JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

اثنين من التقنيات لعزل قطرات الدهون الخلوية من 1) خلايا الخميرة و 2) يتم عرض مشيمة الآدمي. محور كل الإجراءات هو كثافة الطرد المركزي التدرج، حيث طبقة عائمة الناتجة تحتوي على قطرات يمكن تصور بسهولة بالعين، المستخرج، وكميا عن طريق تحليل لطخة غربية للنقاء.

Abstract

قطرات الدهون هي العضيات الحيوية التي يمكن العثور عليها في معظم الخلايا بدائية النواة حقيقية النواة وبعض. هيكليا، تتكون قطرات من مجموعة أساسية من الدهون محايدة محاطة أحادي الطبقة فوسفورية. كان واحدا من أكثر التقنيات المفيدة في تحديد أدوار الخلوية من قطرات تحديد البروتين من البروتينات ملزمة، والتي يمكن أن تكون معزولة جنبا إلى جنب مع قطرات. هنا، يتم وصف طريقتين لعزل قطرات الدهون والبروتينات الخاصة بهم المنضم من اثنين واسعة النطاق حقيقيات النوى: الخميرة الانشطار وخلايا المشيمة الزغابي الإنسان. على الرغم من كل التقنيات لديها خلافات، والأسلوب الرئيسي - يتم مشاركتها من قبل كل من الاستعدادات - التدرج الكثافة الطرد المركزي. وهذا يدل على تطبيق واسع من تقنيات العزل الحبرية المقدمة.

في البروتوكول الأول، يتم تحويل خلايا الخميرة في spheroplasts بواسطة الهضم الأنزيمي من جدران الخلايا الخاصة بهم. وspheroplasts الناتجة ثم يتم جنتلاي هي lysed في الخالط فضفاضة. يضاف إلى Ficoll المحللة لتوفير التدرج الكثافة، ويتم طرد الخليط ثلاث مرات. بعد تدور الأولى، يتم ترجمة قطرات الدهون إلى طبقة العائمة بيضاء اللون من أنابيب الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع الشبكة الإندوبلازمية (ER)، غشاء البلازما، والفجوات. وتستخدم اثنين من يدور لاحقة لإزالة هذه العضيات الثلاثة الأخرى. والنتيجة هي الطبقة التي ليس لديها سوى قطرات والبروتينات ملزمة.

في البروتوكول الثاني، يتم عزل الخلايا المشيمة الزغابي من مشيمة الإنسان على المدى بواسطة الهضم الأنزيمي مع التربسين والدناز أولا والمتجانس الخلايا في الخالط فضفاضة. تستخدم السرعة المنخفضة والمتوسطة السرعة الطرد المركزي خطوات لإزالة الخلايا غير منقطعة، والحطام الخلوية، نوى، والميتوكوندريا. يضاف السكروز إلى جناسة لتوفير التدرج الكثافة ويتم طرد الخليط لفصل قطرات الدهون من cellula أخرىالكسور ص.

يتم تأكيد نقاء قطرات الدهون في كلا البروتوكولين من خلال تحليل لطخة غربية. الكسور قطرات من كلا محضرات هي مناسبة لاحقة تحليل البروتين وlipidomic.

Introduction

قطرات الدهون الخلوية هي العضيات الحيوية التي تخدم وظائف متعددة في الخلايا. فهي محاور لتخزين الدهون المحايدة، والتي يمكن تحويلها إلى طاقة أو تستخدم لتخليق فوسفورية. قطرات تلعب دورا محوريا في الظروف الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك تصلب الشرايين، والسمنة والأمراض الاستقلابية ذات الصلة، وكذلك الأمراض المعدية 1،2. بالإضافة إلى ذلك، فهي مصادر فضول للوقود وقود الديزل الحيوي.

لقد تم الحصول على الكثير من المعلومات حول أدوار الخلوية من قطرات الدهون من تحليل البروتين وlipidomic من قطرات تنقيته من الكائنات الحية واسعة النطاق 3. وقد شملت هذه الكائنات البكتيريا 4،5، الخميرة 6-11، والنباتات 12،13 والديدان الخيطية 14، 15،16 والذباب. نظرا للاهتمام في دور قطرات الدهون في الأمراض الاستقلابية الإنسان، كما تم عزل قطرات من الخلايا الحيوانية مثقف ونيمال الأنسجة. وشملت خطوط خلايا مستنبتة الخلايا الشحمية 3T3-L1 17، الهامستر الصيني المبيض (شو) الخلايا K2 18، 19،20 hepatocyes الإنسان، وخطوط الخلايا الظهارية 21. وشملت الأنسجة الحيوانية التي تم عزلها قطرات الماوس الهيكل العظمي العضلات 22، 23 الكبد، والغدد الثديية 23. كما ذكر أعلاه، فإن الهدف من معظم الدراسات الحبرية العزلة هو إجراء تحليل البروتين على عوامل مقيدة وتحليل lipidomic على الحياد والدهون الفوسفاتية.

منذ الدهون محايدة - المكون الأكثر عددا من قطرات الدهون - أقل كثافة من معظم المواد الخلوية الأخرى، وقد جرت العادة على إجراء عزل قطرات باستخدام التدرج الكثافة الطرد المركزي. هذا الأسلوب هو محور كل من محضرات المقدمة هنا. التقنيات السابقة 6،24 يتم الجمع بين وتعديلها في عرض تقديمي مرئي للعزل قطرات من خلايا الخميرة الانشطار مثقفوالخلايا البشرية noncultured تم الحصول عليها من أنسجة المشيمة. والهدف هو إظهار تطبيق واسعة من هذه التقنية عن طريق اختيار اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا واسع نظرا نقاط البدء لعزل الحبرية. وينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيدا لأولئك الذين يرغبون في عزل قطرات من معظم الكائنات الحية.

بروتوكول 1 يصف عزل قطرات الدهون من الخميرة الانشطار، السكيراء pombe، التي استخدمت كنموذج لمراقبة تشكيل الحبرية خلال انقسام الخلايا حقيقية النواة 25. تم استخدام الخميرة في مهدها خميرة الخباز على نطاق واسع باعتبارها النموذج الحي لدراسة الدهون الحبرية علم الأحياء. بروتوكول 1 ينطبق على كل الكائنات الحية والاختلافات في الاستعدادات وتسليط الضوء عليها.

بروتوكول 2 يصف عزل قطرات الدهون من خلايا المشيمة الزغابي، والتي هي بدورها حصلت عليها من مشيمة الإنسان الأجل. المجموعة من مشيمة الأجل يوفر فرصة فريدة بأمان وأخلاقيا للحصول على 200-250 غرام من الأنسجة البشرية المتاحة بسهولة 26، والذي يحتوي على أعداد كبيرة من قطرات الدهون. هذا هو على النقيض من معظم أعمال الدهون الحبرية العزلة في حقيقيات النوى أعلى حيث تنشأ قطرات من الخلايا المستزرعة. في تلك الدراسات، وغالبا ما يضاف الأحماض الدهنية للثقافة لتعزيز تخليق الدهون المحايدة، وبالتالي نمو قطرات. هذا هو على النقيض من العمل هنا حيث تتشكل قطرات الدهون تحت ظروف الأصلي في أنسجة المشيمة.

يتم تحديد درجات نقاء من الكسور الدهون قطيرة من خلال تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة علامة عضية. وسوف تسفر هذه البروتوكولات اثنين من الدهون الكسور الحبرية التي هي مناسبة لاحقة تحليل البروتين وlipidomic.

Protocol

1. عزل الدهن قطرات من (الانشطار) خلايا الخميرة

عزل قطرات من طراز كائن شعبية في مهدها خميرة الخباز الخميرة هو مطابق تقريبا لبروتوكول التالي 6. وقد لوحظت اختلافات في الأعمال التحضيرية.

1. تنامي خلايا الخميرة

  1. إعداد وسائل الإعلام. الجمع بين 36 غرام من مسحوق YE5S لكل لتر من DH 2 O في عبوات زجاجية أو قوارير الثقافة. وسوف تكون هناك حاجة إلى حوالي 2 لتر من وسائل الإعلام. الأوتوكلاف وسائل الإعلام في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة. السماح لوسائل الإعلام لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لS. الخباز استبدال YE5S مع YPD.
  2. وضع 10-20 مل من وسائل الإعلام YE5S تبريد إلى ثقافة قارورة 250 مل باستخدام تقنيات العقيمة. تطعيم وسائل الإعلام مع كمية صغيرة من خلايا الخميرة من لوحة آغار باستخدام عصا خشبية معقمة أو ما يعادلها. السماح للخلايا تنمو إلى الكثافة البصرية المطلوب عند 30 درجة مئوية. قياس الكثافة البصرية فيالطول الموجي من 595 نانومتر باستخدام مطياف.
  3. وضع وسائل الإعلام المتبقية في 2.8 L القوارير. استخدام ما لا يزيد عن 1 لتر من وسائل الإعلام في 2.8 L قارورة لضمان خلط الصحيح أثناء نمو الخلايا في الحاضنة تهتز. العائد النهائي من الخلايا الرطب يجب أن يكون حوالي 10 غرام لتكون قادرة على الحصول على ما يكفي من قطرات الدهون والبروتين لتحليل lipidomic.
  4. إدخال الخلايا من الخطوة 1.2 في 2.8 L قوارير لكل منها 1 لتر من وسائل الإعلام التي أعدت في الخطوة 1.1.
  5. تنمو الخلايا إلى الكثافة المطلوبة في 30 درجة مئوية.
  6. تأكد من أن الخلايا لديها قطرات الدهون. الاحتياطي 1 مل من الخلايا. قياس الكثافة الضوئية (OD) من العينة. إضافة 0.1 مل من 100 ملي الأسهم من BODIPY 493/503 في الايثانول في OD الخلايا إلى العينة. وضع 3 ميكرولتر من العينة بين شريحة زجاجية وزلة غطاء زجاجي. تصور تحت المجهر الفلورسنت مع مرشح GFP (الشكل 1A).
  7. بيليه الخلايا من الخطوة 1.5 في 4 & #176؛ C في 3،800 x ج لمدة 10 دقيقة. العمل على دفعات تبعا لقدرة أنابيب الطرد المركزي.
  8. تخلصي من وسائل الإعلام YE5S وغسل الخلايا مع عازلة من EMM + 600 ملي السوربيتول. يوفر الدعم السوربيتول الاسموزي.
  9. نقل الخلايا إلى العقيمة 50 مل أنبوب الطرد المركزي وبيليه الخلايا في 4 درجات مئوية في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف. تزن الخلايا رطبة. resuspend الخلايا في 2 مل من (EMM + 600 ملي السوربيتول) عازلة للغرام الواحد من الخلايا.

2. تحويل خلايا الخميرة الانشطار في spheroplasts وتحلل لاحقة

  1. إضافة 5 ملغ لكل 1) انزيم الخميرة التحللي و2) الخميرة lysing الانزيمات من الترايكوديرما harzianum حسب كل غرام من خلايا الرطب التي تم وزنه في الخطوة 1.9. لS. الخباز زيادة هذه الانزيمات مع نفس الكمية من Zymolyase.
  2. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية تحت لطيف تهتز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
  3. تحقق للتأكد من أن لديك spheroplasts الدكتور الدهونoplets. من خلال تكرار الخطوة 1.6 (الشكل 1B).

3. التدرج الكثافة الطرد المركزي

  1. بيليه spheroplasts بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة بعناية طاف باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
  3. resuspend بلطف spheroplasts مكعبات الثلج الباردة مع 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 600 ملي السوربيتول، و 200 ميكرومتر EDTA. نضع في اعتبارنا أن spheroplasts هشة جدا.
  4. بيليه spheroplasts مرة أخرى باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 3.1. إزالة بعناية طاف و resuspend spheroplasts باستخدام ماصة نقل البلاستيك في 12٪ Ficoll، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ميكرومتر EDTA بتركيز 2 مل / ز الخلايا.
  5. نقل spheroplasts معلق إلى الخالط الزجاج والتجانس بلطف على الجليد، 20-30 السكتات الدماغية، مع مدقة الفضفاضة من الخالط الزجاج.
  6. نقل spheroplasts هي lysed إلى أنابيب الطرد المركزي وتراكب مع نفس فولوم من 12٪ Ficoll، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ميكرومتر العازلة EDTA. اختيار عدد من أنابيب الطرد المركزي لاستخدام بحيث كل أنبوب حوالي ثلثي كامل.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 100،000 x ج لمدة 1.5 ساعة في الدوار SW28 أو ما يعادلها. تسمح الدوار إلى الساحل لوقف (الدوار التباطؤ = 0).
  8. بلطف نقل أعلى العائمة طبقة بيضاء (الشكل 2A)، والذي يحتوي على قطرات، إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة (ق) باستخدام إما pipettor أو باستور ماصة عازمة. إضافة حجم ما يكفي من 12٪ Ficoll، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ميكرومتر العازلة EDTA للعينة بحيث يملأ ما يقرب من ثلث أنبوب الطرد المركزي.
  9. إضافة حجم يعادل 8٪ Ficoll، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ميكرومتر العازلة EDTA إلى الأعلى من العينة (ق) في أنبوب الطرد المركزي الجديدة (ق). بعد إضافة هذا المخزن المؤقت يجب أن تكون الأنابيب حوالي ثلثي كامل.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 100،000 x ج لمدة 1 ساعة في الدوار SW28 أو ما يعادلها. تسمح الدوار إلى الساحل لوقف (ص أذني التباطؤ = 0).
  11. بلطف نقل أعلى العائمة طبقة بيضاء (الشكل 2B)، والتي سوف تحتوي على قطرات، إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة (ق) باستخدام إما pipettor أو باستور ماصة عازمة. إضافة 600 ملي السوربيتول، 8٪ Ficoll، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ميكرومتر العازلة EDTA للعينة بحيث يملأ حوالي ثلث من أنبوب الطرد المركزي.
  12. إضافة حجم ما يعادل 250 ملي السوربيتول، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، والعازلة 200 ميكرومتر EDTA إلى الأعلى من العينة (ق) في أنبوب الطرد المركزي الجديدة (ق). بعد إضافة هذا المخزن المؤقت يجب أن تكون الأنابيب حوالي ثلثي كامل.
  13. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 100،000 x ج لمدة 1 ساعة في الدوار SW28 أو ما يعادلها. تسمح الدوار إلى الساحل لوقف (الدوار التباطؤ = 0).
  14. نقل أعلى طبقة بيضاء (الشكل 2C)، والتي يجب أن تحتوي فقط على قطرات الدهون والبروتينات ملزمة لغسيل الكلى الأنابيب، وdialyze O / N في 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 200 ميكرومتر العازلة EDTA للقضاء على Ficoll.

الطبقة = "jove_title"> 2. عزل الدهن قطرات من خلايا المشيمة البشرية الزغابي

تم جمع مشيمة من النساء صحية مع الحمل المفرد تمر العملية القيصرية الاختيارية التسليم قبل بدء المخاض العفوي في المدى. أعطى المواضيع المكتوبة، الموافقة المسبقة لجمع المشيمة عند هؤلاء النساء. تم إجراء جمع، واستخدامه لاحقا، من مشيمة بموافقة من جامعة ولاية تينيسي وجامعة ولاية تينيسي مدرسة الدراسات العليا في الطب في نوكسفيل مجلس المراجعة المؤسسية (# 8757B و # 3338، على التوالي).

1. عزل خلايا المشيمة الزغابي الإنسان

الجزء 1 من البروتوكول هو تعديل لبروتوكول نشرت في وقت سابق من قبل بيتروف وآخرون 26

إعداد الحلول التالية:

  • كلوريد الصوديوم (1 L): حل 9 ز كلوريد الصوديوم (M 58.4 جم / مول) في DH 2 O لتسفر عن حل 1 L. فلتر تعقيم (0.2؛ ميكرومتر غشاء).
  • محلول ملحي متوازن 10X هانك (10X HBSS) (1 L): 4 ز بوكل (M 74.5 جم / مول)؛ 0.6 غ KH 2 PO 4 (M 136،086 غ / مول)، و 80 غرام كلوريد الصوديوم (M 58.44 جم / مول)؛ نا 2 هبو 4 (M 141.96 جم / مول)، و 10 غ مد الجلوكوز (M 180.16 جم / مول). حل لكل من المكونات في DH 2 O لتسفر عن حل 1 L. فلتر تعقيم (0.2 ميكرومتر غشاء).
  • انزيم الهضم العازلة (0.6 مل): الجمع بين 70 مل 10X HBSS مع 3.3 مل 7.5٪ نا Biscarbonate، 17.5 مل 1 M HEPES، و266.1 مل درهم 2 O؛ تعقيم فلتر (0.2 ميكرومتر غشاء). تخزين عند 4 درجات مئوية.
  • الدناز الأول: فقط قبل الاستخدام، إضافة 5 مل العقيمة كلوريد الصوديوم 0.9٪ إلى قارورة من الدناز. الحفاظ على الجليد حتى استخدامها أو تخزينها في -20 درجة مئوية.
  1. إعداد المشيمة للتشريح
    1. الحصول على المشيمة البشرية وعملية أقرب إلى وقت التسليم وقت ممكن. استخدام وعاء مختوم مثل برودة لنقل المشيمة. دائما استخدام الحذر عند اليدلينغ المواد البيولوجية البشرية.
    2. في هود السلامة البيولوجية، ونقل المشيمة إلى حاوية autoclavable معقمة، وغسل الدم من المشيمة بعناية والأغشية باستخدام معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة) حل. تجاهل المالحة الدامية في دورق 1 لتر كما النفايات البيولوجية السائلة.
    3. وضع المشيمة في حقل معقمة، مع سطح أملس تحمل الحبل السري مواجهة. مع حادة، ومقص غرامة نقطة وملقط إزالة الأغشية الجنينية والحبل السري.
    4. الوجه المشيمة أكثر من ذلك أن سطح الأمهات (سطح خشن) ومواجهة. إزالة الأنسجة المغطي لوحة القاعدية، حوالي 3 ملم من السطح.
  2. تشريح المشيمة
    1. تشريح فلقة واحدة في وقت وتجنب لوحة المشيمي. جمع الأنسجة الزغابي في كوب 250 مل مع المياه المالحة.
    2. شطف الأنسجة عدة مرات في كوب منفصلة مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم بواسطة يحوم بالملقط، وذلك باستخدام 1 لتر كوب للنفايات السائلة.
    3. نقل فلقة واحدة في وقت واحد إلى 150 ملم طبق بيتري. عقد مع ملقط وكشط الأنسجة مع شفرة حلاقة من السفن على طبق بيتري. وضع الأنسجة كشط في كوب منفصلة تحتوي على 0.9٪ كلوريد الصوديوم. أكرر لجميع قطع الأنسجة.
    4. نقل جزء صغير من الأنسجة إلى غربال تفارق الخلية وشطف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم على نطاق واسع حتى يصبح شطافة واضحة. أكرر لجميع الأنسجة.
    5. بعد الشطف الأنسجة كشط في غربال تفارق الخلية، وصرفها من السائل الزائد والوزن.
      عند هذه النقطة الأنسجة قد يتم تخزين O / N في دورق مخروطي سعة العقيمة في 4 درجات مئوية في DMEM.
  3. الهضم الأنزيمية للأنسجة المشيمة
    1. تحضير الأنسجة خليط الهضم: 100 مل من prewarmed العازلة انزيم التخفيف، 1 مل الدناز الأول و20 مل 10X 2.5٪ التربسين.
    2. تقسيم الأنسجة، ونقل 60 غ من مجموع الأنسجة التي تم جمعها (عادة حوالي 250-300 ز) إلى 500 مل دورق مخروطي سعة العقيمة.
      3. إضافة الأنسجة خليط الهضم إلى دورق مخروطي يحتوي على الأنسجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر لمدة 45 دقيقة في 150 دورة في الدقيقة.
  4. جمع الخلايا نأت
    1. بعد أول 45 دقيقة التفكك، تعيين قارورة الهضم في الميل حتى يستقر الأنسجة.
    2. جمع طاف، مع الحرص على عدم جمع الأنسجة undissociated. إضافة مبلغ مساو من HBSS لطاف جمع ونقل إلى أنابيب معقمة 15 مل الطرد المركزي. لأجزاء إضافية من الأنسجة undissociated، كرر الإجراء بدءا من الخطوة 3.2 مع الأنسجة undissociated.
    3. أجهزة الطرد المركزي لجناسة في 4 درجات مئوية في 1000 x ج لمدة 15 دقيقة.
    4. لكل دفعة، وبعد الطرد المركزي، ونضح طاف دون الإخلال بيليه. خلايا المشيمة الزغابي في الغالب في الجزء الأبيض من بيليه، تغمر خلايا الدم الحمراء.
    5. نقل الخلايا الزغابي (الجزء الأبيض من بيليه) إلى شارعerile 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي والحفاظ على الجليد.
    6. بعد جمع الخلايا من جميع مراحل عملية الهضم الثلاثة، تحديد التعليق باستخدام 100 ميكرومتر مصفاة الخلية نايلون إدراجها في الجزء العلوي من 50 مل العقيمة المخروطية أنبوب الطرد المركزي. إذا كان الترشيح لتعليق الخلية يبطئ، ورفع التصاعدي على مرشح لرسم الفراغ داخل الأنبوب.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه.

2. المجانسة خلايا المشيمة الزغابي

  1. قبل البدء في عملية العزل، وإعداد 50 مل من تحلل منخفض التوتر متوسطة (HLM) تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 و 1 ملي EDTA. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني لHLM فقط قبل الاستخدام والحفاظ على المتوسط ​​على الجليد.
  2. في هود السلامة البيولوجية، إضافة 4 أضعاف حجم بيليه خلية من HLM الجليد الباردة إلى الخلايا. بلطف وبدقة resuspend الخلايا بواسطة pipetting الخلايا يصل إلىد إلى أسفل باستخدام ماصة 10 مل.
  3. احتضان الخلايا علقت على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  4. نقل الخلايا إلى الخالط Dounce، التي ينبغي أن تكون على الجليد. التجانس ببطء الخلايا من خلال تطبيق 20-25 السكتات الدماغية لطيف مع مدقة فضفاضة من الخالط.
  5. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 4 درجات مئوية في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الخلايا غير منقطعة، والحطام الخلوي والنواة.
  6. جمع طاف ونقل إلى أنبوب SW28 (أو البديلة التي يمكن طرد في 25،000 x ج). أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 25،000 x ج لمدة 20 دقيقة لإزالة الميتوكوندريا.

3. عزل قطرات الدهون بواسطة تنبيذ فائق

  1. إعداد 50 مل من 100 ملي كربونات الصوديوم (M 106 جم / مول) العازلة (درجة الحموضة 11.5) و 50 مل من 60٪ سكروز (ث / ث) الحل. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إلى المخزن المؤقت كربونات الصوديوم فقط قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد.
  2. جمع طاف من الخطوة 2.6 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وضبطإلى 20٪ من السكروز ونقل في الجزء السفلي من أنبوب نابذة فائقة السرعة لSW28 الدوار، أو ما يعادلها. طاف الكثافة تراكب تعديلها مع ~ 10 مل من العازلة كربونات الصوديوم 100 ملي الجليد الباردة (درجة الحموضة 11.5) و0.5-1 مل من الجليد الباردة HLM لملء الأنبوب.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 130،000 x ج لمدة 45 دقيقة باستخدام SW28 الدلو المتأرجح الدوار. تسمح الدوار إلى الساحل لوقف (الدوار التباطؤ = 0).
  4. جمع طبقة عائمة، وضبط إلى 10٪ سكروز ونقل إلى الجزء السفلي من 13.2 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة لSW41Ti الدوار، أو ما يعادلها. الكثافة تراكب تعديل طاف مع حوالي 5 مل من العازلة 100 ملي كربونات الصوديوم الجليد الباردة (درجة الحموضة 11.5) و 0.5 مل من الجليد الباردة HLM.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 274،000 x ج لمدة 60 دقيقة باستخدام SW41Ti يتأرجح دلو الدوار. تسمح الدوار إلى الساحل لوقف (الدوار التباطؤ = 0) للحد من اختلال طبقة الدهون الحبرية.
  6. جمع بعناية أعلى طبقة العائمة (الشكل 2D) التي تحتوي علىقطرات الدهون مع ماصة 1 مل وكرر الخطوة 3.4.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 274،000 x ج لمدة 30 دقيقة باستخدام SW41Ti يتأرجح دلو الدوار. تسمح الدوار إلى الساحل لوقف (الدوار التباطؤ = 0).
  8. جمع بعناية بيضاء بلون الطبقة العليا العائمة التي تحتوي على قطرات الدهون مع ماصة باستور عازمة إلى ثلاثة أنابيب 1.5 مل تحتوي على 100 ميكرولتر HLM.

قطرات الدهون التي تميز الكسر (البروتوكولات 1 و 2)

يمكن التحقق من الانتعاش والنقاء من الكسر القطيرات الدهنية بواسطة لطخة غربية مجتمعة مع ضوء أو المجهر الإلكتروني. بالإضافة إلى ذلك، مأخوذة بعد خطوات الطرد المركزي مختلفة يمكن جمعها والاحتفاظ بها لتحديد كفاءة التنقية. في الغربية التنشيف، فمن أكثر ملاءمة لمقارنة حجم القطيرات الدهنية جزء الذي يمثل يعادل المحللة خلية كاملة من مقارنة قطرات الدهون في غشاء الكسور الأخرى على رانه أساس مجموع محتوى البروتين 24.

النتائج

إذا عملت التدرج الكثافة الطرد المركزي كما هو متوقع، يجب أن يحتوي على طبقة العائمة قطرات الدهون وتستنفد من العضيات الأخرى في جميع أنحاء تطور يدور عالية السرعة.

لبروتوكول 1، أجريت البقع الغربية مع الأجسام المضادة علامة لقطرات الده...

Discussion

خطوات حاسمة في هذا البروتوكول

تأكد من أن تكون متسقة مع وسائل الاعلام وكثافة الخلايا أثناء نمو الخلايا المستزرعة. قطرات الدهون الخلوية هي فريدة من نوعها في أن البروتينات المرتبطة بها تعتمد اعتمادا كبيرا على ...

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل على جائزة جمعية القلب الأمريكية 13SDG14500046 لPD، والتعليم والطاقة المستدامة بحوث جائزة مركز (جامعة تينيسي) إلى PD، والتعليم الطبي والأطباء ومؤسسة أبحاث (جامعة تينيسي) الجائزة إلى JM و الكتاب أشكر كارولين Leplante (ييل جامعة.) لبروتوكول لتحويل الانشطار الخميرة لspheroplasts؛ اريك T. بودر (جامعة تينيسي) لاستخدام له حاضنات الهز، منضدية أجهزة الطرد المركزي، والبقعة الغربية المعدات التحليل؛ ومركز ل التكنولوجيا الحيوية البيئية (جامعة تينيسي) لاستخدام أجهزة الطرد المركزي الخاصة بهم، فائقة؛ غونتر داوم عن الأجسام المضادة الخميرة (غراتس جامعة للتكنولوجيا، النمسا)؛ موظفي قسم التوليد وأمراض النساء (مركز Univ. تينيسي الطبية) لتقديم المساعدة التقنية .

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Protocol 1
1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts
Edinburgh Minimal Media (EMM)Sunrise Science Products2005
Yeast extract with 5 supplements (YE5S)Sunrise Science Products2011YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.
YPD powderSunrise Science Products1875For S. cerevisiae
SorbitolFisher ScientificBP439
Yeast Lytic EnzymeMP Biomedicals215352610
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianumSigma-AldrichL1412
Zymolayse-20TSunrise Science ProductsN0766391For S. cerevisiae
BODIPY 493/503InvitrogenD-3922
Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7
Microscope Cover GlassFisher Scientific12-542-B
Plastic transfer pipetteFisher Scientific137115AM
1 L glass bottle
250 ml flask
2.8 L flasks
2. Yeast lipid droplet isolation
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
Ficoll 400Fisher ScientificBP525
12-14k Spectra/Por Dialysis MembraneSpectrumLabs132680
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche Diagnostics11873580001irritant
Dounce Homogenizer Sigma-AldrichD9938
Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28)Beckman-Coulter355642
12-14k Spectra/Por Dialysis MembraneSpectrumLabs132680
Temperature-controlled shakerNew Brunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifugeThermo-Scientific75004521
Swinging Bucket Centrifuge RotorThermo-Scientific75003607
Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle RotorThermo-Scientific75003698
Ultracentrifuge LB-MBeckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge RotorBeckman-Coulter342204
Protocol 2
1. Placental villous cells isolation
Disposable underpadsFisher Scientific23666062
Autoclavable pan (container), 3 LFisher Scientific1336110
Fine scissors, sharp-sharp, straightFine Science Tools1406011
London ForcepsFine Science Tools1108002
Dumont #7b ForcepsFine Science Tools1127020
Razor bladesFisher ScientificS65921
Screen cup for CD-1Fisher ScientificS1145
40 mesh screen Fisher ScientificS0770
Fisherbrand cell stainers 100 μmFisher Scientific22363549
150 mm Petri DishesFisher ScientificNC9054771
NaClFisher ScientificS642
KClFisher ScientificP333
KH2PO4Fisher ScientificP386
Na2HPO4Fisher ScientificS374
D-GlucoseFisher ScientificD16
HEPESFisher ScientificBP310
2.5% Trypsin 10xInvitrogen15090046
DNase I grade II, from bovine pancreasRoche Applied Science10104159001
Sodium bicarbonate solutionSigma-AldrichS8761
500 ml Erlenmeyer flasks
250 ml Beakers
15 ml Centrifuge tubes
10 ml Serological pipettes
50 ml Centrifuge tubes
DMEMInvitrogen11965084
2. Lipid droplets isolation from villous placental cells
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
D-SucroseFisher ScientificBP220
Sodium Carbonate Fisher ScientificBP357
EDTA-free protease inhibitor cocktail tabletsRoche Diagnostics11873580001irritant
Dounce homogenizer Sigma-AldrichD9938
Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28)Beckman-Coulter355642
Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41)Beckman-Coulter344059
Disposable borosilicate glass Pasteur pipetsFisher Scientific1367820C
Biological safety hood Thermo-Scientific
WaterbathFisher Scientific
Temperature-controlled shakerNew Brunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifugeThermo-Scientific75004521
Swinging Bucket Centrifuge RotorThermo-Scientific75003607
Ultracentrifuge LB-MBeckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge RotorBeckman-Coulter342204
SW41 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman-Coulter331336
Western blot
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR926-68071dilution 1:15,000
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR926-32210dilution 1:5,000
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gelsInvitrogenNP0341
Primary antibodies for Protocol 1
Erg6pgift from Dr. G. DaumGraz University of Technology, Austriadilution 1:5,000
Dpm1pAbcamab1136864 μg/ml
Por1pgift from Dr. G. DaumGraz University of Technology, Austriadilution 1:5,000
Pma1pgift from Dr. G. DaumGraz University of Technology, Austriadilution 1:10,000
Vma1p (anti-ATP6V1A)Abcamab1137450.5 μg/ml
Primary antibodies for Protocol 2
Perilipin 2 (anti-ADFP)Abcamab523552 μg/ml
CalnexinCell Signaling Technology2679dilution 1:1,000
GM130Biorbytorb40533dilution 1:25
COX IVCell Signaling Technology4850dilution 1:1,000
MEK1Biorbytorb38775dilution 1:50

References

  1. Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
  2. Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
  3. Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
  4. Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
  5. Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
  6. Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
  7. Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
  8. Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
  9. Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
  10. Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
  11. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
  12. Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
  13. Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
  14. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
  15. Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
  16. Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
  17. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
  18. Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
  19. Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
  20. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
  21. Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
  22. Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
  23. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
  24. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
  25. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
  26. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  27. Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
  28. Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
  29. Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
  30. Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
  31. Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
  32. Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
  33. Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
  34. Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
  35. Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
  36. Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
  37. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved