خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Summary

خلايا الثدييات التعبير عن الجينات البكتيرية تلألؤ بيولوجي كاسيت ( لوكس) إنتاج الضوء بشكل مستقل. وقد أظهرت ديناميات إضاءة الحيوية الناتجة عند التعرض للمواد الكيميائية لتعكس آثار العلاج على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي، مما يجعل هذه الخلايا على والمستمر، في الوقت الحقيقي أداة فحص السمية الرخيصة التي يمكن بسهولة أن تتكيف لأتمتة عالية الإنتاجية.

Abstract

وقد استخدمت الثدييات الخلية التي يوجد مقرها في فحوصات المختبر على نطاق واسع كبدائل للالتجارب على الحيوانات لدراسات السمية ولكن كانت محدودة بسبب التكاليف النقدية والزمنية عالية من إعداد العينات الموازية التي استلزم نظرا لطبيعة المدمرة لليراعة طرق الفحص القائم على وسيفيراز . هذا الفيديو يصف استخدام خلايا الثدييات إضاءة الحيوية بشكل مستقل، والتي لا تتطلب إضافة المدمرة للركيزة وسيفيرين، كطريقة غير مكلفة وسطحية لرصد آثار السامة للخلايا من مركب من الفائدة. خلايا الثدييات التعبير عن ثابت وتلألؤ بيولوجي البكتيرية كامل (luxCDABEfrp) كاسيت الجينات تنتج ذاتيا إشارة ضوئية أن قمم في 490 نانومتر دون إضافة ركيزة وسيفيرين مكلفة وربما التدخل، الإثارة من مصدر طاقة خارجي، أو تدمير العينة التي هي تقليديا أجريت أثناء إجراء التصوير الضوئيق. هذا الاستقلال من مؤثر خارجي يضع عبئا على الحفاظ على رد فعل إضاءة الحيوية فقط على الخلية، وهذا يعني أن الإشارة الناتجة هي فقط اكتشفت أثناء عملية الأيض نشطة. هذه الخاصية تجعل لوكس، معربا عن خط الخلية مرشح ممتاز لاستخدامها بوصفها biosentinel من الآثار السامة للخلايا وذلك لأن التغيرات في إنتاج إضاءة الحيوية التي تدل على آثار سلبية على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي. وبالمثل، فإن طبيعة الحكم الذاتي وعدم تدمير عينة تصاريح التصوير المتكرر لنفس العينة في الوقت الحقيقي طوال فترة التعرض السموم، ويمكن أن يؤديها عبر عينات متعددة باستخدام معدات التصوير القائمة بطريقة آلية.

Introduction

في الولايات المتحدة، والمستحضرات الصيدلانية وغيرها من المنتجات المعدة للاستهلاك البشري تتطلب تقييم واسعة النطاق قبل الموافقة عليها لاستخدام المستهلك من قبل إدارة الغذاء والدواء. يتم وضع العبء المالي لتنفيذ هذا الاختبار على مطور ^1، مما يزيد بشكل كبير من تكلفة تطوير مجمع جديد، وبالتالي يترجم إلى زيادة تكلفة بالنسبة للمستهلكين. في حين أن الكثير تقليديا من هذا الفحص قد تستغل الموضوعات الحيوان ليكون بمثابة وكلاء للالمضيفين الإنسان، وقد ثبت أن هذا عبئا ماليا كبيرا، مع ما يقدر بنحو 2.8 مليار دولار تنفق سنويا على ADME / توكس (الامتزاز، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، وإفراز، وسمية ) فحص وحده ² و أدلة متزايدة تشير إلى أن النماذج الحيوانية لا يمكن التنبؤ بشكل موثوق الردود السمية الإنسان ^3. ولذلك، في المختبر الإنسان الاختبارات القائمة على ثقافة الخلية وقد اكتسب شعبية على مدى العقدين الماضيين لما له من أقل نسبياالتكلفة، وأعلى إنتاجية، وتمثيل أفضل من التوافر البيولوجي البشرية وعلم السموم ^4. الأساليب الحالية الخلية المستندة إلى ثقافة الفحص السمية تستخدم نقاط النهاية مختلفة، مثل قياس مستويات ATP، وفحص نشاط الانزيمات حشوية المتاحة التطور الطبيعي، التي تحقق سلامة الغشاء الخلوي، أو تتبع مستوى النشاط الميتوكوندريا، لتقييم الجدوى الخلوية ^{5 ، 6.} ومع ذلك، بغض النظر عن نقطة النهاية اختيار، وهذه الأساليب تتطلب كل الدمار من قبل عينة يمكن أن تؤخذ القياسات، وبالتالي إنتاج البيانات فقط عند نقطة زمنية واحدة. ونتيجة لذلك، فإن أعدادا كبيرة من العينات تحتاج إلى أن تكون مستعدة وتعامل بشكل متواز لدراسات السمية الحركية الأساسية، مضيفا مرة أخرى إلى التكلفة والعمالة المطلوبة لتطوير مجمع جديد. بدلا من ذلك، استخدام المقايسات يفرز وسيفيراز مثل Gaussia وسيفيراز ^{7، 8} Vargula وسيفيراز، وMetridia وسيفيراز ⁹وقد تم تطوير هذا يزيل الحاجة إلى تحلل الخلايا وتتطلب جزء من وسائل الإعلام لقياس نقطة النهاية، ولكن هذه لا تزال محدودة لأخذ العينات في نقاط زمنية محددة سلفا، وتتطلب أيضا إضافة الخارجية ركائز ضوء تفعيل.

لتجنب يضر المطلوبة تدمير عينة وكذلك للقضاء على تكلفة ركائز، فقد تم تصميم خط الخلية البشرية التي تعبر عن تلألؤ بيولوجي البكتيرية كامل (لوكس) كاسيت الجين (luxCDABEfrp) للسماح للرصد المستمر للخلايا الحية مشابه إلى فلوري صبغ القائمة على التصوير الخلية الحية، ولكن من دون إجراءات إضافية التحقيق الفوتون تفعيل والمجهرية. هذا الخط خلية قادرة على انتاج جوهري إشارة ضوئية لاستمرار الكشف المباشر دون الحاجة إلى مؤثر خارجي، وبالتالي تجنب تدمير العينة. ميكانيكيا، في إشارة إضاءة الحيوية المتولدة من هذه الخلايا يؤديو عندما يحفز انزيم وسيفيراز luxAB-شكلت أكسدة من ألدهيد الدهنية طويلة السلسلة (توليفها ومجدد من المنتجات الجينات luxCDE استخدام ركائز داخلية المنشأ) في وجود انخفاض فيتامين بي الفوسفات (FMNH _2، التي يعاد تدويرها من FMN بواسطة الجينات فرب المنتج) والجزيئية الأكسجين ^10. وبالتالي التعبير عن كاسيت لوكس في الخلية المضيفة تمكن الضوء ليتم إنتاجها والكشف دون تدمير الخلايا أو الخارجية بالإضافة الركيزة. وبالمثل، فإن التفاعل بين الجينات لوكس وFMN التطور الطبيعي المتاحة، وO ₂ cosubstrates، وشرط لصيانة بيئة التي يمكن أن تدعم تحويل FMN إلى FMNH _2، ويضمن أن الإشارة إضاءة الحيوية الناتجة لا يمكن إلا أن يتم الكشف عن الكائنات ، خلايا نشطة عملية الأيض.

سبق لها أن تستغل هذه المتطلبات لإثبات أن لوكس BASإد إضاءة الحيوية خرج يرتبط بقوة مع الخلوية حجم السكان ¹¹ وأن التعرض مركب سام يضعف الإنتاج autobioluminescent بطريقة الاستجابة للجرعة ^12. هنا نستخدم autobioluminescent الكلى الجنينية البشرية تتميز سابقا (HEK293) خط الخلية ¹¹ للتدليل على فحص السمية الآلي من مضاد حيوي من عائلة بليوميسين مع الحمض النووي المعروف النشاط ضارا وذلك سبيل المثال ممثل للتحقق من صحة تطبيق خلايا الثدييات autobioluminescent لاختبار السمية.

Protocol

1. إعداد الخلية

1. استرداد قارورة من إضاءة الحيوية HEK293 الخلايا من الأوراق المالية السائلة النيتروجين المجمد وتنمو لهم في متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 0.01 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1X مضادات الحيوية مضاد فطري، و 0.01 ملي البيروفات الصوديوم في T ₇₅ الأنسجة قارورة الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
   ملاحظة: إن وسائل الإعلام ومكونات تكميلية تختلف بناء على خطوط الخلايا، وبالتالي ينبغي أن يتم اختيار وفقا لذلك.
2. تحديث المتوسطة كل 2-3 أيام حتى وصلت ~ 80٪ التقاء.
   ملاحظة: وسوف يستند كمية من الخلايا المطلوبة على التصميم التجريبي. إذا لزم الأمر، ويمكن الحصول على المزيد من الخلايا عن طريق subculturing.
3. حصاد الخلايا للاختبار.
   1. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من خلال يحوم بلطف القارورة ومن ثم التخلص من قضى PBS.
   2. إضافة التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة،أو حتى الخلايا قد فصل من القارورة.
   3. جمع الخلايا منفصلة في برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم خطوط الخلايا غير ملتصق، وخلايا منفصلة بواسطة الطرد المركزي ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
4. تحديد إجمالي عدد خلايا باستخدام عدادة الكريات أو غيرها من نظام العد الخلية.
5. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في العذبة والمتوسطة prewarmed.
6. أرقام البذور متساو من الخلايا في الآبار الفردية لوحة متعددة جيدا مبهمة. في هذا المثال، لوحة 5 × 10 ⁵ خلايا في حجم مل 1 في كل بئر من لوحة 24 أيضا أسود. لوحة حجم مساو من المتوسطة في الآبار ثلاث نسخ لتكون بمثابة الشاهد السلبي.
   ملاحظة: عدد الخلايا مطلي في كل بئر هو مرن، ويمكن أن يكون الأمثل للتجارب الفردية. لكل خط الخلية إضاءة الحيوية، تجريبيا تحديد العلاقة بين عدد الخلايا وbiolumiخرج nescent، وكذلك الحد الأدنى من الخلية كشف حساب قبل أي اختبارات السمية. للقيام بذلك، وقياس تلألؤ بيولوجي عبر مجموعة واسعة من الأحجام السكانية (على سبيل المثال، 1 × ⁰³ حتي 01 أكتوبر × 10 ⁶ خلايا) في ظل ظروف التصوير موحدة.
7. علاج الخلايا مع مجمع اختبار (ق) كما هو موضح أدناه.

2. التحضير الكيميائية

1. إعداد المادة الكيميائية التي يجري اختبارها كحل المركزة للأسهم. في هذا المثال، استخدام 100 ملغ / مل من محلول المخزون مضاد حيوي من عائلة بليوميسين.
   ملاحظة: لتقليل الآثار السامة المحتملة المستندة إلى السيارة، خاصة إذا تم استخدام المذيبات العضوية كوسيلة لإضافة المواد الكيميائية، فمن المستحسن أن يكون تركيز الأسهم 1،000 مرات على الأقل تركيز بعد التطبيق المطلوب.
2. إضافة الأسهم الكيميائية المعدة مباشرة إلى الخلايا. في هذا المثال، جرعة المضاد الحيوي من الفائدة عند تركيزات النهائي من 100، 200، 300، و 400 ميكروغرام / مل في الثلاثيةيغضن الآبار. ترك ثلاثة آبار من الخلايا غير المعالجة والضوابط.
   ملاحظة: يجب أن يتم تحديد تركيز النهائي من المادة الكيميائية المستهدفة استنادا إلى أهداف محددة التجريبية. يتم اختبار مجموعة واسعة من التركيزات عادة للحصول على الطيف الكامل من الآثار السمية.

3. التصوير وتحليل البيانات

1. مباشرة بعد إضافة المواد الكيميائية، ووضع لوحة في غرفة التصوير من أداة مناسبة لاقتناء الصورة وقياس تلألؤ بيولوجي.
2. تلألؤ بيولوجي قياس كل 15 دقيقة على مدى فترة 24 ساعة باستخدام 10 دقيقة وقت التكامل لكل قراءة.
   ملاحظة: في المرة التكامل المستخدمة في هذا المثال هو على أساس لكل لوحة ويمكن تعديلها لالقياس على أساس لكل جيدا باستخدام luminometers أخرى يختارها. ويمكن أيضا أن يتم ضبط الوقت التكامل على أساس خط الخلية إضاءة الحيوية الذي تم اختياره. لأن يتم إنتاج تلألؤ بيولوجي مستقل دون تدمير الخلايا أو أي مؤثر خارجي، وقراءةيمكن اتخاذها بالجلسات في أي نقطة الوقت المطلوب لتحقيق أهداف تجريبية محددة.
3. قياس كثافة إضاءة الحيوية من كل بئر من خلال تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام برنامج متوافق. عرض الإخراج ضوء إما تدفق الإجمالي (الفوتونات / ثانية) أو متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سم ² steridian /) من كل عينة.

النتائج

في هذه الدراسة، تم رصد ديناميات HEK293 الخلايا autobioluminescent بشكل مستمر على مدى فترة 24 ساعة ردا على التعرض للمضادات الحيوية (الشكل 1). الآثار السامة من هذه المضادات الحيوية، والتي هي عضو في الأسرة بليوميسين المعروف لقتل الخلايا الحية عن طريق الربط بين والشق DNA ^13،<...

Discussion

يوضح هذه الطريقة على استخدام خلايا الثدييات إضاءة الحيوية بشكل مستقل كما في المختبر فحص السمية الخلوية التي تتيح فحص الخلايا الحية التي يتعين رصدها بشكل مستمر على مدى حياتهم. هذا البروتوكول هو مرن، ويمكن تعديلها لاستيعاب ظروف تجريبية محددة كما هو مطلوب. على سبي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062