Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Resumo

As células de mamífero que expressam a cassete de gene de bioluminescência ( Lux) Produzem luz de forma autônoma. A dinâmica bioluminescentes resultantes após a exposição química têm sido demonstrados para reflectir os efeitos do tratamento sobre o crescimento e metabolismo celular, tornando essas células um, contínuo e em tempo real ferramenta de rastreio de toxicidade baixo custo que pode ser facilmente adaptado para a automatização de alto rendimento.

Resumo

Células de mamíferos com base em ensaios in vitro têm sido amplamente empregados como alternativas aos testes em animais para estudos toxicológicos, mas foram limitados devido aos altos custos monetários e de tempo de preparação da amostra paralela que sejam necessárias devido à natureza destrutiva do vaga-lume métodos de rastreio baseados luciferase . Este vídeo descreve a utilização de células de mamífero de forma autónoma bioluminescentes, que não requerem a adição de um substrato destrutiva luciferina, tal como um método barato e fácil para a monitorização dos efeitos citotóxicos de um composto de interesse. As células de mamíferos que expressem estavelmente a bioluminescência completo (luxCDABEfrp) cassete do gene autonomamente produzirem um sinal óptico que um pico a 490 nm, sem a adição de um substrato luciferina caro e, possivelmente interferindo, a excitação por uma fonte de energia exterior ou a destruição da amostra que é tradicionalmente realizado durante o procedimento de imagiologia ópticas. Esta independência de estimulação externa coloca o fardo para manter a reacção bioluminescente unicamente sobre a célula, o que significa que o sinal resultante é detectado apenas activo durante o metabolismo. Esta característica faz com que a linha de células de lux que expressam um excelente candidato para o uso como um biosentinel contra os efeitos citotóxicos por causa mudanças na produção bioluminescente são indicativos de efeitos negativos sobre o crescimento e metabolismo celular. Do mesmo modo, a natureza autónoma e falta de destruição da amostra requerida permite imagiologia repetida da mesma amostra em tempo real ao longo do período de exposição tóxico e pode ser realizada através de várias amostras utilizando o equipamento existente de imagem de uma forma automatizada.

Introdução

Em os EUA, farmacêuticos e outros produtos destinados ao consumo humano requer ampla avaliação antes de serem aprovadas para uso do consumidor pela Food and Drug Administration. Os encargos financeiros para executar este teste é colocada no revelador ^1, o que aumenta substancialmente os custos de desenvolvimento de novos compostos e, portanto, se traduz num aumento de custos para os consumidores. Enquanto, tradicionalmente, grande parte desta seleção utilizou assuntos animais para atuar como proxies para hospedeiros humanos, este provou ser um grande ônus financeiro, com um valor estimado de 2,8 bilhões dólares gastos anualmente em ADME / Tox (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade ) triagem sozinho ² e evidências sugerindo que os modelos animais não é possível prever com segurança respostas toxicológicos humanos ^3. Por conseguinte, os testes in vitro de células humanas à base de cultura ganhou popularidade nos últimos dois décadas devido à sua relativamente baixade custos, maior produtividade e melhor representação de biodisponibilidade humana e toxicologia ^4. Baseados em métodos de rastreio de cultura celular correntes toxicidade empregar vários parâmetros, tais como a medição de níveis de ATP, o rastreio da actividade de enzimas citoplasmáticos endogenamente disponíveis, sondando a integridade da membrana celular, ou o seguimento do nível de actividade mitocondrial, para avaliar a viabilidade celular ^{5 , 6.} No entanto, independentemente da extremidade escolhido, estes métodos requerem a destruição da amostra antes da medição pode ser feita, portanto, apenas a produção de dados num único ponto de tempo. Como resultado, um grande número de amostras têm de ser preparados e tratados em paralelo para estudos toxicológicos básicos cinética, mais uma vez aumentando o custo e o trabalho necessários para o desenvolvimento de novos compostos. Em alternativa, os ensaios de luciferase utilizando secretada como Gaussia luciferase ^7, Vargula luciferase ⁸ e ⁹ Metridia luciferasetêm sido desenvolvidos, que eliminam a necessidade de lise celular e necessitam de uma fracção dos meios para a medição de ponto de extremidade, no entanto, estes ainda estão limitados a amostragem em pontos de tempo predeterminados e também requerer a adição de substratos exógenos de luz de activação.

Para evitar o detrimento da destruição da amostra requerida, bem como para eliminar o custo de substratos, uma linha celular humana foi modificado que expressa a bioluminescência completo (lux), cassete do gene (luxCDABEfrp) para permitir a monitorização contínua de células vivas que é semelhante para imagens de células vivas com base fluorescente-dye, mas sem os procedimentos adicionais de investigação photon-ativadores e microscópica. Esta linha celular é capaz de constitutivamente produzindo um sinal óptico para a detecção contínua, directa, sem a necessidade de estimulação externa, evitando assim a destruição da amostra. Mecanisticamente, o sinal bioluminescente gerado a partir destas células resultars quando a enzima luciferase luxAB formada catalisa a oxidação de um aldeído gordos de cadeia longa (sintetizado e regenerado pelos produtos do gene luxCDE utilizando os substratos endógenos), na presença de riboflavina fosfato reduzido (FMNH _2, que é reciclada a partir de FMN pelo gene frp produto) e oxigénio molecular ^10. A expressão da cassete de lux na célula hospedeira, por conseguinte, permite que a luz seja produzida e detectada sem destruição celular ou adição de substrato exógeno. Da mesma forma, a interação entre os genes lux ea FMN disponível endogenamente, e O _dois co-substratos, bem como a exigência de manutenção de um ambiente capaz de suportar a conversão de FMN para FMNH _2, garante que o sinal bioluminescente resultante só pode ser detectada de viver as células activas metabolicamente.

Estes requisitos foram anteriormente explorados para demonstrar que lux-bassaída bioluminescente ed correlaciona fortemente com o tamanho da população celular ¹¹ e que a exposição composto tóxico prejudica a produção autobioluminescent de uma forma dose-resposta ^12. Aqui usamos um autobioluminescent rim embrionário humano previamente caracterizadas (HEK293) ¹¹ linha de células para demonstrar a triagem automatizada toxicológico de um antibiótico da família da bleomicina com ADN conhecida actividade prejudicial como um exemplo representativo, para validar a aplicação de células de mamífero autobioluminescent para os ensaios de toxicidade.

Protocolo

1. Preparação celular

1. Recuperar um frasco de bioluminescentes HEK293 de azoto estoque congelada líquido e fazê-los crescer em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,01 mM de aminoácidos não essenciais, 1 x antibiótico-antimicótico e 0,01 mM de piruvato de sódio num t ₇₅ frascos de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO _2.
   Nota: Os meios de comunicação e componentes complementares varia de acordo com linhas de células e, portanto, deve ser escolhido de acordo.
2. Atualizar média a cada 2-3 dias até atingir ~ 80% de confluência.
   Nota: A quantidade de células necessárias irá basear-se no desenho experimental. Se necessário, mais as células podem ser obtidas por sub-culturas.
3. Células colheita para testes.
   1. Remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS), agitando suavemente o balão e, em seguida, descartando o gasto de PBS.
   2. Adicionar tripsina e incubar a 37 ° C durante 2 min,ou até que as células foram separadas do balão.
   3. Recolha das células isoladas com PBS e transferi-las para um tubo de centrífuga limpo.
      Nota: Se as linhas de células não aderentes são usados, celas separadas por centrifugação e lave uma vez com PBS.
4. Determinar a contagem total de células utilizando um hemacitómetro, ou outro sistema de contagem de células.
5. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em fresco, médio pré-aquecido.
6. Sementes de igual número de células em poços individuais de uma placa multi-bem opaco. Neste exemplo, a placa 5 x 10 ⁵ células em um mL de volume em cada poço de uma placa de 24 cavidades preta 1. Placa de um volume igual de meio em poços em triplicado para actuar como controlo negativo.
   Nota: o número de células colocadas em cada poço, é flexível e pode ser optimizado para as experiências individuais. Para cada linha celular bioluminescente, determinar experimentalmente a relação entre o número de células e biolumiNESCent saída, bem como a célula mínima detectável contar antes de quaisquer testes de toxicidade. Para fazer isso, a bioluminescência medida através de uma vasta gama de tamanhos da população (por exemplo, 1 x ^outubro 3-01 x 10 ⁶ culas) em condições padronizadas de imagem.
7. Tratar as células com o composto de teste (s), como descrito abaixo.

2. Preparação química

1. Preparar o produto químico a ser testado como uma solução de reserva concentrada. Neste exemplo, o uso de 100 mg / ml de solução de um antibiótico da família da bleomicina.
   Nota: Para minimizar os potenciais efeitos tóxicos à base de veículo, especialmente se um solvente orgânico é utilizado como um veículo para a adição de produtos químicos, recomenda-se que a concentração de Estoque ser de pelo menos 1000 vezes a concentração pós-aplicação desejada.
2. Adicionar o material químico preparado directamente para as células. Neste exemplo, a dose do antibiótico de interesse em concentrações finais de 100, 200, 300 e 400 ug / ml em triplicate poços. Adicione três poços de células não tratadas como controlos.
   Nota: A concentração final do produto químico alvo devem ser selecionados com base em objetivos experimentais específicos. Uma vasta gama de concentrações é normalmente testados para obter um espectro completo dos efeitos tóxicos.

3. Imagem e Análise de Dados

1. Imediatamente após a adição de produtos químicos, coloque a placa na câmara de imagem do instrumento adequado para aquisição de imagem e medição da bioluminescência.
2. Bioluminescência de medida a cada 15 minutos ao longo de um período de 24 horas utilizando um tempo de integração de 10 minutos para cada leitura.
   Nota: O tempo de integração usado neste exemplo é em uma base por placa e pode ser ajustado para a medição sobre uma base por poço usando outros luminómetros de escolha. O tempo de integração também podem ser ajustados com base na linha celular escolhida bioluminescente. Porque bioluminescência é produzida de forma autônoma sem destruição celular ou qualquer estímulo externo, lermentos podem ser tomadas em qualquer ponto de tempo desejado para cumprir objetivos experimentais específicos.
3. Quantificar a intensidade bioluminescente de cada poço através da identificação de uma região de interesse usando software compatível. Mostrar a saída de luz, quer como o fluxo total (fotões / segundo) ou a radiância média (fotões / segundo / cm steridian ² /) de cada amostra.

Resultados

Neste estudo, a dinâmica de autobioluminescent as células HEK293 foram continuamente monitorizados ao longo de um período de 24 horas em resposta à exposição a antibióticos (Figura 1). Os efeitos tóxicos deste antibiótico, que é um membro da família de bleomicina conhecido por matar células vivas por ligação e clivagem de ADN ^13, foram demonstradas por meio de um decréscimo na produção de bioluminescente em comparação com células não tratadas, o que pode ser visualizado d...

Discussão

Este método demonstra o uso de células de mamíferos bioluminescentes autonomamente como um ensaio de rastreio de citotoxicidade in vitro que permite que as células vivas de ser monitorada continuamente durante a sua vida. Este protocolo é flexível e pode ser modificado para acomodar condições experimentais específicas, conforme necessário. Por exemplo: a experiência aqui apresentada é apropriada para rastrear os efeitos tóxicos agudos, mas pode ser adaptado para avaliar efeitos de actuaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062