة. مزيج باستخدام خلاط دوامة لمدة 2 ثانية وتدور لمدة 2 ثانية. ثم، وضع بسرعة على الجليد. وضع A3 على الجليد.
  4. وضع 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع (50 نانوغرام) في 0.2 مل أنبوب PCR وإضافة 2 ميكرولتر من A1 (الحجم النهائي: 4 ميكرولتر). غطاء وتدور الأنبوب لمدة 2 ثانية.
  5. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم وضع أنبوب على الجليد.
  6. إعداد أول ستراند [كدنا] ميكس ماجستير كما يلي (نظرا لرد فعل واحد). مزيج من قبل pipetting وتدور باستمرار لفترة وجيزة ميكس ماجستير. على الفور، ووضع على الجليد.
    كاشف حجم
    أول الاحتياطي ستراند ميكس (A2) 5 ميكرولتر
    بولي-A مراقبة الحمض النووي الريبي (1:25،000) 0.5 ميكرولتر
    أول ستراند أنزيم ميكس (A3) 0.5 ميكرولتر
  7. إضافة 6 & #181، ل من مزيج ماجستير في الحمض النووي الريبي / أنبوب يحتوي التمهيدي. مزيج عبها الأنبوب، وتدور لمدة 2 ثانية وبسرعة وضع على الجليد (الحجم النهائي: 10 ميكرولتر).
  8. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 42 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تبقي باردة عند 4 درجات مئوية. إزالة أنبوب رد فعل من cycler الحرارية، وتدور لفترة وجيزة والحفاظ على الجليد. تواصل مباشرة مع الخطوة الثانية ستراند التجميعي [كدنا].

    الخطوة 2: الثانية ستراند التجميعي [كدنا] 4،8-4،12. ويشار الكواشف المذكورة من قبل المورد على النحو التالي: B1 (الثانية الاحتياطي ستراند ميكس) و B2 (الثانية ستراند أنزيم ميكس).

  9. تدور باستمرار B2 و B3 لمدة 2 ثانية وبسرعة وضع على الجليد. ذوبان الجليد B1 في درجة حرارة الغرفة. مزيج باستخدام خلاط دوامة لمدة 2 ثانية، وتدور لمدة 2 ثانية وبسرعة وضع على الجليد.
  10. إعداد الثانية ستراند ميكس ماجستير كما يلي (نظرا لردة فعل واحد). مزيج من قبل pipetting وتدور باستمرار بري ميكس ماجستيريطير. على الفور، ووضع على الجليد.
    كاشف حجم
    الثانية الاحتياطي ستراند ميكس (B1) 9.75 ميكرولتر
    الثاني ستراند أنزيم ميكس (B2) 0.25 ميكرولتر
  11. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب التفاعل ستراند الأولى. مزيج من قبل pipetting 3X، وتدور لمدة 2 ثانية ومكان على الجليد (الحجم النهائي: 20 ميكرولتر).
  12. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبقي باردة عند 4 درجات مئوية. إزالة أنبوب رد فعل من cycler الحرارية، وتدور لفترة وجيزة والحفاظ على الجليد. تواصل مباشرة مع الخطوة الثانية بعد تعزيز ستراند.

    الخطوة 3: بعد الثانية تعزيز ستراند 4،13-4،15. ويشار الكواشف المذكورة من قبل المورد على النحو التالي: B1 (الثانية الاحتياطي ستراند ميكس)، B3 (رد الفعل تعزيز أنزيم ميكس).

  13. إعداد ميكس ماستر من خلال الجمع بين B1 و B3 ميكس النحو التالي (نظرا لرد فعل واحد). مزيج من قبل pipetting وتدور باستمرار لفترة وجيزة ميكس ماجستير. على الفور، ووضع على الجليد.
    كاشف حجم
    الثانية الاحتياطي ستراند ميكس (B1) 1.9 ميكرولتر
    رد فعل تعزيز إنزيم مكس (B3) 0.1 ميكرولتر
  14. إضافة 2 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب التفاعل ستراند الثانية. مزيج من قبل pipetting 3X، وتدور لمدة 2 ثانية ومكان على الجليد (الحجم النهائي: 22 ميكرولتر).
  15. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تبقي باردة عند 4 درجات مئوية. إزالة أنبوب رد فعل من cycler الحرارية، وتدور لفترة وجيزة ووضع على الجليد. تواصل مباشرة مع الخطوة SPIA التضخيم.

    الخطوة 4: واحدة حبلا [كدنا] (sscDNA) تجميعي من الإجراء SPIA من 4.16 -4.19. ويشار الكواشف المذكورة من قبل المورد على النحو التالي: C1 (SPIA التمهيدي ميكس)، C2 (SPIA العازلة ميكس)، C3 (SPIA أنزيم ميكس).

  16. ذوبان الجليد في C1 و C2 في درجة حرارة الغرفة. مزيج باستخدام دوامة خلاط، وتدور لمدة 2 ثانية وبسرعة وضع على الجليد. ذوبان الجليد C3 على الجليد. مزيج من المحتوى عن طريق عكس بلطف 5X. تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء. ثم، وتدور لمدة 2 ثانية ومكان على الجليد.
  17. إعداد ميكس SPIA ماجستير، وهو ما يمثل حجم 0.5 النفايات، على النحو التالي. مزيج من قبل pipetting وتدور باستمرار لفترة وجيزة ميكس ماجستير. على الفور، ووضع على الجليد.
    كاشف حجم
    SPIA-الواق ميكس (C2) 5 ميكرولتر
    SPIA-التمهيدي ميكس (C1) 5 ميكرولتر
    SPIA-أنزيم ميكس (C3) 10 ميكرولتر
  18. إضافة 20 ميكرولتر من SPIA ميكس ماجستير لتعزيز ستراند الثانية رد الفعل ريوب. مزيج من قبل pipetting 6 8X، وتدور بسرعة ووضع على الجليد (الحجم النهائي: 42 ميكرولتر).
  19. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 47 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبقي باردة عند 4 درجات مئوية. إزالة أنبوب من cycler الحرارية، وتدور لفترة وجيزة ووضع على الجليد.

5. sscDNA تنقية ومراقبة الجودة

  1. sscDNA تنقية. تنقية sscDNA استخدام عدة تنقية QIAquik PCR (في Qiagen). لفترة وجيزة، تبدأ بإضافة 200 ميكرولتر العازلة PB إلى 42 ميكرولتر من الناتج [كدنا] تضخيم وخلط والحمل على العمود. ثم اتبع الإجراء في Qiagen. أخيرا، واتخاذ ميكرولتر 3 (من أصل 30 ميكرولتر) قسامة من المنتج المنقى sscDNA لمراقبة الجودة (الخطوة 5.2).
  2. sscDNA تسفر عن والتحقق توزيع حجم (الشكل 4B). تحقق sscDNA العائد وحجم التوزيع باستخدام Bioanalyzer ومعمل NanoDrop، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حجم التوزيع من [كدنا] تضخيم يجب به تتألف عادة بين 100 و 1،500 قواعد طويلة مع ذروة حوالي 600 قواعد.

6. sscDNA تجزئة

  1. إعداد 2 ميكروغرام من [كدنا] في 30 ميكرولتر، وضبط حجم مع nuclease خالية من المياه.
  2. إعداد 1X واحدة استعارة-PLUS جميع العازلة (OPA)، بدءا من منطقة عازلة 10X OPA PLUS الحل.
  3. إعداد 0.2 U / ميكرولتر الدناز الأول (التخفيف 5 أضعاف من 1 U / ميكرولتر الدناز الأول).
  4. إعداد تجزئة ميكس ماجستير كما يلي (نظرا لرد فعل واحد):
    كاشف حجم
    10X واحدة استعارة-PLUS جميع العازلة 3.6 ميكرولتر
    الدناز الأول (0.2 U / ميكرولتر) 3 ميكرولتر
  5. إضافة 6.6 ميكرولتر من مزيج تجزئة إلى 30 ميكرولتر من sscDNA.
  6. تدور واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم إبطال نشاط الدناز أنا في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والحفاظ على الجليد. قسامة 1 &# 181؛ لتر من [كدنا] مجزأة للتحقق توزيع حجم استنادا اجيلنت.
  7. sscDNA التحقق توزيع حجم (الشكل 4C). تحقق توزيع حجم sscDNA باستخدام Bioanalyzer (اجيلنت). وينبغي عادة تتألف توزيع حجم كدنا] مجزأة بين 35 و 200 قاعدة.

7. وسم مجزأ sscDNA

  1. تمييع DLR-1A 7.5 ملم إلى 5 ملم في المياه DEPC.
  2. إعداد وصفها ميكس ماجستير كما يلي (نظرا لرد فعل واحد):
    كاشف حجم
    5X TDT رد فعل العازلة 14 ميكرولتر
    2 كوكلي (25 ملم) 14 ميكرولتر
    DLR-1A (5 ملم) 1 ميكرولتر
    ترانسفيراز الطرفي (400 U / ميكرولتر) 4.4 ميكرولتر
  3. إضافة 33.4 ميكرولتر من مزيج الوسملكل عينة [كدنا] مجزأة.
  4. مزيج عبها الأنبوب، وتدور لفترة وجيزة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، ثم الحفاظ على الجليد.

8. التهجين لميكروأري هيرفي رقاقة

  1. Prewet في GeneChip هيرفي مع 200 ميكرولتر من PreHybridization ميكس ([أفمتريإكس])، واحتضان عند 50 درجة مئوية، و 60 دورة في الدقيقة، لمدة 10 دقيقة.
  2. تحضير مزيج التهجين كما يلي (نظرا لرد فعل واحد):
    كاشف حجم
    السيطرة جزئية B2 (3nM) 3.3 ميكرولتر
    20x وحقيقية النواة تهجين تحكم 10 ميكرولتر
    2X التهجين ميكس 100 ميكرولتر
    99.9٪ DMSO 17.7 ميكرولتر
  3. إضافة 131 ميكرولتر من التهجين ميكس إلى 69 ميكرولتر من مجزأة والمسمى [كدنا] في درجة حرارة الغرفة لجعل فو النهائيلوم من 200 ميكرولتر.
  4. خلط وتفسد لمدة 2 دقيقة في 95 درجة مئوية، ثم احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 5 دقائق.
  5. إفراغ هيرفي GeneChip prewetted وتحميل إعداد الهدف 200 ميكرولتر. تطبيق البقع الصعبة، على الحاجز اثنين.
  6. هجن عند 50 درجة مئوية، و 60 دورة في الدقيقة، لمدة 18 ساعة.
  7. بعد 18 ساعة، إفراغ GeneChip هيرفي وتخزين الحل التهجين جمعها في 4 درجات مئوية. ملء مجموعة التحقيق مع 250 ميكرولتر غسل العازلة A. إذا لم يتم تشغيل رقائق فورا على FLUIDICS، وتخزينها في 4 درجات مئوية.

9. غسل وتلوين

  1. تشغيل FLUIDICS من شريط القوائم العالمي لرصد المناخ. في مربع الحوار FLUIDICS، حدد مركز الاهتمام (1-4)، ثم حدد Shutdown_450 لجميع وحدات، ثم تشغيل. تزج 3 FLUIDICS خطوط الطموح في المياه الملة، س. اتبع الإرشادات شاشة LCD.
  2. تطبيق برنامج Prime_450 لجميع وحدات. وضع أنابيب للغسل العازلة A فيزجاجة تحتوي على 400 مل الاحتياطي اغسل A، واحد لغسل B الاحتياطي في زجاجة تحتوي على 200 مل الاحتياطي اغسل B. ثم مرة أخرى، اتبع الإرشادات شاشة LCD.
  3. رفع الإبر ووضع 600 ميكرولتر صمة عار كوكتيل 1 (SAPE الحل ميكس) و 600 ميكرولتر صمة عار كوكتيل 2 (الضد الحل ميكس) التي تحتوي على أنابيب microcentrifuge في المواقف رقم 1 ورقم 2، و 800 مجموعة ميكرولتر عقد حل العازلة في موقف # 3 .
  4. تعيين الشريحة الحق في كل وحدة، حدد البروتوكول FS450-004 وتشغيل كل وحدة، بعد التعليمات التي تظهر على الشاشة.

10. مسح

  1. الاحماء الماسح الضوئي GS3000. انها مستعدة لمسح عندما يتحول الضوء الاخضر.
  2. تطبيق البقع الصعبة، على حواجز لتجنب تسرب ثم تحميل رقاقة في الملقم الآلي أو بدلا من ذلك مباشرة في الماسح الضوئي. بدء المسح الضوئي.
  3. بعد مسح الشريحة، ويتم إنشاء ملفات سل. التحقق من الصورة ومحاذاة الشبكة الى مكان الحادث لتحديد الخلايا التحقيق (<قوية> أرقام 4D-F).

11. تحليل البيانات

  1. مراقبة الجودة. الرجوع إلى معيار [أفمتريإكس] يسيطر للتحقق من أن رقائق هيرفي-V2 تلبية معايير مراقبة الجودة. لهذا الغرض تمثيل التالية يمكن استخدامها: توزيع قيمة كثافة سجل (المؤامرات والمؤامرات كثافة مربع)، الانحراف المطلق وسيطة (MAD) مقابل متوسط ​​كثافة (MAD ميد) المؤامرات، ومؤامرات الخلفية، وتطبيع الخطأ القياسي بلا مقياس (n استخدم) المؤامرات وسجل التعبير النسبية (RLE) المؤامرات.
  2. التطبيع. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي استكشاف مجموعة البيانات لتسليط الضوء على الآثار دفعة غير متوقعة وتصحيحها قبل التحليل الإحصائي. وهكذا يشمل تجهيزها البيانات تصحيح الخلفية (على سبيل المثال. بناء على التربتوفان التحقيق إشارة خط الأساس)، يليه الجيش الملكي المغربي وتطبيع تلخيص 15.
  3. استخراج البيانات والبحث عن الفرق الجينات. تطبيع رقائق وتطبيق clusteri الهرمينهج نانوغرام لاستكشاف مجموعة البيانات (الشكل 6A). ثم، إجراء بحث عن الجينات وأعرب تفاضلي (DEG) باستخدام التحليل الكلاسيكي كبير من ميكروأري (SAM) إجراء 16 تليها معدل اكتشاف كاذبة (روزفلت) التصحيح 17. لاحظ أن هذه الخطوات تتكامل تماما في بعض الأجنحة تحليل البرمجيات مثل Partek GS لكن يمكن بدلا من ذلك أن يقوم باستخدام البرامج الإحصائية R 18 مع حزم من المشروع Bioconductor 19. بعد التحليل الإحصائي، تحديد مجموعة البيانات لاستبعاد probesets القيم التي التعبير هي أقل من 2 6.
  4. التصور والتفسير. تفسير النتائج من ميكروأري هيرفي-V2 في واجهة مخصصة باستخدام قواعد البيانات الشرح.

النتائج

قيمة الدراسات transcriptomic يكمن أساسا في نوعية المواد البيولوجية ابتداء. إذا تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي في الظروف المثلى، والنزاهة عدد الحمض النووي الريبي (رين) هو عادة 7 أو أكبر (الشكل 4A). الحاجة لهجن 2 ميكروغرام من [كدنا] على رقاقة [أفمتريإكس] هيرفي-V2 يعني استخدام عملية التضخيم. خطوة ناجحة التضخيم يؤدي إلى توزيع على شكل جرس (الشكل 4B). ثم، يتم تنفيذ DNAse1 تجزئة من أجل التجانس وتوزيع حجم كدنا] حوالي 100 النيوكليوتيدات قبل التهجين (الشكل 4C). بعد التهجين والمسح الضوئي (الشكل 4D)، والفحص البصري للصورة تمكن واحد لمعرفة ما اذا كان يتم محاذاة الشبكة بشكل جيد لالبقع (الشكل 4E) وإذا الضوابط التهجين تتسق (الشكل 4F). هذه الخطوة هي مفيدة أيضا من أجل استبعاد ميكروأرس التي فقاعات الهواء أو أخطاء وقع أثناء التجربة.

مرة واحدة لقد مرت رقائق QC (الشكل 5)، وبعد التطبيع، قاد التحليل الإحصائي من 5 مباريات الزوج الورم وعينات الحمض النووي الريبي البروستاتا العادية من مستشفى ليون الجنوب إلى تحديد 207 probesets هيرفي مع القيم التعبير التفاضلي (p.val <0.05) (الشكل 6A). لدعم هذه السجلات والحصول على معلومات البروستات محددة، تم إضافة 35 مباراة إضافية عينات الزوج (القولون والمبيض والخصية والثدي والرئة والبروستاتا) لتحليل وإجراء SAM-روزفلت (FDR = 20٪) التي تم تحديدها في نهاية المطاف 44 البروستاتا probesets هيرفي محددة. فيما بينها، ووصف 10 هياكل هيرفي الأكثر أهمية (الشكل 6B). وسوف تكون هناك حاجة لمزيد من الدراسات السريرية تقييم قيم حساسية وخصوصية هذه المؤشرات الحيوية مرشح.

pload/50713/50713fig1.jpg "العرض =" 500px "/>
الشكل 1 مخطط الإجراء العام من العيادة (1: استئصال البروستاتا من قبل الطبيب وإعداد الأنسجة من قبل الطبيب الشرعي) على مقاعد البدلاء (2-6: إعداد العينات، وإعداد الهدف، وتجهيز ميكروأري) مما يؤدي إلى تحديد المؤشرات الحيوية مرشح (7: تحليل biocomputing من ميكروأرس هيرفي). وصفت الأحماض النووية المستمدة من الأنسجة الطبيعية في البرتقال؛ تتكون الأحماض النووية المستمدة من منطقة الورم من خليط من الطبيعي (البرتقال) والورم محددة (أسود) الأحماض النووية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-2529
. الرقم 2 دنس ومضمون رقاقة هيرفي-V2: تسلسل هيرفياستردادها من الجينوم البشري يتم تخزينها في قاعدة بيانات تسمى هيرفي-gDB3، ثم تحقيقات مرشح 25 مير تمر من خلال إجراء النمذجة التهجين مخصصة (EDA +) قبل أن يتم تجميعها في النهاية على مجموعة (وصفت الناتجة استهدفت مناطق فرعية لكل العائلة). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-3171
الرقم 3. معالجة البروستاتا من قبل الطبيب الشرعي. (A) يتم نقل جذرية الطازجة استئصال البروستاتا العينة إلى المختبر. (BC) اتسخت البروستاتا (الأخضر على الجانب الأيمن والأسود على الجانب الأيسر). (D) المقطع العرضي كبيرة من الغدة على الجانب الخلفي. (E) ترك هامش سليمة، PIECيتم تشريح فاق الأنسجة من مناطق مختلفة من غدة البروستاتا. يتم وضعها (F) النوى من الأنسجة في أنبوب إيبندورف. (G) ويستخدم خيط خياطة لإغلاق البروستاتا ومنع تشويه الغدة وتعطيل الحد الأدنى من هامش الجراحية. ثم، واستئصال البروستاتا الجذري العينة مستعدة لتحديد في الفورمالين وفقا للإجراءات المعتادة للتحليل النسيجي. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-4191
ضوابط الشكل 4. جودة إعداد الحمض النووي والكفاءة التهجين. (A) سلامة الحمض النووي الريبي، (B) [كدنا] تضخيم الأهداف و(C) أهداف مجزأة المستخدمة في مرحلة التهجين. الESE تم الحصول على ثلاثة ضوابط الجودة مع Bioanalyzer باستخدام الحمض النووي الريبي رقائق نانو والفحص يوكاريوت نانو دوري الدرجة الثانية. (D) وعموما صورة من هيرفي-V2 منطقة ميكروأري التهجين بعد المسح، (E) توسيع الزاوية اليسرى العليا تبين الضوابط محاذاة الشبكة و(F) توسيع منطقة مركز تظهر اكتشاف الضوابط التهجين. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-5103
الرقم 5. معالجة الإشارات. (A) [أفمتريإكس] بوليا ارتفاع في الضوابط التضخيم. في بوليا تسيطر داب، الثريونين، الفنيل ألانين واليس النصوص من B. وارتفعت الجينات الرقيقة في عينة الحمض النووي الريبي، وتعمل على تقييم النجاح الشامل من الخطوات إعداد الهدف. يجب أن يتم الكشف عن كثافة في خفض القيم بين هذه الضوابط لضمان ارتفاع في أنه لا يوجد تحيز خلال التضخيم WT-الحفاوة بين العالية والمنخفضة الجينات التي أعرب عنها. (ب) [أفمتريإكس] ارتفاع في الضوابط التهجين. هذه الأهداف معزولة عن E. وارتفعت القولونية والبكتيريا P1 قبل الإجراء وضع العلامات. زيادة القيم من BioB، ك ح، BIOD وتشير لجنة المساواة العرقية النجاح الشامل من التهجين. (C) توزيع كثافة الإشارات رقاقة بعد التطبيع الجيش الملكي المغربي. معظم probesets إشارات المعرض مع القيم أقل من 2 6 (الخلفية)، مما يشير إلى أن التعبير عموما يقتصر أساسا إلى بعض مواضع هيرفي محددة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 6. تحليل البيانات. (أ) تحليل المجموعات الهرمية العينات العادية والورم. تم تطبيق تقسيم المجموعات إلى القيم التعبير تطبيع باستخدام الخوارزمية الإقليدية وظيفة عن بعد، وتضم probesets إلى ما يصل (الحمراء) - وهبوطا (الازرق) التنظيم بين عينات العادية والورم. (B) اختيار من أعلى هياكل هيرفي 10 التعرف على العلامات البيولوجية مرشح من سرطان البروستاتا. لكل عنصر هيرفي، والأسرة هيرفي ذات الصلة، يتم إعطاء الإحداثيات الجيني (NCBI 36/hg18) وصفا موجزا للهيكل هيرفي. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-7145
الرقم 7. وذخيرة هيرفي (أ) وضع تسلسل للجينوم البشري كشفت 25،000 الجينات ترميز البروتين (الإكسونات، 2٪) وكمية كبيرة من العناصر القابلة للنقل بما في ذلك 200،000 تكرار محطة الطويلة (LTR) retrotransposons (هيرفي، 8٪). (ب) استقراء من محتوى رقاقة هيرفي-V2 والبيانات المرتبطة التعبير (79 عينات منشؤها من 8 العادي مقابل أنواع الأنسجة الورم) تشير إلى أن ثلث ذخيرة هيرفي نشطة transcriptionally. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-7934
الرقم 8. التفسير الوظيفي للإشارات من الرقاقة. (أ) تحديد ومراقبة المروج جينية: U3 إشارة سلبية (المسبار الحمراء، 5'LTR) مقابل R-U5 إشارة إيجابية (الأزرق التحقيق، 5'LTR) تشير يحركها U3 النسخ، بدعم من مثيلة الدليل السياسي الشامل مختلفة (الدوائر السوداء الصلبة) محتوى U3 في peritumoral العادي مقابل أنسجة الورم. يتم التعرف على المفترضة 3.1 كيلو بايت مغلف ترميز أعرب مرنا حصرا في الورم باستخدام SD1/SA2 لصق تقاطع تداخل التحقيق: (B) استراتيجية الربط. * استخلاصه من قبل مقارنة مع الأنسجة غير المشيمة الأخرى. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

على مدى السنوات ال 10 الماضية، فإن معظم المحاولات لقياس هيرفي التعبير استخدمت تقنيات RT-PCR إما التركيز على مكان معين أو 20-24 على أساس الحفاظ النسبي للجينات بول لتقييم الاتجاهات العامة داخل هيرفي أجناس 25،26 . بالإضافة إلى ذلك، التكبير PCR باستخدام بادئات تدهورت للغاية إلى جانب ميكروأرس منخفض الكثافة تهدف إلى كشف وتحديد التعبير عن الأسر هيرفي 27،28. من أجل اقتفاء أثر التعبير عن موضع الفرد داخل الأسرة، على أساس نهج التضخيم PCR من مناطق الحفظ جنبا إلى جنب مع الاستنساخ والتسلسل اللاحق تمكين العناصر المتميزة النشطة transcriptionally من HML-2 أو 29،30 هيرفي-E4.1 31 عائلة ل يتم التعرف عليها. تنتهي أيضا عن طريق الاستنساخ وتسلسل الخطوات، الجينوم تكرار تقنية الرصد التعبير تهدف إلى تحديد المروجين بين يكرر حددت HML-2 لتر الانفرادي الإنسان محددة نشط 32،33. وضعنا على التوالي جيلين من ميكروأرس عالية الكثافة المخصصة لتحليل Transcriptome على هيرفي، وإدخال منهجيات مناسبة لتكرار تصميم عنصر التحقيق من أجل تقليل التفاعلات المتبادلة بين العناصر paralogous داخل الأسرة 34،35. رقاقة هيرفي-V2 الذي يستهدف 2،690 proviruses متميزة و2،883 لترا منفردا من هيرفي-W، هيرفي-H، هيرفي-E 4.1، هيرفي-FRD، هيرفي-K HML-2-K وهيرفي HML-5 عائلات، كشف التعبير عن 1،718 هيرفي مواضع (أرقام 7A وباء) في مجموعة واسعة من أنسجة 35، ويتضح في هذه الورقة عن طريق تحديد المؤشرات الحيوية المفترضة البروستاتا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام probesets متعددة على مكان معين هو بالمعلومات عن تنظيم النسخي لها. الأولى، وهي إشارة سلبية U3 بالتزامن مع واحدة إيجابية U5 يصنف LTR كمشجع، وربما يعكس إشارات سلبية على العكس U3 إيجابية وU5 دورا تذييل بعديد الأدينيلات. وبالتالي فإننا طdentified 326 لترا المروج في مجموعة واسعة من أنسجة 35، وبناء على هذه المعلومات شيئين U3-U5 التي تقدمها مجموعة، اقترحنا وأكد تجريبيا لبعض حالات مختارة أن هذه النسخ الحكم الذاتي والسيطرة عليها من قبل مثيلة عملية جينية تعتمد 34 (الشكل 8). الثانية، والكشف عن إشارات من مثل LTR، هفوة والحياة الفطرية probesets مستقلة أو صدر من تحقيقات تستهدف تقاطع لصق محددة بالمعلومات حول استراتيجية الربط proviral، كما يتضح من البيانات الشخصية ERVWE1/Syncytin1 التعبير في المشيمة أو في الخصية الورم 34. هذا يشير إلى أن عملية اختيار هيرفي التحقيق المحددة هي قوية بما يكفي لدعم تحديد استراتيجية الربط المرتبطة الأنسجة، وبكفاءة كما لجينات التقليدية 36 (الشكل 8).

هذا الأسلوب هو أول محاولة لتحديد مكان التعبير بشكل فردي هيرفيباستخدام ميكروأري عالية الكثافة المخصصة القائمة على التكنولوجيا [أفمتريإكس]. مزايا محددة بوضوح من تنسيق ميكروأري فك Transcriptome على هيرفي تتكون من (ط) استكشاف منسقة من عدة عائلات هيرفي و (ب) تحليل في وقت واحد ومستقل من المناطق المختلفة لكل مكان، على سبيل المثال. U3 وU5 المجالات لمنفردا وترا proviral والمناطق هفوة أو الحياة الفطرية وتقاطعات ممكن تقسم الهياكل المرتبطة proviral، دون أي بداهة على وظيفة من العنصر هيرفي. آفاق تعتمد على حدوث تحسن من الشروح في أدوات biocomputing المرتبطة ميكروأري. هذا ينبغي أن يسمح احد لتحويل الإشارات رقاقة في الفرضيات البيولوجية مثل ما إذا HERVs نشطة يتضح دفع lncRNA النسخ أو تعدل أكثر أو أقل الداني الترميز التعبير الجيني. في الواقع، ويدعم هذه الفرضية من خلال الدراسات الحديثة أن حددت البروستاتا المرتبطة بالسرطان النصوص ncRNA تحتوي على مكونات الخامسORFS iral من عائلة هيرفي-K الذاتية الارتجاعي أو أجزاء من منطقة المروج الفيروسية LTR 37، فضلا عن اثنين من الأحداث الانصهار الجين وهي هيرفي-K22q11-ETV1 وهيرفي-K17-ETV 38،39. أخذت معا، فإن هذا النهج Transcriptome على كله جنبا إلى جنب مع وظيفة LTR والتعرف استراتيجية الربط قد تساعد على فك علامة مقابل مكونات الزناد من هيرفي التعبير في المزمنة والأمراض المعدية 40،41 42،43.

Disclosures

وأيد هذا العمل من قبل BIOMERIEUX SA، والتكايا CIVILS دي ليون وكالة OSEO العام الفرنسي (متقدمة التشخيص لنهج جديد العلاجية، وهو برنامج تموله الحكومة الفرنسية مخصصة للطب شخصية). PP، VC، GO، NM، وزير الخارجية والعاملين في BIOMERIEUX SA. قدمت PP، NM وFM طلبات براءات الاختراع التي تغطي نتائج هذه الورقة.

Acknowledgements

نشكر سيسيل Montgiraud، جولييت جيمينيز، مجلي جايار وبرتراند بوناود عن مساهمتها في التطوير الأولي وتعظيم الاستفادة من بروتوكول هيرفي-V2. ونود أيضا أن نشكر هادر Haidous لقيادته على الاعتبارات الأخلاقية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TrizolInvitrogen15596-026
RNA poly-A control stockAffymetrix900433
DNAse 1PromegaM61011,000 U (1 U/µl)
Terminal transferaseRoche3333574001400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).
DLR-1aAffymetrix900542
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization ControlAffymetrix900454
GeneChip Hybridization, Wash and stainingAffymetrix900720Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions
10x One-Phor-All Buffer PLUSComposition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.
RNeasy Mini kitQiagen74104RNA cleanup protocol
WT-Ovation RNA amplification systemNugen2210-24
QIAquik PCR purification kitQiagen28104
EQUIPMENT
Material NameCompanyCatalogue NumberComments
Nanodrop 1000Thermo Scientific
GeneChip Scanner 3000 7GAffymetrixGS30007GOptional: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hybridization 640 OvenAffymetrix640Includes 4 GeneChip Probe array carriers
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chipAffymetrixCustom array.
For microarray availability (for research use only), please contact:
François Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux
Medical Diagnostic Discovery Department
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F
69495, Pierre Bénite cedex France
Phone: 33 (0)4 72 67 87 85
Email: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedicated database and annotations

The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35.

Locus-specific probes design
Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets.

Custom HERV GeneChip microarray
The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.

References

  1. Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).
  9. Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).
  20. de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).
  30. Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).
  31. Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).
  32. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).
  33. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).
  36. Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).
  37. Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).
  44. Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

81 Retroviridae Transcriptome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved