自主的生物发光哺乳动物细胞连续和实时监测细胞毒性

摘要

哺乳动物细胞表达生物发光细菌基因盒（勒克斯），自主产生光。化学品接触后产生的生物发光动力学已被证明，以反映细胞生长和代谢​​的治疗效果，使这些细胞的一种廉价的，连续的，实时的毒性筛选的工具，可以很容易地适应高通量自动化。

摘要

已广泛采用哺乳动物细胞为基础的体外实验毒理学研究动物试验的替代品，但已经有限的，由于高金钱和时间成本的平行样品制备，必要由于破坏性的萤火虫荧光素酶的筛选方法， 。本视频介绍的利用自主生物发光的哺乳动物细胞中，不需要的萤光素基板破坏性此外，作为廉价且简便的方法监测感兴趣的化合物的细胞毒作用。哺乳动物细胞中稳定表达基因盒的完整细菌的生物发光（luxCDABEfrp）自主产生的光信号，而不增加一个昂贵的，并可能干扰的虫荧光素底物，由外部能量源，或破坏的示例是传统的激发峰在490nm处期间进行光学成像过程秒。这种独立于外界刺激保持仅在细胞的生物发光反应的负担，这意味着，所得到的信号在代谢活跃期间只检测到。这一特性使得该勒克斯 -表达细胞系生物发光生产变化的一个很好的候选人使用作为biosentinel对细胞毒素的作用，因为是表示对细胞生长和代谢的不利影响。同样地，自主性和缺乏所需的样本的破坏，允许重复毒物接触的整个期间内对同一样品进行实时成像，可以使用现有的成像设备，在多个样品以自动化的方式进行。

引言

在美国，药品和其他产品用于人类消费需要大量的评估，才供消费者使用的由美国食品和药物管理局批准。为执行此测试的财政负担被放置在显影剂^1，大大提高了新化合物的开发成本，因此，转化为对消费者的成本增加。虽然传统的多筛查已利用受试动物作为代表人类宿主，这已被证明是大的财务负担，一个估计$ 2.8十亿每年用于ADME / Tox的（吸收，分布，代谢，排泄，和毒性）筛查，越来越多的证据表明，动物模型不能可靠地预测人类的毒性反应。因此， 在体外人体细胞培养为基础的测试已经获得了普及，在过去二十年来，由于其相对较低的成本，更高的吞吐量，更好地代表人类的生物利用度和毒理学^4。电流细胞培养为基础的毒性筛选方法采用各种端点，如ATP水平的测量，提供细胞质内源性酶的活性筛选，探测细胞膜的完整性，或跟踪线粒体活性的水平，来评估细胞的活力^{5 ，6。}但是，无论所选择的端点，这些方法都需要在试样破坏之前，都可以测量，因此只在一个单一的时间点产生数据。其结果是，大量的样品需要是平行的基本毒理动力学研究制备和处理，再次加入到所需的新化合物的开发成本和劳动力。另外，测定使用荧光素酶的分泌，如Gaussia荧光素酶^7，8 Vargula荧光素酶和荧光素酶的Metridia ⁹已经开发了，不再需要进行细胞裂解，并需要一小部分的端点测量的介质，但是，这些仍然有限，以在预定的时间点取样，还需要加入外源的光活化基板。

为了避免损害所需样品的破坏，以及消除基板的成本，已设计的人细胞系表达的完整细菌的生物发光（ 勒克司 ）基因盒（luxCDABEfrp）使活细胞的连续监测是类似于基于荧光染料的活细胞成像，但没有额外的光子激活和微观调查程序的。该细胞系能够组成型生产为连续的，直接检测的光信号，而不需要外部的刺激，从而避免破坏样品。机械，这些细胞所产生的生物发光信号，导致s时的发光酶形成的荧光素酶催化氧化的长链脂肪酸的醛（的的基因产物luxCDE使用内源性物质的合成和再生）的存在下还原核黄素磷酸（FMNH _2，这是由玻璃钢基因从FMN再循环产品）和分子氧^10。 勒克斯磁带盒在宿主细胞中表达，因此，使光被制造，以及细胞破坏或外源性底物除了没有检测到。同样地，将所得的生物发光信号之间的相互作用的勒克司的基因和内源性提供FMN，和O ₂ cosubstrates的，维护的环境中，可以支持的转换的FMN FMNH ₂的要求，确保只能检测从活，代谢活跃的细胞。

这些要求先前已被利用来证明LUX-BASED生物发光输出密切相关蜂窝人口规模¹¹和有毒的化合物暴露损害autobioluminescent的生产在时尚的剂量-反应^12。这里，我们使用一个以前的特点autobioluminescent的人类胚胎肾（HEK293）细胞系¹¹演示自动化毒理学的筛选与已知的DNA损伤活性作为一个代表性的例子来验证的应用的autobioluminescent哺乳动物细胞毒性试验的博莱霉素族抗生素。

研究方案

1。细胞的制备

1. 小瓶从液体氮冷冻库存的生物发光的HEK293细胞的恢复和增长的Dulbecco改进的鹰的培养基（DMEM）中添加10％胎牛血清，0.01 mM的不必要的氨基酸，1X抗生素，抗真菌剂，和0.01 mM的钠丙酮酸用T在₇₅组织培养烧瓶中，在37℃和5％CO _2。
   注意：媒体及补充元件会根据细胞系，并因此，应该相应地选择。
2. 刷新中期每2-3天，直到达到约80％汇合。
   注：所需的细胞的量，将根据实验设计。如果需要，可以通过以下方式获得更多的细胞的传代培养。
3. 收获细胞进行测试。
   1. 移除介质洗涤细胞，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻摇动烧瓶中，然后弃去使用了PBS。
   2. 加入胰蛋白酶在37℃孵育2分钟，或直至细胞从烧瓶中脱离。
   3. 收集在PBS分离的细胞，并将它们传送到一个​​干净的离心管。
      注意：如果用于非贴壁细胞系，通过离心分离细胞，并用PBS洗一次。
4. 确定总的细胞计数，使用血细胞计数器或其他细胞计数系统。
5. 离心细胞悬浮液在300×g离心5分钟。弃上清，悬浮细胞在新鲜，预热介质。
6. 种子细胞成单独的一个不透明的多孔板的孔中的数目相等。在这个例子中，板5×10 ⁵细胞在1ml体积成一个黑色24孔培养板的各孔中。板等体积的培养基中一式三份井作为阴性对照。
   注意：接种于各孔中的细胞数目是灵活的，可优化的个别实验。对于每个生物发光的细胞系，实验确定细胞数和biolumi之间的关系消逝的输出，以及最小可检测细胞计数之前的任何毒性试验。要做到这一点，在很宽的范围的人口规模（例如，1×10 ^{3〜1×10 6个}细胞）在标准化的成像条件下测量生物发光。
7. 处理细胞与测试化合物（次）（如下文所述）。

2。化学制剂

1. 准备作为浓缩原液被测试的化学品。在这个例子中，使用一个100毫克/毫升贮备液的博莱霉素族抗生素。
   注意：为了尽量减少基于车辆的潜在毒性作用，尤其是当使用有机溶剂的化学除了作为车辆，它是建议的库存浓度所需的应用程序后的浓度至少为1,000倍。
2. 加入准备好的化学股票直接的细胞。在这个例子中，剂量抗生素的利息，终浓度分别为100，200，300，和400微克/毫升的三折扇井。保留三口井的未经处理的细胞作为对照。
   注意：应选择的目标化学品的最终浓度，根据具体的实验目标。广泛的浓度通常是测试，获得全方位的毒副作用。

3。成像和数据分析

1. 紧随化学此外，适当的仪表板在成像室，图像采集和生物发光测量。
2. 每隔15分钟测量生物发光在24小时内用10分钟积分时间为每个阅读。
   注意：在这个例子中使用的积分时间是在每个板的基础上，可以调整用于测量每个孔的基础上使用等光度计给出。也可以调整积分时间可以根据所选择的生物发光细胞系。由于生物发光自主生产的无细胞的破坏或任何外部的刺激，阅读的INGS可以采取任何所需的时间点，以达到具体的实验目标。
3. 定量的生物发光强度从每口井通过吞吐量的区域感兴趣的使用兼容的软件。无论是作为显示输出的光的总光通量（光子/秒）或每个样品的平均辐射（光子/秒/厘米² / steridian）。

结果

在这项研究中，的动态autobioluminescent HEK293细胞抗生素暴露（ 图1），在24小时内连续监测。这种抗生素的毒性作用，这是一种已知的杀死活细胞通过结合和裂解DNA ¹³的博莱霉素家族的成员，与未经处理的细胞相比，通过减少在生物发光生产，它可以直接通过伪彩色图像可视化进行了论证（ 图2）。这些细胞中，在不同的处理条件下，允许样品的反复平行筛选的的性...

讨论

这种方法演示了如何使用自主生物发光的哺乳动物细胞， 在体外细胞毒性筛选试验，使活细胞进行连续监测，对他们的一生。此协议是灵活的，并且可以被修改，以满足特定的实验条件下，根据需要。例如，这里提出的实验适合用于跟踪急性毒性作用，但可适应评估通过反复成像在增加的时间间隔（ 例如每24个小时），并维持在标准培养条件下的细胞之间的缓慢作用的或长期的影响...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062